Name: real-time observation of the dna strand exchange reaction mediated by rad51
Uploaded: 2019-02-13T14:00:00
Duration: 6 min 24 s
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这项工作由科学研究赠款办法 (a) (18H03985) 和创新领域赠款资助 (15H05974) 资助, 青年科学家 (b) (17k15061) 至 ba, 以及科学研究 (b) 至 ht, 来自日本科学促进会 (jsps)。

1. 蛋白质和 dna 底物的制备
<ol><li>纯化s. pombe rad51 和 sw5-sfr1 蛋白的同质性 (通过库马西染色判断), 如先前报告的 13,21。</li>
	<li>制备表118所列的寡核苷酸 dna 底物。 注: 寡核苷酸是购买 (见材料表), 并在高效液相色谱级合成。dna 链配对反应需要寡核苷酸 16fa (-)、16FA (-)_40bp 和16AR(+)_40bp。dna 位移测定需要寡核苷酸 16a (-)、16A (-)_40bp 和 16AR(+)_40bp (图 1和表 1)。该协议中的所有 dna 浓度都是指片段浓度, 而不是核苷酸浓度。</li>
	<li>为了形成供体 dsdna, 在带有退火缓冲液的薄壁 pcr 管中混合等量的互补链 (10 mm tris-hcl ph 7.5, 100 mm nacl, 10 mm mgcl2), 确保总体积大于 20μl. 在预冷的金属机架上进行这种混合。冰 (在2°c 至4°c 之间)。 注: 用于配对的寡核苷酸组合为 16a (-)_40bp 和16AR(+)_40bp。对于位移测定, 退火寡核苷酸 16fa (-)_40bp 和16AR(+)_40bp。</li>
	<li>在90°c 下加热退火混合物 5分钟, 并使用 pcr 机器冷却3小时至30°c 以上。将退火 dna 存放在-20°c。</li>
</ol>2. dna 链配对和位移检测
<ol><li>进行 dna 链配对试验。<ol>
<li>制备 1.6 ml 的反应缓冲液 a (30 mm hepes-koh ph 7.5, 1 mm 二硫基醇 [dtt], 含有 36 nm16fa (-) 的 15 mL mgcl2、0.25 mL atp、0.1 mg/ml 牛血清白蛋白 [bsa] 和0.0075% 聚氧乙烯醚单极子)塑料管 (聚丙烯), 并在37°c 下预孵育5分钟。</li>
		<li>在预先培养的反应缓冲液中加入 rad51 蛋白, 最终浓度为 1.5μm, 并在37°c 孵育5分钟。</li>
		<li>在混合物中加入 sw5-sfr1 蛋白, 最终浓度为 0.15μm, 并在37°c 孵育5分钟。</li>
		<li>取1.5 毫升的混合物, 并将其转移到 1.0 x x 1.0 厘米的石英杯中, 其中包含磁性搅拌器, 并将该试剂盒设置为光谱仪。将分光光度计的 peltier 温度控制器配置为 37°c, 并将磁力搅拌器设置为 450 rpm, 以确保注入样品的快速混合。</li>
		<li>在 493 nm (带宽: 1 nm) 的激发下, 开始测量 fam 在 525 nm (带宽:20 nm) 下的荧光发射。每秒收集一次数据。</li>
		<li>在开始测量100秒后, 将 x 标记的捐献者 dsdna 注射到混合物中的最终浓度为 36 nm, 然后以1秒的间隔测量排放变化, 再测量30分钟。</li>
	</ol>
</li>
	<li>进行 dna 链位移检测。<ol>
<li>在 2.0 ml 微型离心机塑料管中制备含有 36 nm 16a (-) 的 1.6 ml 反应缓冲液 a, 并在37°c 预孵育5分钟。</li>
		<li>在37°c 的 swu5-sfr1 存在的情况下形成 rad51-ssdna 丝, 如步骤2.1.2 所述。和2.1.3。</li>
		<li>取 1.5 ml 的混合物, 并将其转移到含有磁性搅拌器的石英立方, 并将试剂盒设置到分光光度计中, 如步骤2.1.4 中所述。</li>
		<li>开始测量荧光发射, 并在100秒后, 按照步骤2.1.6 中的描述, 注入 fam 和 rox 标记的供体 dsdna。以1秒的间隔测量荧光发射的变化, 再测量30分钟。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 从配对和位移检测中分析实验数据
<ol><li>估计最大的 fret 效率。<ol>
<li>使用步骤1.3 和1.4 中所述的相同程序准备用16AR(+)_40bp 退火的 16fa (-) 和用16AR(+)_40bp 退火的 16fa (-)。</li>
		<li>准备含有 36 nm 的反应缓冲液 a, 其中包括 36 nm, 均为 16fa (-), 16fa (-) 与16AR(+)_40bp 退火, 16fa (-)_40bp 用16AR(+)_40bp 退火或 16fa(e-)_40bp 在 0.2 x x 1.0 厘米的石英杯中。</li>
		<li>将试剂盒放入荧光光谱仪中, 在37°c 孵育5分钟。</li>
		<li>在 493 nm 处激发时测量从500到600纳米的荧光光谱。</li>
		<li>为了测试 rad51 对氧化物排放 fam 和淬火 fam 的影响, 在混合物的最终浓度为1.5μm 时加入 rad51, 在37°c 孵育5分钟。</li>
		<li>在 493 nm 处激发时测量从500到600纳米的荧光光谱。</li>
		<li>使用下面描述的公式计算最大 fret 效率 (e最大值): e最大值 = (在525纳米的 dsdna 中同时标记为 fam 和 rox 的荧光强度)/(在 525 nm 的 fam 标记 sdna 的荧光强度)</li>
	</ol>
</li>
	<li>分析位移分析的实验数据。<ol>
<li>要将位移测定中观察到的荧光变化转化为最终产品数量的变化, 请使用下面描述的公式将从该检测中获得的原始实验数据转化为原始实验数据, 其中 f原始是来自原始数据和f 归一化是由以下方程计算的荧光变化。 f归一化= ( [f 原始时间 x]-[ f 原始在时间 0])/([f 原始在时间 0]/e最大值)-[ f 原始在时间 0]) f 在时间0时的原始是在死亡时间后的前 5秒 (即注射剂进入 cuvette 后混合所需的时间) 的平均荧光监测时间。</li>
		<li>为了排除光漂白和自发位移的影响, 减去 f 归一化而不蛋白质的样品f 归一化, 得到 fd,即本试验中最终产物量的变化。 fd = [样品的 f 归一化]-[f 在没有蛋白质的情况下归一化]</li>
	</ol>
</li>
	<li>分析配对试验的实验数据。<ol>
<li>利用下面描述的公式对从配对试验中获得的原始实验数据进行归一化 , 其中 f 原始是原始数据中的荧光强度, f归一化是由以下方程计算的荧光变化。 f归一化= (f 原始时间 x)/(f生时间为 0) f原料在时间0是通过注入 dsdna 底物在引发反应之前监测的最后20秒的平均荧光。</li>
		<li>要将荧光的变化转化为底物量的变化, 并排除光漂白和自发配对的影响, 请使用下面描述的方程使样品f 归一化, 其中 fp 是样品量的变化。在本试验中的底物。 fp = 1-([f 归一化没有蛋白质]-[样品的 f 归一化])/[1-e最大值])</li>
		<li>为了检查 dna 链交换的反应动力学, 使用分析程序23对配对反应进行非线性最后二乘回归分析 (见材料表)。<ol>
<li>准备一个. txt 格式的文件, 其中包含 fp 的时间过程数据。</li>
			<li>启动程序并将补充代码文件中的脚本粘贴到程序的窗口中:</li>
			<li>开始非线性最后二乘回归分析。此分析的结果将显示在同一窗口中。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Camerini-Otero, R. D., Hsieh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+proteins+in+prokaryotes+and+eukaryotes.">Homologous recombination proteins in prokaryotes and eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 29 (1), 509-552 (1995).</li><li>Cromie, G. A., Connelly, J. C., Leach, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+at+double-strand+breaks+and+DNA+ends:+conserved+mechanisms+from+phage+to+humans.">Recombination at double-strand breaks and DNA ends: conserved mechanisms from phage to humans.</a> Molecular Cell. 8 (6), 1163-1174 (2001).</li><li>Pierce, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Rad52+binds+and+wraps+single-stranded+DNA+and+mediates+annealing+via+two+hRad52-ssDNA+complexes.">Human Rad52 binds and wraps single-stranded DNA and mediates annealing via two hRad52-ssDNA complexes.</a> Nucleic Acids Research. 38 (9), 2917-2930 (2010).</li><li>Algasaier, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+and+Protein+Requirements+for+Substrate+Conformational+Changes+Necessary+for+Human+Flap+Endonuclease-1-catalyzed+Reaction.">DNA and Protein Requirements for Substrate Conformational Changes Necessary for Human Flap Endonuclease-1-catalyzed Reaction.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (15), 8258-8268 (2016).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

在这里, 我们描述了一个详细的协议, 利用 fret 测量 rad51 驱动的 dna 链的实时交换。重要的是, 这些测量允许确定反应动力学。虽然上面提供的描述足以重现我们发布的结果, 但有几个关键点将在本节中描述。此外, 还将讨论基于 fret 的 dna 链交换方法的优缺点, 以及这些技术在 dna 代谢研究中的应用。
与所有生化重组一样, 确保所有反应基板的高纯度是必不可少的。仅仅根据 coomassie 染色判断的蛋白质制剂的表观纯度来假设没有污染活动是疏忽。特别是, 微量核酸酶或螺旋酶的存在会极大地影响配对和位移检测的结果。因此, 我们强烈鼓励每次纯化新的蛋白质时都要对此类活动进行检测。此外, 采用原生聚丙烯酰胺凝胶电泳检测合成 dna 底物的纯度也是谨慎的做法。尽管许多公司保证了寡核苷酸的纯度, 但我们经常通过自己的测试发现, 合成 dna 的纯度可能因批次而异。
在使用石英试剂盒进行实验时, 必须考虑以下两点。首先, 有些蛋白质容易在非特异性上结合石英杯。为了解决这个问题, bsa 和聚氧乙烯基单环酯被纳入反应缓冲液中。其次, 温度对反应速度和荧光强度有很大影响。为了最大限度地减少这种影响, 石英立方应在使用前在37°c 预孵育。
尽管传统的生化检测在 dna 链交换的研究中非常有用, 但它们也有几个缺点。在一个典型的时间过程实验中, 反应在一定温度下孵育, 在所需的时间点提取等价物, 并通过洗涤剂和蛋白酶的处理进行脱蛋白化, 以终止反应。时间过程完成后, 对样品进行电泳, 将 dna 底物与产品分离。这里描述的方法的主要优点是, 它允许在没有任何干扰的情况下实时观测反应。反应过程中的任何时间点都可以在不干扰反应本身的情况下进行检查, 也没有必要对样品进行去蛋白质化或使其受到潜在的电泳干扰力的影响。这在监测不稳定的 dna 结构时尤其重要。
尽管与传统检测相比具有这些优势, 但这里描述的方法确实有一些缺点。虽然使用寡核苷酸 dna 基板进行链交换简化了对结果的解释, 但重要的是要记住, 这些底物并不类似于细胞中 hr 中涉及的 dna 基板。一些常规的检测利用等离子体大小的 dna 底物, 这些底物更有可能反映在体内交换的基对的数量。此外, 在常规检测的子集中使用拓扑约束的圆形 dsdna 基板至少可以部分地再现生理 dna 中的紧张关系。
本文所述方法的应用已经开始解开 rad51 驱动的 dna 链交换的分子机制。尽管如此, 仍有许多令人感兴趣的问题有待回答。有明确的证据表明, 减数分裂期间的 hr 需要 rad51 和 dmc1, 减数分裂特异性 reca 型重组酶在真核生物24。然而, 这两种重组酶之间缺乏重大的生化差异, 多年来一直困扰着这一领域的研究人员。此外, 许多不同的重组附属因素群体的作用一直是人力资源领域研究的焦点。除了阐明 rad51 和 dmc1 之间的生化差异外, 我们还打算在不久的将来研究和比较不同重组辅助因子对 dna 链交换动力学的影响。最后, 必须强调的是, 这里描述的基于 fret 的方法并不局限于 dna 链交换的研究。通过相对较小的修改, 我们设想了这一技术在研究 dna 代谢中涉及的功能多样化的蛋白质的多种应用 25,26, 27,28.我们希望这里描述的发展将为属于许多不同学科的研究人员提供进一步的选择。

同源重组 (hr) 促进了两个不同 dna 分子之间遗传信息的洗牌。hr 对于两种基本的生物现象至关重要: 在配子生成过程中产生遗传多样性1和在有丝分裂过程中修复 dna 双链断裂 (dsb)2 。dsb 是 dna 损伤最严重的形式, 构成染色体的断裂。dsb 的不正确修复会导致广泛的染色体重排和基因组不稳定, 这两者都是癌症的特征3。
dna 链交换反应是 hr 的核心阶段。rad51 蛋白是高度保守的 reca 型重组酶家族的成员, 是在真核生物4,5中催化这种反应的关键蛋白。在这一反应中, rad51 与 dsb 末端的核溶解处理所产生的单链 dna (ssdna) 结合在一起, 形成一个螺旋核蛋白复合体, 称为突触前长丝。这种长丝获取完整的双链 dna (dsdna) 不是专门的, 以寻找一个同源序列。当灯丝发现同源序列时, 形成含有三链 dna 的反应中间体, 而 rad51 丝在该结构中介导链交换 6、7、8。为了有效地完成这种反应, rad51 需要几种辅助蛋白, 如 brca1 和 brca2, 乳腺癌易感基因的产物 9,10.
了解辅助因子如何调节 rad51 是揭示肿瘤发生过程中基因组不稳定原因的一个组成部分。尽管许多研究涉及这些因素对突触前长丝形成和稳定性的影响11、12、13、14、15、16、这些因素对三股中间体的形成及其加工到最终产品中的贡献仍不清楚。通过常规生化实验观察这些反应步骤是非常困难的, 因为三股中间体不稳定, 容易通过常见的实验操作, 如样品的脱蛋白化或电泳。
为了克服这个问题, 我们利用荧光共振能量转移 (fret) 改编了两个先前开发的 dna 链交换反应实时观测系统: dna 链配对和 dna 链位移检测 17, 18 (图 1)。在 dna 链配对试验中, rad51 与荧光素胺类 (fam) 标记的 dna 形成突触前丝, 然后加入同源羧基-x-罗丹明 (rox) 标记 dsdna, 以启动链交换反应。当灯丝捕获 rox 标记的 dsdna 并形成三股中间体时, 两个荧光体接近, 并通过 rox (图 1a) 淬火 fam 的荧光发射。在 dna 链位移分析中, 用 fam 和 rox 双标记 dsdna 培养在未标记的 ssdna 上形成的突触前长丝。当链交换完成, 并且从三链中间体释放 fam 标记 ssdna 时, 由于 fam 不再靠近 rox, fam 的排放量会增加 (图 1b)。这些检测使我们能够实时观察三股中间体的形成及其加工成最终产品的情况, 而不会对反应产生任何干扰。
利用这个实时观测系统, 我们发现由 rad51 介导的 dna 链交换反应分三个步骤进行, 包括第一反应中间体 (c1) 的形成, 将第一中间体转化为第二中间体(c2), 并从 c219 中释放 ssdna。我们还发现, 裂变酵母 (s. pombe) sw5-sfr1, 这是一个进化保守的 rad51 辅助蛋白复合体13, 16,20,21, 22,刺激c1-c2 从 c2 中过渡和释放 ssdna, 其方式依赖于 rad5119 的atp 水解。
这些发现在进化上是否被保存仍然是未知的。该协议希望人力资源领域的研究人员, 特别是那些研究来自s.pombe 以外的生物体的蛋白质的研究人员, 能够应用这些技术来确定 rad51 驱动的分子机制在多大程度上钢绞线交换是保守的。此外, 这些技术已被证明非常成功地确定了 s. pombe swipi-sfr1 的作用。因此, 这是一个合理的预测, 这些技术将是无价的, 以揭示其他 hr 辅助因素的确切作用。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 x 1.0 cm quartz cuvette</td>
			<td>Hellma Analytics</td>
			<td>105-250-15-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 x 1.0 cm quartz cuvette</td>
			<td>Hellma Analytics</td>
			<td>101-10-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaFit</td>
			<td>BioKin, Ldt.</td>
			<td></td>
			<td>DynaFit is a program to analyze kinetics of biochemical reactions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent labeled and non-labeled oligonucleotides</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>The sequences of oligos are listed in Table. 1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Aisis (Japan)</td>
			<td>CM1609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>TAKARA (Japan)</td>
			<td>TP600</td>
			<td>TAKARA PCR Thermal Cycler Dice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>JASCO</td>
			<td>FP8300</td>
			<td>Contains a peltier temperature controller and magnetic stirrer system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>HAMILTON</td>
			<td>1702RN 25ul SYR (22s/2&#34;/2)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time observation of the dna strand exchange reaction mediated by rad51

由 rad51 介导的 dna 链交换反应是同源重组的关键步骤。在这一反应中, rad51 在单链 dna (ssdna) 上形成核蛋白长丝, 并捕获非专门用于询问其同源序列的双链 dna (dsdna)。在遇到同源性后, rad51 催化 dna 链交换, 介导 ssdna 与 dsdna 互补链的配对。这种反应在体内受到许多辅助蛋白的高度调节。尽管传统的生化检测已被成功地用于研究这种辅助蛋白在体外的作用, 但对中间形成及其进展到最终产品的动力学分析已被证明具有挑战性, 因为反应中间体的不稳定和瞬态性质。为了直接观察溶液中的这些反应步骤, 建立了基于荧光共振能量转移 (fret) 的该反应实时观测系统。实时观测的动力学分析表明, 由 rad51 介导的 dna 链交换反应遵循三步反应模型, 包括形成三链 dna 中间体、成熟该中间体和 dna 释放。成熟的中间体。spy5-sfr1 复合物是一种保存在真核生物中的辅助蛋白, 它强烈地增强了这种反应的第二和第三步。这里介绍的基于 fret 的检测使我们能够揭示重组辅助蛋白刺激 rad51 dna 链交换活动的分子机制。该协议的主要目标是加强同源重组领域的研究人员可利用的技术, 特别是那些使用来自血吸虫以外物种的蛋白质的研究人员, 以便本文所提出的结果的进化守恒是可以确定的。

为了有效地分析配对和位移检测的实验数据, 有必要定义 fam 荧光发射的变化如何对应于 dna 底物转化为产品。为此, 必须确定荧光强度的相关范围。对于配对试验, 将与 ssdna 底物相对应的 16fa (-) 的荧光发射与与16AR(+)_40bp 退火的 16fa (-) 的发射进行比较, 后者与该反应的最终产物相对应 (图 2 a)。这相当于最大的 fret 效率, 因此, 如果所有的 ssdna 底物被转换为 dsdna 产物, 荧光强度的最大降低是可以预期的。对于位移测定, 将与基板相对应的16AR(+)_40bp 退火 16fa(-)_40bp 的发射与与最终产物相对应的 16fa(--)_40bp 的发射进行比较 (图 2b)。在这种情况下, fam 荧光强度的最大增加传递了一个场景, 在这种情况下, 所有的 dsdna 底物都被转化为 ssdna 产物。在两种检测中, x型 com的荧光发射和氧化物的淬火效率均不受影响 (图 2)。由于寡核苷酸的标记效率取决于寡核苷酸的标记效率, 因此应在每一种新的寡核苷酸制备方法中重新测量最大的 fret 效率。
dna 链配对和位移反应的代表性数据如图 3所示。在这两种检测中, 基板 dna 之间的自发反应和光漂白的影响都很小, 这表现在没有 rad51 的 fam 发射的微小变化与 rad51 之间的实质性变化相比 (图 3 a 和图 3b)。根据图 3 a 或图 3 b 所示的数据, 荧光的变化分别转化为基板 (fp)或最终产品 (f d) 的量变化, 分别使用步骤中描述的方程3.2.2 或 3.3.2 (图 3c和图 3C)。
用顺序三步反应模型模拟了配对反应, 包括形成第一三股中间体 (c1), 将第一中间体过渡到第二中间体 (c1 至 c2), 以及释放 ssdna从第二个中间体形成两个产品 (d + e) (图 3e)。为了验证使用序贯三步反应模型进行的模拟是否符合实验数据, 计算了 dna 链配对试验数据与模拟获得的理论曲线之间的残差 (图 3f)。此外, 还计算了配对反应与使用顺序两步反应模型生成的理论曲线之间的残差 (图 3g)。配对反应和两步模型的残差在早期表现为系统偏差, 而配对反应和三步模型的残差则没有显示出这样的偏差。这表明, 三步模型比两步模型更适合模拟配对反应。
为了验证三步模型是否与检测 dna 链交换后期的位移反应一致, 我们利用从配对模拟中获得的动力学参数生成了位移反应的理论曲线如图3c 所示的反应, 并将其与图 3C所示的位移反应的实验数据进行了比较 (图 3C)。理论曲线符合位移分析的实验数据。根据这些结果, 我们得出结论, 利用三步模型进行的模拟能够合理地评价由 rad51 介导的 dna 链交换反应。
图 4 a显示了含有 rad51 和 spsu5-sfr1 复合物 (rad51 的辅助蛋白) 的 dna 链配对反应的代表性数据。swi5-sfr1 复合体强烈刺激 rad51 的配对活动。正如在没有 swy5-sfr1 的情况下所看到的, 在 sw5-sfr1 存在的情况下, 配对反应比两步模型更适合三步模型 (图 4b)。通过三步模型对反应进行模拟, 计算了有或不具有 sw5-sfr1 的每个反应步骤的反应平衡常数。反应平衡常数表明, spy5-sfr1 复合物不刺激第一反应步骤 (图 4c,面板 a), 其中形成了三股中间体, 但强烈刺激 c1-c2 过渡 (图 4c,面板 b) 和 c2 中间体中 ssdna 的释放 (图 4c,面板 c)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59073/59073fig1.jpg"> 图 1: dna 链配对和位移检测的实验设计.dna 链配对 (a) 和位移 (b) 检测的原理图。黄色圆圈代表 rad51 单体。含有 "f" 的绿色圆圈和含有 "r" 的红色圆圈分别代表荧光素胺类 (fam) 和羧酸-x-罗丹明 (rox)。黑色 dna 链的序列是相同的, 并与蓝色 dna 链互补。带有箭头的薄黑线指向每个寡核苷酸的名称, 如表 1所示。这一数字已从 ito等人改编。19 经修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59073/59073fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59073/59073fig2.jpg"> 图 2: 对配对和位移检测的最大 fret 效率的测量.(a) 与16AR(+)_40bp 配对的 ssdna 底物 16fa (-) 和 dsdna 产物 16fa (-) 配对的荧光光谱比较。蓝色和红色线分别表示不含 rad51 和带 rad51 的基板的荧光光谱。绿色和紫色线分别显示最终产品的荧光光谱, 不含 rad51 和使用 rad51。(b) dsdna 底物、16fa(-)_40bp 与16AR(+)_40bp 配对和 ssdna 产物 16fa(-)_40bp 的荧光光谱比较。蓝色和红色线分别表示最终产品的荧光光谱, 不含 rad51 和与 rad51。绿色和紫色线分别显示了不含 rad51 和使用 rad51 的基板的荧光光谱。这一数字改编自 ito等人.19 经修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59073/59073fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59073/59073fig3.jpg"> 图 3: 由 rad51 介导的 dna 链配对和位移反应.(a) 具有或不具有 rad51 的配对反应的归一化荧光的时间过程。(b) 具有或不具有 rad51 的位移反应的归一化荧光的时间过程。(c)与 rad51 配对反应中底物量变化的时间过程。(d) 与 rad51 的置换反应中底物量变化的时间过程。(e) 顺序三步反应模型的示意图。a 和 b 对应于突触前长丝和供体 dsdna。c1 对应于第一个 (不成熟) 三股中间体。c2 对应于第二个 (成熟) 三股中间体。d 和 e 对应于从 c2 释放的异位双工和 ssdna。(f和g) dna 链配对分析的实验数据与使用三步 (f) 或两步 (g) 模型进行模拟获得的理论曲线之间的残留量。(h) 红点表示与 d. 面板所示的 rad51 进行的位移反应的实验数据, 即最终产物的理论曲线。理论曲线是利用c组中显示的配对试验得到的反应速率常数进行模拟生成的。这一数字改编自 ito等人.19 经修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59073/59073fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59073/59073fig4.jpg"> 图 4: sw5-sfr1 刺激 dna 链交换反应的第二和第三步.(a) 与 sw5-s以便 (s5s1) 的配对反应中底物量变化的时间过程。(b) spy5-sfr1 dna 链配对试验数据与使用两步 (蓝线) 或三步 (红线) 模型进行模拟获得的理论曲线之间的残差。(c) 使用分析程序23 (见材料表), 用三步模型模拟了图 4a所示的配对反应。从模拟中得到了每个反应步骤 k1 (a)、k2 (b) 和 k3 (c) 的反应平衡常数。这一数字改编自 ito等人.19 经修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59073/59073fig4large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">用于 dna 链配对测定的寡核苷酸</td>
		</tr>
<tr>
<td>16fa (-)</td>
			<td colspan="4">5 '-[fam]-aaatgaacatatattaagtaagtataatatataca aaatataataatataataataagtaatat aaa-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>16a (-)_40bp</td>
			<td colspan="4">5 '-aaatgaacatatataattaagtataaa-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>16AR(+)_40bp</td>
			<td colspan="4">5 '-tttttttattttattattattttttttttttt-[rox]-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">用于 dna 链位移检测的寡核苷酸</td>
		</tr>
<tr>
<td>16a (-)</td>
			<td colspan="4">5 '-aaatgaacatattaattaagtaatataaaata agtaaatatataaataatatat aaa-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>16fa(-)_40bp</td>
			<td colspan="4">5 '-[fam]-aaatgaacatatatataagtatatataaa-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>16AR(+)_40bp</td>
			<td colspan="4">5 '-tttttttattttattattattttttttttttt-[rox]-3 '</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: dna 链配对和位移检测中使用的寡核苷酸列表.在适用的情况下, 荧光体的位置 (荧光素-阿米石、fam; 羧基----罗丹、rox) 用方括号表示。

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Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

建立了以光谱51介导的 dna 链交换反应为基础的荧光共振能量转移实时观测系统。利用这里提出的协议, 我们能够检测反应中间体的形成及其转化为产物, 同时也分析了反应的酶动力学。

rad51 介导的 dna 链交换反应的实时观测

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

该方法有助于破译DNA链交换的步骤，揭示修复过程中结合的不同蛋白质的分子作用。通过这项技术，我们可以实时监测DNA链交换，而不会对反应造成任何干扰，并使用手术室确定每个反应步骤的动力学。通过一些小的调整，该技术可以应用于研究从其他物种（如哺乳动物和植物）衍生的纯化重组蛋白的活动。演示程序将是肯塔罗伊藤， 一个后医生从我的实验室。首先，根据文本协议准备反应缓冲区 A。接下来，在缓冲液中加入36纳米莫16FA-寡核苷酸，进行DNA配对测定。在37摄氏度下孵育混合物5分钟。将RAD-51蛋白以1.5微摩尔的最终浓度加入混合物中，并在37摄氏度下孵育5分钟。将SWI5-SFR1蛋白以0.15微摩尔的最终浓度加入混合物中，并在37摄氏度下再孵育5分钟。在含有磁力搅拌器的 1.0 x 1.0 厘米石英盒中转移 1.5 毫升混合物。将库放入光谱荧光计中，然后继续调节温度控制器和磁力搅拌器。记录在493纳米激发时，FAM荧光发射在525纳米时的变化，间隔100秒。最后，用注射器将ROX标签的双链DNA注射到36纳米摩尔的最终浓度中。以一秒间隔记录荧光发射的变化，间隔 30 分钟。要比较基材和最终产品之间的荧光光谱，请将含有带RAD-51的16个FA-寡核苷酸的每个库子插入光谱荧光计，并在37摄氏度下孵育5分钟。然后，在493纳米的激发下，记录500至600纳米的 FAM 荧光发射。要测试RAD-51对荧光光谱的影响，请以1.5微摩尔的最终浓度加入RAD-51。在37摄氏度下孵育混合物5分钟。最后，在493纳米的激发下记录荧光光谱从500纳米到600纳米。当所有单链DNA基质在配对测定中转化为双链DNA时，通过测量荧光强度的最大降低，可以获得最大的F FRET效率。或者通过测量当所有双链DNA基质在位移测定中转化为单链DNA时强度的最大增加。在这两种测定中，RAD-51蛋白的添加不会影响 FAM 的荧光发射或岩石的淬火效率。基板DNA与随后的光漂白之间的自发反应影响较小。如与RAD-51相比，没有RAD-51的 FAM 排放量变化微不足道。添加 SWI5-SFR1 复合体可强烈刺激 RAD-51 的配对活动。使用三步模型模拟配对反应，包括形成第一个三股中间体，过渡到第二中间体，释放单链DNA和形成异质双面。将三步模型与两步模型进行比较表明，三步模型更适合模拟DNA配对，无需或与 SWI5-SFR1 复合物匹配。每个反应步骤的计算平衡常数（带或不带 SWI5-SFR1）表明，SWI5-SFR1复合物不会刺激前三链中间体的形成，而是强烈刺激两个三链中间体之间的过渡和 SS DNA 的释放。验证每批纯化蛋白是否无核酸酶和直升机污染至关重要。

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