Name: detection of protein ubiquitination sites by peptide enrichment and mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry at JoVE.com

هذا العمل هو جزء من مشروع "البروتينات في العمل"، وهو برنامج للمركز الهولندي للبروتيوميات الذي تموله المنظمة الهولندية للبحث العلمي كجزء من خارطة الطريق الوطنية على نطاق واسع مرافق البحوث (المشروع رقم 184.032.201 ).

وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها على جميع الأساليب الموصوفة هنا التابعة لإيراسموس إم سي.
1. إعداد عينة
<ol><li>الخلايا المثقفة<ol>
<li>حدد خط الخلية ذات الاهتمام (على سبيل المثال، HeLa أو خلايا العظام [U2OS] الخلايا) وتنمو الخلايا في جلبكو الحد الأدنى النسر المتو?...

<ol>
	<li>Clague, M. J., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+Same+molecule,+different+degradation+pathways.">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li><li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy:+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture.">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li><li>Bergink, S., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+ubiquitin+and+SUMO+modifications+in+DNA+repair.">Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair.</a> Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).</li><li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Code.">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li><li>Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+Linkage-Specific+Affimers+Reveal+Insights+into+K6-Linked+Ubiquitin+Signaling.">Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling.</a> Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).</li><li>Swatek, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+ubiquitin+chain+architecture+using+Ub-clipping.">Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping.</a> Nature. 572, 533-537 (2019).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analyses+Reveal+Divergent+Ubiquitylation+Site+Patterns+in+Murine+Tissues.">Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).</li><li>Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+Ubiquitylation+and+Phosphorylation+Signaling+in+Rapamycin-treated+Yeast+Cells.">Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).</li><li>Elia, A. E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomic+Atlas+of+Ubiquitination+and+Acetylation+in+the+DNA+Damage+Response.">Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response.</a> Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).</li><li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proteome-wide,+Quantitative+Survey+of+In+Vivo+Ubiquitylation+Sites+Reveals+Widespread+Regulatory+Roles.">A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).</li><li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Quantification+of+in+vivo+Changes+in+Protein+Ubiquitination+following+Proteasome+and+Deubiquitinase+Inhibition.">Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).</li><li>Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+reveals+extensive+remodeling+of+the+ubiquitinome+after+perturbation+of+the+proteasome+by+dsRNA+mediated+subunit+knockdown.">Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).</li><li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling.">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li><li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides.">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li><li>Rose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Multiplexed+Quantitative+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Ubiquitylomes.">Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes.</a> Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).</li><li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+standard+absolute+quantification+(PSAQ)+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools.">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li><li>Van Der Wal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+ubiquitylation+site+detection+by+Orbitrap+mass+spectrometry.">Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. (July), (2017).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li></ol>

تم تطبيق البروتوكول الموصوف هنا على عينات من مصادر بيولوجية مختلفة، مثل الخلايا المستزرعة وفي أنسجة الجسم الحي. في جميع الحالات حددنا الآلاف من الببتيدات diGly، شريطة أن يكون إجمالي كمية مدخلات البروتين 1 ملغ على الأقل. الإثراء باستخدام أجسام مضادة محددة فعالة للغاية ، بالنظر إلى أنه تم تحد?...

اقتران ubiquitin إلى البروتينات علامات عليها لتدهور من قبل proteasome وهي عملية حاسمة في البروتوستاس. مجموعة C-المحطة الكاربوكسيلي من ubiquitin يشكل رابطة isopeptide مع مجموعة ليسين من البروتين المستهدف1,2. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إرفاق ubiquitin بوحدات ubiquitin الأخرى ، مما يؤدي إلى تشكيل هياكل بوليوبيكوتين متجانسة (أي K48 أو K11) أو متفرعة (أي غير متجانسة أو مختلطة) هياكل البوليوبيكوتين1،3. الوظيفة الأكثر شهرة من ubiquitin هو دوره في تدهور بروتياسومي، بوساطة polyubiquitin K48 المرتبطة. ومع ذلك ، فقد أصبح من الواضح أن كل من أحادية ، وكذلك polyubiquitination تلعب أيضا أدوارا في العديد من العمليات التي هي مستقلة عن تدهور من قبل proteasome. على سبيل المثال، سلاسل K63 المرتبطة لها أدوار غير مُنُهِية في الاتجار داخل الخلايا، وتدهور الليسوسومي، وإشارات الكيناز، واستجابة تلف الحمض النووي4،,5. الأنواع الستة الأخرى الروابط هي أقل وفرة وأدوارها لا تزال غامضة إلى حد كبير، على الرغم من أن المؤشرات الأولى حول وظائفها في الخلية بدأت تظهر، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى تطوير أدوات جديدة لتمكين الكشف عن الروابط الخاصة6,7.
أصبح قياس الطيف الكتلي أداة لا غنى عنها لتحليل البروتينات وفي الوقت الحاضر يمكن تحديد الآلاف من البروتينات المختلفة من أي مصدر بيولوجي تقريبًا في تجربة واحدة. يتم تقديم طبقة إضافية من التعقيد عن طريق التعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) من البروتينات (على سبيل المثال، الفوسفور، الميثيل، الأسيتيل، وubiquitination) التي يمكن أن تعدل نشاط البروتين. كما أصبح التحديد الواسع النطاق للبروتينات الحاملة لـ PTM ممكناً بسبب التطورات في مجال قياس الطيف الكتلي. إن قياس الببتيدات المنخفض نسبياً والحامل لـ PTMs مقارنة بنظيراتها غير المعدلة يمثل تحدياً تقنياً، وخطوات الإثراء البيوكيميائية ضرورية بشكل عام قبل تحليل قياس الطيف الكتلي. وعلى مدى العقدين الماضيين، تم تطوير عدة أساليب تخصيب محددة مختلفة لتحليل تدابير التخصيب المتعددة الجوانب.
بسبب الأدوار المتعددة الأوجه للبروتين في كل مكان في الخلية ، هناك طلب كبير على تطوير الطرق التحليلية للكشف عن مواقع التعامي على البروتينات8. وقد أدى تطبيق أساليب الطيف الشامل إلى انفجار عدد المواقع المحددة في كل مكان في ذبابة الفاكهة والفأر والإنسان والخميرة البروتينات9،10،1111،12،13،14. وقد تم تقديم خطوة رئيسية من خلال تطوير استراتيجيات الإثراء القائمة على الترسيب المناعي على مستوى الببتيد باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد زخارف بقايا K-а-GG (يشار إليها أيضًا باسم "diglycine" أو "diGly"). يتم إنتاج هذه الببتيدات diGly عند هضم البروتينات في كل مكان باستخدام التربسين كما البروتياز15,16.
هنا ، نقدم سير عمل محسن لإثراء الببتيدات diGly باستخدام الببتيدات المناعية والكشف اللاحق عن طريق قياس الطيف الكتلي Orbitrap. باستخدام مزيج من عدة تعديلات على سير العمل الحالي ، وخاصة في إعداد العينة ومراحل قياس الطيف الكتلي ، يمكننا الآن تحديد أكثر من 23000 ببتيد diGly بشكل روتيني من عينة واحدة من خلايا HeLa تعامل مع بروتيجسوم مثبط و ~ 10،000 من خلايا هيلا غير المعالجة. لقد طبقنا هذا البروتوكول على الليسات من كل من تسمية النظائر غير المسماة ومستقرة مع الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا (SILAC) المسماة خلايا هيلا وكذلك إلى عينات داخلية مثل أنسجة الدماغ.
يقدم سير العمل هذا إضافة قيمة إلى ذخيرة أدوات لتحليل مواقع الكلى من أجل الكشف عن الكلوتينيوم العميق. يصف البروتوكول التالي كافة خطوات سير العمل بالتفصيل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Empore C18 Octadecyl disks</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>66883-U</td>
			<td>product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>UBPbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH130 resin, 3.5 &#956;m, 130 &#197;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nanoLC 1200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/F filter plug</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1825-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine, Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysyl Endopeptidase(LysC)</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLC oven</td>
			<td>MPI design, MS Wil GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher / Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLRP-S (300 &#197;, 50 &#181;m) polymeric reversed phase particles</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>PL1412-2K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-&#949;-GG) Kit</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>5562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036790</td>
			<td>Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein ubiquitination sites by peptide enrichment and mass spectrometry

التعديل بعد التحويل ية للبروتينات بواسطة البروتين الصغير في كلمكانفيا تشارك في العديد من الأحداث الخلوية. بعد الهضم الtryptic من البروتينات في كل مكان، يمكن استخدام الببتيدات مع بقايا diglycine مترافقة مع مجموعة أمينية إبسيلون من الليسين ('K-а-diglycine' أو ببساطة 'diGly') لتتبع موقع التعديل الأصلي. وقد أدى التنقية المناعية الفعالة من الببتيدات diGly جنبا إلى جنب مع الكشف الحساس عن طريق قياس الطيف الكتلي إلى زيادة كبيرة في عدد مواقع التعامي التي تم تحديدها حتى الآن. لقد قمنا بإجراء العديد من التحسينات على سير العمل هذا ، بما في ذلك تجزئة المرحلة العكسية عالية في عدم الاتصال بـ pH من الببتيدات قبل إجراء الإثراء ، وإدراج إعدادات تجزئة الببتيد الأكثر تقدمًا في متعدد القطب لتوجيه الأيون. أيضا، تنظيف أكثر كفاءة من العينة باستخدام المكونات القائمة على مرشح من أجل الاحتفاظ حبات الأجسام المضادة يؤدي إلى مزيد من التحديد للببتيدات diGly. هذه التحسينات تؤدي إلى الكشف الروتيني لأكثر من 23،000 الببتيدات diGly من خلايا سرطان عنق الرحم البشرية (هيلا) التحلل على تثبيط البروتينفي الخلية. نظهر فعالية هذه الاستراتيجية للتحليل المتعمق لمحات كليوموكلوتينوم من عدة أنواع مختلفة من الخلايا وفي عينات الجسم الحي، مثل أنسجة الدماغ. تقدم هذه الدراسة إضافة أصلية إلى صندوق الأدوات لتحليل انتشار البروتين للكشف عن كل يوم في كل مكان خلوي عميق.

البروتينات في كل مكان ترك 114.04 دا بقايا diglycine على بقايا الليسين الهدف عندما يتم هضم البروتينات مع التربسين. تم استخدام الفرق الكتلي الناجم عن هذا الزخرف ة للتعرف بشكل لا لبس فيه على موقع التعامي في تجربة قياس الطيف الكتلي. الاستراتيجية التي نصفها هنا هي طريقة حديثة لإثراء ?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry at JoVE.com

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

نحن نقدم طريقة لتنقية والكشف وتحديد الببتيدات diGly التي تنشأ من البروتينات في كل مكان من عينات بيولوجية معقدة. الطريقة المعروضة قابلة للاستنساخ وقوية وتتفوق على الأساليب المنشورة فيما يتعلق بمستوى عمق تحليل كل يوم.

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

التعديل ما بعد الترجمة من البروتينات من قبل ubiquitin البروتين الصغيرة تشارك في العديد من الأحداث في الخلية. تقدم هذه الدراسة إضافة أصلية إلى صندوق الأدوات لتحليل البروتين في كل مكان. نستخدم تقنيات التخصيب وقياس الطيف الكتلي للكشف عن كل مكان.لقد قمنا بالعديد من التحسينات على تحليل الببتيدات الديجلي التي تنشأ من البروتينات في كل مكان. وتشمل هذه تجزئة الببتيد الخام قبل التخصيب، وتطبيق إعدادات تجزئة الببتيد الأكثر تقدما في أوربيرابراب. بالإجمال ينتج هذا في تغطية كبيرة من ال فيوبيكيتينومي.13- يصعب وصف عدة جوانب من البروتوكول بالكلمات. إن تصور بعض الخطوات الأساسية ضروري للتمكن من تكرار هذه التحليلات من قبل مشغل مختلف في مختبر مختلف. سيتم إثبات الإجراء من قبل كاريل بيزستاروستي، وهو فني كبير في مختبري.ابدأ من خلال إعداد الخلايا المستزرعة أو أنسجة دماغ الماوس للتجربة. إذا كان العمل مع الخلايا، lyse بيليه الخلية من واحد 150 سم مربع لوحة الثقافة في مليلترين من الجليد البارد، 50 ملليمولار تريس HCL مع 0.5٪ إزالة الصوديوم. يغلي المزيج في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.ثم سونيكات عليه في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إذا كان استخدام في أنسجة الدماغ الماوس vivo, lyse في عازلة الجليد الباردة التي تحتوي على 100 ملليمولار تريس HCL, 12 ميليمولار الصوديوم ديوكسيكولات و 12 ميليمولار الصوديوم N-lauroylsarcosinate. سونيكات لlysate لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.ثم يغلي لمدة خمس دقائق في 95 درجة مئوية. المقبل, quantitate كمية البروتين الإجمالي باستخدام كمية قياس القيمة امتصاص BCA البروتين عدة فحص البروتين, التي ينبغي أن يكون على الأقل عدة ملليغرام لdiGly الببتيد المناعي الناجح. بالنسبة لتجارب SILAC، اخلطي البروتينات الخفيفة والثقيلة المسماة بنسبة واحدة إلى نسبة واحدة بناءً على إجمالي كمية البروتين.خفض جميع البروتينات مع خمسة 1DTT ميليمولار لمدة 30 دقيقة في 50 درجة مئوية. وبعد ذلك alkylate لهم مع iodoacetamide 10 ملليمتر لمدة 15 دقيقة في الظلام. ثم قم بإجراء هضم البروتين مع ليس-سي لمدة أربع ساعات.والتبسين الهضم بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية، أو في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي، تقسيم العينة إلى اثنين من أنابيب Eppendorf ملليلتر وإضافة TFA إلى العينة هضم إلى تركيز نهائي من 0.5٪ الطرد المركزي في 10، 000 مرات G لمدة 10 دقائق لترسب وإزالة جميع المنظفات. جمع الببتيد الذي يحتوي على افرا لتجزئة لاحقة.استخدام ارتفاع درجة اله عكس المرحلة C18 اللوني لكسر الببتيدات التربتيك. إعداد فارغة ستة ملليلتر خرطوشة العمود مليئة 0.5 غرام من مادة المرحلة الثابتة لحوالي 10 ملليغرام من البروتين هضم. قم بتحميل الببتيدات على العمود المعد وغسله بحوالي 10 مجلدات تبلغ 0.1٪ TFA، متبوعة بـ 10 كميات من الماء.Elute الببتيدات في ثلاثة كسور باستخدام 10 مجلدات العمود من 10 ميليمولار الامونيوم formate مع سبعة, 13.5 و 50٪ الأسيتريتريل, على التوالي. ثم، ليه جميع الكسور. دفعة واحدة من بقايا ubiquitin عزر الأجسام المضادة مترافقة إلى البروتين يتم تقسيم الطين حبة agarose إلى ستة كسور متساوية.قم بذوبان كسور الببتيد الثلاثة وفقًا لاتجاهات المخطوطة وتدور على الحطام. إضافة عظمى من الكسور الثلاثة إلى الطين حبة مع الحفاظ على الكسور الثلاثة الأخرى على الجليد. واحتضانهم لمدة ساعتين في أربع درجات مئوية على وحدة دوار.ثم، تدور أسفل الخرز. نقل المافع إلى دفعة جديدة من الخرز. وكرر الحضانة مع كسور الطين الخرز الثلاثة المتبقية.تخزين االستفنات لتحليل البروتيوم العالمي اللاحقة. ونقل الخرز إلى 200 نصائح ماصة ميكروليت مجهزة قابس مرشح GFF. وضع النصائح في أنابيب 1.5 ملليلتر مجهزة محول تلميح الطرد المركزي وغسل الخرز ثلاث مرات مع 200 ميكرولترات من الجليد الباردة IAP العازلة، تليها ثلاثة يغسل مع الماء النقي الباردة الجليد.تدور أسفل الأعمدة في 200 مرة G لمدة دقيقتين بين يغسل، مع التأكد من عدم السماح للعمود الجاف. بعد الغسيل النهائي، وpeute الببتيدات مع دورتين في 50 ميكرولترات من 0.15٪ TFA. Desalt الببتيدات مع طرف المرحلة C18 وتجفيفها مع الطرد المركزي فراغ.تنفيذ تجارب LC-MS/MS على مطياف الكتلة الحساسة مقرونة بنظام LC تدفق نانوي. تم إعداد العمود وفقاً لتوجهات المخطوطات ويتم الاحتفاظ به عند درجة حرارة 50 درجة مئوية. تشغيل مطياف الكتلة في وضع الحيازة المعتمدة على البيانات.جمع أطياف كتلة MS1 بدقة عالية مع وضع هدف متحكم فيه ربح آلي من 4E5 ووقت حقن أقصى 50 مللي ثانية. إجراء تحليل لقياس الطيف الشامل في الوضع الأول الأكثر كثافة، وذلك باستخدام طريقة السرعة القصوى مع وقت دورة إجمالية من ثلاث ثوان. ثم تنفيذ جولة ثانية من تحليل MS DDA في الوضع الأول على الأقل مكثفة، والتي سوف تضمن الكشف الأمثل للببتيدات وفرة منخفضة.تصفية أيونات السلائف وفقا للدول تهمة بهم وتكليف ذروة monoisotopic. واستبعاد السلائف التي تم استجوابها سابقاً بشكل ديناميكي لمدة 60 ثانية. عزل السلائف الببتيد مع مرشح كتلة رباعية الروبولي تعيين إلى عرض 1.6 طومسون.ثم جمع أطياف MS2 في فخ أيون في السيطرة على اكتساب الآلي من 7E3 مع وقت الحقن الأقصى من 50 مللي ثانية وHCD الطاقة الاصطدام 30٪ تحليل الطيف الشامل الملفات الخام باستخدام محرك بحث مناسب، مثل جناح البرمجيات MaxQuant المتاحة مجانا على أساس محرك البحث أندروميدا. افتح MaxQuant وحدد ملفات البيانات الخام المناسبة. تعيين عدد المعالجات وانقر على علامة التبويب المعلمات المجموعة محددة.حدد الهضم، والسماح لثلاثة انشقاقات غاب. ثم حدد التعديلات وإضافة diGly إلى التعديلات المتغير. حدد علامة التبويب المعلمات العمومية وإضافة قاعدة بيانات تسلسل البروتين الصحيح.اترك الإعدادات الأخرى كإعدادات افتراضية واضغط على البدء لإجراء بحث قاعدة البيانات. للتحليل الكمي لملفات تجربة سيلاك، قم بتعيين التعدد إلى اثنين، وحدد تسميات الأحماض الأمينية الثقيلة. عند الانتهاء من البحث، استيراد الملفات النصية إلى Perseus.وقد استخدم هذا البروتوكول لتحديد مواقع في كل مكان في البروتينات من الخلايا المستزرعة وفي المواد الحية عن طريق الكشف عن الببتيدات diGly مع نانو فلوس LC-MS/MS. وقد أدخلت تحسينات عديدة على البروتوكول القائم مما أدى إلى ارتفاع عدد الببتيدات التي تم اكتشافها. تم إجراء تجزئة فجة إلى ثلاثة أجزاء قبل التناعي.واحد من الكسور يحتوي على ubiquitin الخاصة K48 تعديل الببتيد ديجلي ديجلي، والتي تتميز ذروة واسعة في الكرومومات LC. وعلاوة على ذلك، تم تعديل نظام تفتيت الببتيد للجمع بين LC-MS يعمل مع أعلى وأدنى أنظمة التفتيت الأولى في إجراء تحليل البيانات، والتي أنتجت أكثر من 4000 ببتيدات تحللية فريدة إضافية. يمكن تحديد أكثر من 23,000 ببتيدات diGly بشكل روتيني من عينة واحدة من خلايا HeLa المعالجة بمثبطات بروتية.ومن بين جميع الببتيدات التي تم تحديدها على مدى ثلاث شاشات متماثلة بيولوجية، كان هناك أكثر من 9,000 في كل ثلاث شاشات، في حين كان هناك أكثر من 17,000 في اثنين على الأقل من ثلاثة تكرارات. عدد من تحديد الببتيد يتوقف إلى حد كبير على كمية المواد المدخلة. ويمكن توقع عدد تقريبي من الببتيدات diGly المحددة اعتمادا على المواد الأولية، ولكن هذه الأرقام هي فقط تقديرات، وسوف تعتمد أيضا على نوع من مطياف الكتلة المستخدمة.عند تنفيذ هذا البروتوكول ، والخبرة السابقة مع الطيف الشامل أساليب البروتيوميات القائمة والتعامل مع وتحليل كميات عينة دقيقة سيكون من المفيد بالتأكيد. ويمكن استبدال برنامج MaxQuant بأي خوارزمية أخرى للبحث في قواعد البيانات. ويمكن أيضا أن تستخدم نوع مختلف من مطياف الشامل.قد تختلف النتائج من حيث تحديد الببتيد قليلاً، ولكن هذا هو نموذجي لأي قياس الطيفي الشامل القائم على البروتيوميكس. Ubiquitin مهم في التقدم لتدهور البروتين بوساطة، ولكن أيضا يلعب دورا في العديد من العمليات الأخرى في الخلية. معرفة أعمق من ubiquitin باعتبارها تعديل ما بعد الترجمة أمر بالغ الأهمية لفهم وظيفتها بشكل أفضل.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

سهل التلاعب بأبنية في الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين لتطبيقات ثقافة الخلية

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

التنميط البروتين العميق بوسم إيسوباريك وواسعة النطاق اللوني السائل والطيف الكتلي وساعدت برامج القياس الكمي

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

الإعداد الأمثل من الفورمالين الثابتة عينات الببتيد تستند إلى مصفوفة بمساعدة الليزر التصوير مهام سير العمل الطيف الكتلي الامتزاز/التأين

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

إعداد عينة لمسبار Electrospray قياس الطيف الكتلي

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

التحديد الكمي المطلق لاستقلاب تخليق البروتين الخالي من الخلايا بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

منصة قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين والديوتريوم (HDX-MS) للتحقيق في إنزيمات الببتيد التركيب الحيوي

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...