Name: microelectrode impalement method to record membrane potential from a cannulated middle cerebral artery
Uploaded: 2019-07-02T14:00:00
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Diese Arbeit wurde teilweise durch Stipendien des Intramural Support Research Program (IRSP) von UMMC, AHA Scientist Development Grant (13SDG14000006) an Mallikarjuna R. Pabbidi unterstützt.

Die männlichen Ratten wurden in der Animal Care Facility des UMMC untergebracht, die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) zugelassen ist. Die Tiere hatten während der gesamten Studie freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Die Tiere wurden in einer kontrollierten Umgebung mit einer Temperatur von 24 °C bei 2 °C, einer Luftfeuchtigkeit von 60–80 % und 12 h Licht-/Dunkelzyklen gehalten. Alle Protokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der UMMC genehmigt.
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	<li>Nelson, M. T., Quayle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+and+properties+of+potassium+channels+in+arterial+smooth+muscle.">Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle.</a> American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).</li><li>Hughes, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channels+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Calcium channels in vascular smooth muscle cells.</a> Journal of Vascular Research. 32 (6), 353-370 (1995).</li><li>Large, W. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channels,+potassium+channels,+and+voltage+dependence+of+arterial+smooth+muscle+tone.">Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone.</a> American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).</li><li>Harder, D. R., Sperelakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+induced+in+guinea+pig+arterial+smooth+muscle+by+tetraethylammonium.">Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium.</a> American Journal of Physiology. 237 (1), C75-C80 (1979).</li><li>Nystoriak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+increase+in+pressure-dependent+constriction+of+brain+parenchymal+arterioles+from+subarachnoid+hemorrhage+model+rats+due+to+membrane+depolarization.">Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).</li><li>Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+membrane+properties+in+vascular+muscle+cells+from+various+vascular+beds.">Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds.</a> Federation Proceedings. 42 (2), 253-256 (1983).</li><li>Cogolludo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+inhibits+voltage-gated+K++currents+in+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells:+role+of+5-HT2A+receptors,+caveolin-1,+and+KV1.5+channel+internalization.">Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization.</a> Circulation Research. 98 (7), 931-938 (2006).</li><li>Ganitkevich, V., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+modulates+inositol+1,4,5-trisphosphate-mediated+Ca2++transients+in+guinea-pig+coronary+myocytes.">Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes.</a> Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).</li><li>Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K++channel+openers,+cromakalim+and+Ki4032,+inhibit+agonist-induced+Ca2++release+in+canine+coronary+artery.">K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 346 (6), 691-700 (1992).</li><li>Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRL+38227+(levcromakalim)-induced+hyperpolarization+reduces+the+sensitivity+to+Ca2++of+contractile+elements+in+caninse+coronary+artery.">BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 347 (4), 438-444 (1993).</li><li>Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+of+the+conducted+electrical+response+in+arterioles+of+hamster+cheek+pouch+in+vitro.">Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro.</a> American Journal of Physiology. 269 (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).</li><li>Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks+in+smooth+muscle.">Calcium sparks in smooth muscle.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 278 (2), C235-C256 (2000).</li></ol>

Dieser Artikel enthält die notwendigen Schritte, wie eine scharfe Mikroelektroden-Impalement-Methode verwendet werden kann, um Vm aus einer kanülierten Gefäßzubereitung aufzuzeichnen. Diese Methode ist weit verbreitet und bietet qualitativ hochwertige, konsistente Aufnahmen von Vm, die eine Vielzahl von experimentellen Fragen beantworten.
Einige kritische Überlegungen und Schritte zur Fehlerbehebung werden hier beschrieben, um den Erfolg der Methode sicherzustellen. ...

Das Membranpotential (Vm) einer Zelle bezieht sich auf den relativen Unterschied der ionischen Ladung über die Plasmamembran und die relative Durchlässigkeit der Membran zu diesen Ionen. Der Vm wird durch die Differenzverteilung der Ionen erzeugt und durch Ionenkanäle und Pumpen aufrechterhalten. Ionenkanäle wie K+, Na+, und Cl- tragen wesentlich zum ruhenden Vmbei. Vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) exprimieren mehr als vier verschiedene Arten von K+ Kanäle1, zwei Arten von spannungsgegated Ca2+ Kanälen (VGCC)2, mehr als zwei Arten von Cl - Kanäle3, 4 , 5, speicherbetriebene Ca2+ Kanäle6, Stretch-aktivierte Kationenkanäle7,8und elektrogene Natrium-Kalium-ATPase-Pumpen9 in ihren Plasmamembranen, die alle an der Regulierung von Vmbeteiligt sind.
Der Vm von VSMCs hängt vom Lumendruck ab. In nicht unter Druck stehenden Gefäßen variiert Vm von -50 bis -65 mV, in Druckarteriensegmenten reicht Vm jedoch von -37 bis -47 mV10. Die Erhöhung des intravaskulären Drucks bewirkt, dass VSMCs11depolarisieren, den Schwellenwert für die VGCC-Öffnung verringern und den Kalziumzufluss erhöhen, der zur Entwicklung des myogenen Tonsbeiträgt 12. Im Gegenteil, in passiven oder nicht unter Druck stehenden Gefäßen wird die Membranhyperpolarisation aufgrund der hohen K +-Kanalaktivität verhindern, dass sich VGCC öffnet, was zu einem begrenzten Kalziumeintrag und einer Abnahme des intrazellulären Kalziums führt, was zu weniger Gefäßton13. Somit scheint Vm aufgrund von Veränderungen des Lumendrucks eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung des Gefäßtonons zu spielen, und sowohl VGCC- als auch K +-Kanäle spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Vm.
Vm variiert je nach Schiffstyp und Art. Vm ist -54 x 1,3 mV in Meerschweinchen überlegene meenterische arterielle Streifen14, -45 x 1 mV in den mittleren Hirnarterien der Ratte bei 60 mmHg Lumendruck12, und -35 x 1 mV in Rattenparenchymalarterien bei 40 mmHg Lumendruck15. Der ruhende Vm, der im ungestreckten Lymphmuskel der Ratte aufgezeichnet wird, beträgt -48 x 2 mV16. Vm zerebraler VSMCs ist negativer als in peripheren Arterien. Im Vergleich dazu wurden feline mittlere Hirnarterien mit einem Vm von etwa -70 mV berichtet, während mesentäre und koronare Arterien mit -49 bzw. -58 mV bzw.17,18berichtet enden. Unterschiede im Vm über Gefäßbetten können die Unterschiede in der Expression und Funktion von Ionenkanälen und elektrogenen Natrium-Kaliumpumpen widerspiegeln.
Erhöhungen und Abnahmen von Vm werden als Membrandepolarisation bzw. Hyperpolarisation bezeichnet. Diese Veränderungen in Vm spielen eine zentrale Rolle in vielen physiologischen Prozessen, einschließlich Ionenkanalgating, Zellsignalisierung, Muskelkontraktion, und Aktion potenzielle Ausbreitung. Bei einem festen Druck verursachen viele endogene und synthetische Vasodilatatorverbindungen, die K+ Kanäle aktivieren, eine Membranhyperpolarisation, was zu Einer Vasodilatation1,13führt. Umgekehrt ist eine nachhaltige Membrandepolarisation bei agonistisch-induzierter oder rezeptorvermittelter Vasokonstriktion19von entscheidender Bedeutung. Vm ist eine kritische Variable, die nicht nur den Zustrom von Ca2+ durch VGCC13 reguliert, sondern auch die Freisetzung von Ca2+ aus den internen Lagern20,21 und Ca2+-Empfindlichkeit von die kontraktive Vorrichtung22.
Zwar gibt es mehrere Methoden zur Erfassung von Vm aus verschiedenen Zelltypen, aber die Daten, die aus der Mikroelektroden-Imprägemethode von kanülierten Gefäßen gesammelt wurden, scheinen physiologischer zu sein als Daten, die von isolierten VSMCs gewonnen wurden. Bei aufnahme von isoliertem VSMC mit aktuellen Klemmmethoden wird Vm als spontane transiente Hyperpolarisation in VSMCs24angesehen. Isolierte VSMCs befinden sich nicht im Syncytium, und die Änderungen im Serienwiderstand können zum Oszillatorverhalten von Vmbeitragen. Andererseits wird das Oszillationsverhalten nicht beobachtet, wenn Vm von intakten Gefäßen aufgezeichnet wird, wahrscheinlich aufgrund des Zell-Zell-Kontakts zwischen VSMCs, die sich in der Arterie im Syncytium befinden und im gesamten Gefäß summiert werden, was zu einem stabilen Vm führt. 24. Somit ist die Messung von Vm von Druckgefäßen mit Standard-Mikroelektroden-Impalement-Technik relativ nahe an den physiologischen Bedingungen.
Die Aufnahme von Vm von kanülierten Gefäßen könnte wichtige Informationen liefern, da Vm von VSMCs, die in Syncytium sind, eine der wichtigsten Determinanten des Gefäßtons und des Blutflusses ist und die Modulation des Vm eine Möglichkeit bieten könnte, Verengung der Blutgefäße. Daher ist es wichtig, die Methodik zu verstehen, die bei der Erfassung von Vmerforderlich ist. Dieser Artikel beschreibt die intrazelluläre Aufzeichnung von Vm aus kanülierten mittleren Hirnarterien (MCAs) mit einer Mikroelektroden-Impalement-Methode. Dieses Protokoll beschreibt, wie McAs, Mikroelektroden, die Einrichtung des Elektrometers und die Impalement-Methode zur Aufzeichnung von Vmdurchgeführt werden. Darüber hinaus werden repräsentative Daten, häufige Probleme, die bei der Verwendung dieser Methode aufgetreten sind, und potenzielle Probleme diskutiert.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissection instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aneshetic Vaporiser</td>
			<td>Parkland scientific</td>
			<td>V3000PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc., NY</td>
			<td>Eclipse Ti-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kleine Guillotine Type 7575</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA</td>
			<td>73-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Littauer Bone Cutter</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>16152-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria MC40 Ultra Fine Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-3287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device camera</td>
			<td>Qimaging, , BC</td>
			<td>Retiga 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential electrometer amplifier</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FD223A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line pressure transducer</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA</td>
			<td>MA1 72-4496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>PCS-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrodes</td>
			<td>Warner Instruments LLC, CT</td>
			<td>G200-6,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Fil (Microfiber syringe)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MEH1SF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myograph</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, VT</td>
			<td>CH-1-SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>Sutter Instrument, San Rafael, CA</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration-free table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>3435-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex 10</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p Clamp 10</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Nikon, NY</td>
			<td>NIS-elements</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microelectrode impalement method to record membrane potential from a cannulated middle cerebral artery

Membranpotential (Vm) von vaskulären glatten Muskelzellen bestimmt den Gefäßtonund und damit den Blutfluss zu einem Organ. Veränderungen in der Expression und Funktion von Ionenkanälen und elektrogenen Pumpen, die Vm bei Krankheitszuständen regulieren, könnten möglicherweise Vm,Gefäßtonus und Blutfluss verändern. Daher sind ein grundlegendes Verständnis der Elektrophysiologie und die Methoden, die notwendig sind, um Vm in gesunden und kranken Zuständen genau aufzuzeichnen, unerlässlich. Diese Methode ermöglicht die Modulation von Vm mit verschiedenen pharmakologischen Mitteln zur Wiederherstellung von Vm. Obwohl es mehrere Methoden gibt, jede mit ihren Vor- und Nachteilen, bietet dieser Artikel Protokolle zur Aufzeichnung von Vm aus kanülierten Widerstandsgefäßen wie der mittleren Zerebralparese mit der Mikroelektroden-Impalement-Methode. Mittlere Hirnarterien dürfen in einer Myographenkammer myogenen Ton erhalten, und die Gefäßwand wird mit hochwiderstandsstarken Mikroelektroden aufgespießt. Das V m-Signal wird über ein Elektrometer erfasst, digitalisiert und analysiert. Diese Methode ermöglicht ein genaues Ablesen des Vm einer Gefäßwand, ohne die Zellen zu beschädigen und ohne den Membranwiderstand zu verändern.

Die vorgestellte Methode kann zuverlässig zur Aufzeichnung von Vm in kanülierten Gefäßen eingesetzt werden. Eine kurze Prozedur, die beschreibt, wie MCA aus dem Gehirn isoliert werden kann, ist in Abbildung 1Adargestellt. Nach der Trennung des Gehirns vom Schädel wurde das MCA seziert und in eine Petrischale mit niedrigem Kalzium-PSS gelegt. Ein Teil des anhaftenden Bindegewebes wurde zusammen mit MCA mit Federschere und Zange seziert, um eine...

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Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery

Das primäre Ziel dieses Artikels ist es, Details darüber zu liefern, wie Membranpotenzial (Vm) aus der mittleren Zerebrale mit der Mikroelektroden-Impalement-Methode aufzuzeichnen ist. Die kanülierte mittlere Hirnarterie wird ausgeglichen, um myogenen Ton zu erhalten, und die Gefäßwand wird mit hochwiderstandigen Mikroelektroden aufgespießt.

Mikroelektroden-Impalement-Methode zur Aufzeichnung des Membranpotenzials aus einer kantigen mittleren Zerebralparese

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um das Membranpotenzial normaler und kranker Blutgefäße zu messen und pharmakologische Wirkstoffe zu bewerten, die das Membranpotenzial, den Gefäßton ustonieren und den Blutfluss modulieren. Die aus dieser Technik erzeugten Membranpotentiale liegen nahe am physiologischen Bereich, da sich die geglätteten Gefäßmuskeln in einem Synzytium befinden. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, platzieren Sie einen Zweikanal-Differentialelektrometerverstärker in der Nähe der Gefäßkammer an der gewünschten Stelle.Verwenden Sie ein BNC-BNC-Kabel, um den Ausgang des Verstärkerkanals A oder B mit dem Kanaleingang des Digitizers zu verbinden. Montieren Sie die Sonde im Mikromanipulator, und drehen Sie den Mikromanipulator in Richtung Mikroskop und Myograph auf einem vibrationsfreien Tisch. Platzieren Sie die Knöpfe und Schalter an der Vorderseite des Verstärkers in den entsprechenden Positionen für das Experiment, wie im Handbuch beschrieben.Schließen Sie dann den Badegrund mit einer geeigneten Elektrode an den Schaltboden des Verstärkers an und stellen Sie sicher, dass der Käfig an das Gehäuse des Verstärkers geerdet ist. Um die Borosilikatglas-Mikroelektroden vorzubereiten, verwenden Sie einen Standard-Zieher, um eine kurze, allmähliche, acht- bis 10-Millimeter-Verjüngung mit einem Durchmesser von weniger als einem Mikrometer zu erreichen, die zweimal für höhere Widerstände und kleinere Spitzen schleift. Verwenden Sie eine Mikrofaserspritze, um die Mikroelektrode mit dreimolarem Kaliumchlorid zu füllen, wobei der Kolben während der Injektion langsam zurückgezogen wird, um Platz für die Flüssigkeit zu geben und die Bildung von Blasen innerhalb der Mikroelektrode zu verhindern.Legen Sie die voll belastete Mikroelektrode auf den Mikroelektrodenhalter und drücken Sie den Elektrodenschaft vorsichtig, aber fest durch das Bohrloch in den Halter. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem Laborgewebe, und schließen Sie die Elektrodenhalterbaugruppe an die Verstärkersonde an. Führen Sie einen Elektrodentest durch, um den Elektrodenwiderstand zu messen.Öffnen Sie dann die Aufnahmesoftware, weisen Sie der Datei einen Namen zu, und speichern Sie die Datei für die zukünftige Analyse. Als nächstes spülen Sie die Myographenkammer mehrmals mit destilliertem Wasser ab, bevor Sie die Kammer mit fünf Millilitern normaler physiologischer Salzlösung oder PSS beladen. Füllen Sie mit einer Fünf- oder 10-Milliliter-Spritze sowohl Glaskanülen als auch die angeschlossenen Schläuche mit gefiltertem normalen PSS, ohne Luftblasen einzuführen, und verwenden Sie stumpfe Zangen, um einen halben Knoten in zwei 10-0 Monofilament Nylon-Nähten herzustellen.Dann, mit Sezierzangen unter einem Seziermikroskop, legen Sie die teilweise geschlossenen Nahtknoten auf beiden Kanülen leicht weg von den Spitzen. Für die mittlere Zerebralparese Isolation, verwenden Federschere und Zange, um zu identifizieren und zu sezieren ein unverzweigtes Segment der mittleren Zerebrale Arterie, mit einem Innendurchmesser von 100 bis 200 Mikrometer, der Ratte Gehirn. Verwenden Sie feine Zangen, um die mittlere Zerebrale arterienweise auf die Glaskanülen zu montieren, und ziehen Sie die Nähte, um die Arterie an der Kanüle zu sichern.Schließen Sie die distale Kanüle, damit es keinen Fluss innerhalb der Arterie gibt, und schließen Sie die Zuflusspipette an ein PsS-Reservoir an. Visualisieren Sie die kanülierte mittlere Hirnarterie mit einer ladungsgekoppelten Gerätekamera, die auf einem invertierten Mikroskop und einer Bildgebungssoftware montiert ist. Stellen Sie die axiale Länge des MCA auf eine ungefähre Länge ein, sodass sie weder starr noch schlaff erscheint.Die Badlösung mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius ausdemieren. Tauchen Sie den Boden des Verstärkers in die PSS des Myographen ein. Beleuchten Sie die Gefäßkammer und visualisieren Sie die Spitze der Mikroelektrode in der Badlösung durch das Mikroskop.Bewegen Sie mit dem Mikromanipulator die Spitze der Mikroelektrode in der Nähe der Außenwand des Blutgefäßes, und beginnen Sie mit der Aufzeichnung. Bewegen Sie langsam die Spitze der Mikroelektrode in Richtung des Schiffes, das auf die Mitte des Gefäßes zielt. Wenn die Spitze in unmittelbarer Nähe zum Gefäß kommt, bringen Sie die Elektrode in einer schnellen Bewegung vorwärts, um die Membran des Muskels zu aufpalest.Sobald die Membran durchdrungen ist, können Veränderungen des Membranpotentials beobachtet werden. Berühren Sie den Mikromanipulator nicht, sobald die Membran aufgespießt wurde. Wenn die Membranmögliche Veränderungen aufgezeichnet wurden, verwenden Sie den Manipulator, um die Mikroelektrode in einer schnellen Bewegung zu entfernen, und stoppen Sie die Aufzeichnung, bevor Sie die Datendateien speichern.Impalement gilt als erfolgreich, wenn es eine schnelle Ablenkung zu negativen Werten gibt, das Membranpotential für mindestens 30 Sekunden stabil ist und die Spannung bei Entfernung der Elektrode abrupt auf null Millivolt zurückkehrt. Nach einer erfolgreichen Präsment- und Membranpotentialstabilisierung können Medikamente von Interesse in das Bad durchdrungen und Veränderungen des Membranpotentials aufgezeichnet werden. In diesem repräsentativen Experiment depolarisierte die Perfusion mit Kaliumchlorid die Membran um etwa sechs Millivolt, während die Perfusion mit einem kalziumabhängigen Aktivator großer Leitfähigkeit Calcium-aktivierte Kaliumkanäle die Membran um fast vier Millivolt hyperpolarisierte.Das Wichtigste, was Sie sich merken sollten, ist, hochresistente Mikroelektroden zu ziehen, die eine kurze, allmähliche Verjüngung mit einem Durchmesser von weniger als einem Mikrometer haben.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Forschung

Medizin

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Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

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Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

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