Name: microelectrode impalement method to record membrane potential from a cannulated middle cerebral artery
Uploaded: 2019-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av bidrag från det intramural stöd forsknings programmet (IRSP) från UMMC, AHA Scientist Development Grant (13SDG14000006) tilldelas Mallikarjuna R. Pabbidi.

Hanråttor var inhysta i djur vård anläggningen i UMMC, som är godkänd av föreningen för bedömning och ackreditering av laboratorie djur vård (AAALAC). Djuren hade fri till gång till mat och vatten under hela studien. Djuren bibehölls i en kontrollerad miljö med en temperatur på 24 ± 2 ° c, fuktighets nivåer på 60 – 80% och 12 h ljus/mörker-cykler. Samtliga protokoll godkändes av UMMC ' s djur Vårds-och användnings kommitté.
1. beredning av utrustning
<ol><li>Placera e...

<ol>
	<li>Nelson, M. T., Quayle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+and+properties+of+potassium+channels+in+arterial+smooth+muscle.">Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle.</a> American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).</li><li>Hughes, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channels+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Calcium channels in vascular smooth muscle cells.</a> Journal of Vascular Research. 32 (6), 353-370 (1995).</li><li>Large, W. A., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+physiological+role+of+the+Ca(2+)-activated+Cl-+conductance+in+smooth+muscle.">Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle.</a> American Journal of Physiology. 271 (2 Pt 1), C435-C454 (1996).</li><li>Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+channel+blockers+inhibit+myogenic+tone+in+rat+cerebral+arteries.">Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries.</a> Journal of Physiology. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).</li><li>Yamazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+molecular+expression+of+volume-regulated+chloride+channels+in+canine+vascular+smooth+muscle+cells.">Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells.</a> Journal of Physiology. 507 (Pt 3), 729-736 (1998).</li><li>Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitative+Ca2++entry+and+the+regulation+of+smooth+muscle+tone.">Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone.</a> Trends in Pharmacol Sciences. 19 (7), 266-269 (1998).</li><li>Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-activated+single-channel+and+whole+cell+currents+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells.</a> American Journal of Physiology. 262 (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).</li><li>Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-activated+whole-cell+currents+in+smooth+muscle+cells+from+mesenteric+resistance+artery+of+guinea-pig.">Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig.</a> Journal of Physiology. 501 (Pt 2), 343-353 (1997).</li><li>Shelly, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na(+)+pump+alpha+2-isoform+specifically+couples+to+contractility+in+vascular+smooth+muscle:+evidence+from+gene-targeted+neonatal+mice.">Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), C813-C820 (2004).</li><li>Coca, A., Garay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. , (1993).</li><li>Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-dependent+membrane+depolarization+in+cat+middle+cerebral+artery.">Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery.</a> Circulation Research. 55 (2), 197-202 (1984).</li><li>Knot, H. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+arterial+diameter+and+wall+[Ca2+]+in+cerebral+arteries+of+rat+by+membrane+potential+and+intravascular+pressure.">Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure.</a> Journal of Physiology. 508 (Pt 1), 199-209 (1998).</li><li>Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channels,+potassium+channels,+and+voltage+dependence+of+arterial+smooth+muscle+tone.">Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone.</a> American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).</li><li>Harder, D. R., Sperelakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+induced+in+guinea+pig+arterial+smooth+muscle+by+tetraethylammonium.">Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium.</a> American Journal of Physiology. 237 (1), C75-C80 (1979).</li><li>Nystoriak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+increase+in+pressure-dependent+constriction+of+brain+parenchymal+arterioles+from+subarachnoid+hemorrhage+model+rats+due+to+membrane+depolarization.">Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).</li><li>Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+rat+mesenteric+lymphatic+vessels+and+their+regulation+by+stretch.">Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch.</a> Lymphatic Research and Biology. 12 (2), 66-75 (2014).</li><li>Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+electrical+properties+of+middle+cerebral+and+mesenteric+artery+in+cat.">Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat.</a> American Journal of Physiology. 239 (1), C23-C26 (1980).</li><li>Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+membrane+properties+in+vascular+muscle+cells+from+various+vascular+beds.">Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds.</a> Federation Proceedings. 42 (2), 253-256 (1983).</li><li>Cogolludo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+inhibits+voltage-gated+K++currents+in+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells:+role+of+5-HT2A+receptors,+caveolin-1,+and+KV1.5+channel+internalization.">Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization.</a> Circulation Research. 98 (7), 931-938 (2006).</li><li>Ganitkevich, V., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+modulates+inositol+1,4,5-trisphosphate-mediated+Ca2++transients+in+guinea-pig+coronary+myocytes.">Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes.</a> Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).</li><li>Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K++channel+openers,+cromakalim+and+Ki4032,+inhibit+agonist-induced+Ca2++release+in+canine+coronary+artery.">K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 346 (6), 691-700 (1992).</li><li>Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRL+38227+(levcromakalim)-induced+hyperpolarization+reduces+the+sensitivity+to+Ca2++of+contractile+elements+in+caninse+coronary+artery.">BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 347 (4), 438-444 (1993).</li><li>Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+of+the+conducted+electrical+response+in+arterioles+of+hamster+cheek+pouch+in+vitro.">Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro.</a> American Journal of Physiology. 269 (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).</li><li>Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks+in+smooth+muscle.">Calcium sparks in smooth muscle.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 278 (2), C235-C256 (2000).</li></ol>

Denna artikel innehåller de nödvändiga stegen för hur man använder en skarp microelektrod impalement metod för att registrera Vm från en kanylerade kärl beredning. Denna metod används i stor utsträckning, och erbjuder högkvalitativa, konsekventa inspelningar av Vm som svarar på ett brett spektrum av experimentella frågor.
Vissa kritiska överväganden och fel söknings steg beskrivs här för att säkerställa att metoden lyckas. Kvaliteten på mikroelektrode...

Membranpotentialen (Vm) i en cell refererar till den relativa skillnaden av Jon laddning över plasma membranet och membranets relativa permeabilitet för dessa joner. Vm genereras av differential distribution av joner och upprätthålls av Jon kanaler och pumpar. Jon kanaler som K+, na+och cl− bidrar väsentligt till vilande Vm. Vaskulär glatt mus kula tur celler (VSMCs) uttrycka mer än fyra olika typer av K+ kanaler1, två typer av spännings-gated ca2 + kanaler (vgcc)2, mer än två typer av cl− kanaler3, 4 för att , 5, butiks driven ca2 + kanaler6, stretch-aktiverade katjonkanaler7,8och elektrogena natrium-kaliumatpas pumpar9 i sina plasma membran, som alla kan vara som är involverade i regleringen av Vm.
Vm av VSMCs beror på lumen tryck. I icke trycksatta kärl varierar Vm från-50 till-65 MV, men i trycksatta arteriella segment, vm varierar från-37 till-47 MV10. Höjning av intravaskulära trycket orsakar VSMCs att depolarisera11, minskar tröskeln för vgcc öppning, och ökar kalcium tillströmningen bidrar till utvecklingen av Myogenic ton12. Tvärtom, i passiva eller icke-trycksatta fartyg, membran hyperpolarisering, på grund av hög K+ kanal aktivitet, kommer att förhindra vgcc från att öppna, vilket resulterar i begränsad kalcium inträde och en minskning av intracellulära kalcium, bidrar till mindre vaskulära tonen13. Således verkar Vm på grund av förändringar i lumen tryck att spela en viktig roll i vaskulär ton utveckling, och både Vgcc och K+ kanaler spelar en avgörande roll i regleringen av Vm.
Vm varierar mellan fartygs typ och art. Vm är-54 ± 1,3 MV i marsvin överlägsna mesenteriala arteriella remsor14,-45 ± 1 MV i råtta mellersta cerebral artärer vid 60 mmHg lumen Tryck12, och-35 ± 1 MV i råtta parenkymal artärer vid 40 mmHg lumen Tryck15. Den vilande Vm registreras i osträckt råtta lymfatisk muskel är-48 ± 2 MV16. Vm av cerebral VSMCs är mer negativ än i perifera artärer. I jämförelse, felint mellersta cerebral artärer rapporterades ha en Vm av cirka-70 MV, medan mesenteriska och kranskärl rapporterades ha-49 och-58 MV, respektive17,18. Skillnader i Vm över kärl bäddar kan återspegla skillnaderna i uttryck och funktion av Jon kanaler och elektrogena natrium-kalium pumpar.
Ökningar och minskningar i Vm kallas membran depolarisation och hyperpolarisering, respektive. Dessa förändringar i Vm spelar en central roll i många fysiologiska processer, inklusive Jon-kanal gating, cellsignalering, muskelkontraktion, och åtgärder potentiella för ökning. Vid ett fast tryck, många endogena och syntetiska vasodilator föreningar som aktiverar K+ kanaler orsaka membran hyperpolarisering, vilket resulterar i vasodilatation1,13. Omvänt, ihållande membran depolarisation är avgörande för agonist-inducerad eller receptor-medierad vasokonstriktion19. Vm är en kritisk variabel som inte bara reglerar ca2 + tillströmning genom vgcc13 men också påverkar utsläpp av ca2 + från interna butiker20,21 och ca2 +-känslighet den kontraktila apparaten22.
Även om det finns flera metoder för att registrera Vm från olika cell typer verkar data som samlats in från mikroelektrodens impalement-metod för kanylerade fartyg vara mer fysiologiska än data från isolerade VSMCs. När det registreras från isolerade VSMC med nuvarande klämma metoder, Vm ses som spontana övergående hyperpolarizations i VSMCs24. Isolerade VSMCs är inte i syncytium, och förändringarna i serien motståndet kan bidra till oscillatoriska beteendet hos Vm. Å andra sidan, oscillatoriska beteende observeras inte när Vm registreras från intakt fartyg, troligen på grund av cell-cell kontakt mellan VSMCs som är i syncytium i artären och summerade hela fartyget leder till en stabil Vm 24. mätningen av Vm från tryck kärl med standard teknik för mikroelektrodlösning är således relativt nära de fysiologiska förhållandena.
Inspelning av Vm från kanylerade fartyg skulle kunna ge viktig information, eftersom vm av vsmcs som är i syncytium är en av de viktigaste bestämnings faktorerna för vaskulär ton och blod flöde, och modulering av vm kan ge ett sätt att vidga eller blod kärlen. Därför är det viktigt att förstå den metod som deltar i inspelningen av Vm. Denna artikel beskriver intracellulär inspelning av Vm från kanylerade mellersta cerebral artärer (MCAS) med hjälp av en microelektrod impalement metod. Detta protokoll kommer att beskriva hur man förbereder MCAs, mikroelektroder, ställa in elektrometern och utföra impalement metoden att spela in Vm. Dessutom diskuteras representativa data, vanliga problem som har uppstått när du använder den här metoden och potentiella problem.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissection instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aneshetic Vaporiser</td>
			<td>Parkland scientific</td>
			<td>V3000PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc., NY</td>
			<td>Eclipse Ti-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kleine Guillotine Type 7575</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA</td>
			<td>73-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Littauer Bone Cutter</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>16152-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria MC40 Ultra Fine Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-3287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device camera</td>
			<td>Qimaging, , BC</td>
			<td>Retiga 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential electrometer amplifier</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FD223A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line pressure transducer</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA</td>
			<td>MA1 72-4496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>PCS-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrodes</td>
			<td>Warner Instruments LLC, CT</td>
			<td>G200-6,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Fil (Microfiber syringe)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MEH1SF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myograph</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, VT</td>
			<td>CH-1-SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>Sutter Instrument, San Rafael, CA</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration-free table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>3435-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex 10</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p Clamp 10</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Nikon, NY</td>
			<td>NIS-elements</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microelectrode impalement method to record membrane potential from a cannulated middle cerebral artery

Membranpotential (Vm) av vaskulär glatt muskel celler bestämmer fartygets ton och därmed blod flödet till ett organ. Förändringar i uttryck och funktion av Jon kanaler och elektrogena pumpar som reglerar Vm i sjukdoms tillstånd kan potentiellt förändra vm, vaskulär ton, och blod flöde. Således är en grundläggande förståelse av elektrofysiologi och de metoder som krävs för att korrekt registrera Vm i friska och sjuka stater är viktiga. Denna metod gör det möjligt att modulera Vm med olika farmakologiska medel för att återställa vm. Även om det finns flera metoder, var och en med sina fördelar och nack delar, ger denna artikel protokoll för att spela in Vm från kanylerade motstånds kärl såsom mellersta cerebral artär med hjälp av microelektrod impalement metod. Mellersta cerebral artärer är tillåtna att få Myogenic tonen i en myograph kammare, och kärl väggen spetsad med hög motstånds kraft mikroelektroder. Vm -signalen samlas in genom en elektrometer, digitaliserad och analyseras. Denna metod ger en noggrann avläsning av Vm av en kärl vägg utan att skada cellerna och utan att ändra membran motståndet.

Den presenterade metoden kan tillförlitligt användas för att registrera Vm i kanylerade kärl. En kort procedur som beskriver hur man isolerar MCA från hjärnan presenteras i figur 1a. Efter att separera hjärnan från skallen, var MCA dissekera ut och placeras i en petriskål som innehåller låg kalcium PSS. En del av bindväv som bifogats var också dissekeras tillsammans med MCA med hjälp av våren sax och pincett för att förhindra skado...

Watch this Scientific Journal Video about Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery at JoVE.com

Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery

Det primära målet med denna artikel är att ge information om hur man spelar in membranpotential (Vm) från mitten cerebral artär med hjälp av microelektrod impalement metod. Den kanylerade mellersta cerebral artär är utjämnat för att få Myogenic tonen, och kärl väggen spetsad med hög motstånds kraft mikroelektroder.

Microelektrod impalement metod för att spela in membran potential från en kanylerade mellersta cerebral artär

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ...

Detta protokoll kan användas för att mäta membranet potentialen hos normala och sjuka blodkärl och att utvärdera farmakologiska medel som modulerar membran potential, vaskulär ton, och blodflödet. De membranpotentialer som genereras från denna teknik ligger nära det fysiologiska intervallet eftersom vaskulära glatta muskulatur inom ett kärl är i ett syncytium. Innan du påbörjar proceduren, placera en dubbelkanal differentialelektronometer förstärkare nära kärlet kammaren på önskad plats.Använd en BNC-BNC-kabel för att ansluta utmatningen av förstärkarens kanal A eller B till digitaliserarens kanalindata. Montera sonden i mikromanipulatorn, och vrid mikromanipulatorn mot mikroskopet och myografen på ett vibrationsfritt bord. Placera rattarna och strömbrytarna på förstärkarens framsida i lämpliga lägen för experimentet, enligt beskrivningen i manualen.Anslut sedan badmarken till förstärkarens kretsmark med en lämplig elektrod, och se till att buren är jordad till förstärkarens chassi. För att förbereda borosilikatglaset mikroelektroder, använd en standard avdragare för att uppnå en kort, gradvis, åtta till 10-millimeters kona med en mindre än en mikrometer diameter, looping två gånger för högre motstånd och mindre tips. Använd en mikrofiberspruta för att fylla mikroelektroden med tre-molar kaliumklorid, dra långsamt in kolven under injektionen för att ge utrymme för vätskan att fylla och för att förhindra bildandet av bubblor inuti mikroelektroden.Placera den fullastade mikroelektroden på mikroelektrodhållaren, och tryck försiktigt men bestämt in elektrodskaftet i hållaren genom det uttråkade hålet. Avlägsna eventuell överflödig vätska med en labbvävnad, och anslut elektrodhållarens montering till förstärkarsonden. Genomföra ett elektrodtest för att mäta elektrodmotståndet.Öppna sedan inspelningsprogrammet, tilldela filen ett namn och spara filen för framtida analyser. Därefter sköljer du myograph-kammaren med destillerat vatten flera gånger innan du laddar kammaren med fem milliliter normal fysiologisk saltlösning, eller PSS. Med hjälp av en fem- eller 10-milliliter spruta, fyll både glas kanylerna och den bifogade slangen med filtrerade normala PSS utan att införa några luftbubblor, och använda trubbiga tlyck för att göra en halv-knut i två 10-0 monofilament nylon suturer.Sedan, med hjälp av dissektionstyspetsar under ett dissekeringmikroskop, placera de delvis stängda suturknutarna på båda kanylerna något bort från spetsarna. För mellersta cerebral artär isolering, använd våren sax och tlyktor för att identifiera och dissekera ut en ogrenad segment av den mellersta cerebral artär, med en inre diameter på 100 till 200 mikrometer, av råtta hjärnan. Använd fina tång för att montera den mellersta cerebral artären på glas kanylerna, och dra åt suturer för att säkra artären till kanylen.Stäng av den distala kanylen så att det inte kommer att finnas något flöde inom artären, och anslut inflödespipetten till en reservoar av PSS. Visualisera den kanylerade mellersta cerebral artär med hjälp av en laddning-kopplade enhet kamera monterad på ett inverterat mikroskop och bildhantering programvara. Ställ in den axiella längden på MCA till en ungefärlig längd så att den varken verkar styv eller slapp.Jämvikt badlösningen med 95%syre och 5%koldioxid vid 37 grader Celsius. Sänk ned förstärkarens jord i myografens PSS. Belys kärlkammaren, och visualisera spetsen på mikroelektroden i badlösningen genom mikroskopet.Med hjälp av mikromanipulatorn, flytta spetsen av mikroelektoden nära blodkärlets yttervägg, och påbörja inspelningen. Flytta långsamt spetsen av mikroelektoden mot kärlet, som syftar till mitten av fartyget. När spetsen kommer i närheten av kärlet, för fram elektroden framåt i en snabb rörelse för att spetsa muskelns membran.När membranet har trängts in kan förändringar i membranpotentialen observeras. Rör inte mikromanipulatorn när membranet har spetsats. När membranet potentiella förändringar har registrerats, använd manipulatorn för att ta bort mikroelektoden i en snabb rörelse, och stoppa inspelningen innan du sparar datafilerna.Impalement anses vara framgångsrik när det finns en snabb avböjning till negativa värden, är membranpotentialen stabil i minst 30 sekunder, och spänningen återgår abrupt till noll millivolt vid borttagning av elektroden. Efter en lyckad impalement och membran potentiella stabilisering, läkemedel av intresse kan perfused i badet och förändringar i membranet potential kan registreras. I detta representativa experiment, perfusion med kaliumklorid depolarized membranet med cirka sex millivolt, medan perfusion med en kalcium-beroende aktivator av stora kondutans kalcium-aktiverade kaliumkanaler hyperpolarized membranet med nästan fyra millivolt.Det viktigaste att komma ihåg är att dra mycket resistenta mikroelektroder som har en kort, gradvis kona med en mindre än en mikrometer diameter.

Research

JoVE Journal

Medicine

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Modellering stroke hos möss - Middle Cerebral artärocklusion med glödlamporna modell

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Musmodell av Middle Cerebral artärocklusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Intraluminal Middle Cerebral artärocklusion (kortex) Modell för ischemisk stroke med Laser Doppler Flowmetry Vägledning hos möss

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Tillämpningen av permanenta Mellanöstern Cerebral Artery Ligation i musen

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Endotelin-1 inducerad Middle cerebral artärocklusion modell för ischemisk stroke med laser Doppler Flowmetry Vägledning i råtta

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Använda en Kranial fönster för att visualisera den mellersta cerebrala artären under Endotelin-1 inducerad Middle cerebral artärocklusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

Optimerat system för cerebral perfusion övervakning i råtta Stroke Modell av Intraluminal Middle cerebral artärocklusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Modellering stroke hos möss: Permanent Koagulation av den distala Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Emboli Middle Cerebral artärocklusion (kortex) för ischemisk stroke med Homologa Blodproppar i råttor

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Kvantifiering av neurovaskulär skydd Efter Repetitiva Hypoxisk Förkonditionering och Transient Middle Cerebral artärocklusion hos möss

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...