Name: detection of protein ubiquitination sites by peptide enrichment and mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00
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这项工作是荷兰蛋白质组学中心项目"工作中的蛋白质"项目的一部分，该项目由荷兰科学研究组织（NWO）资助，作为国家路线图大规模研究设施（项目编号184.032.201）的一部分。).

此处描述的所有方法均已获得伊拉斯谟 MC 机构动物护理和使用委员会 （EDC） 的批准。
1. 样品制备
<ol><li>培养细胞<ol>
<li>选择感兴趣的细胞系（例如，HeLa或骨肉瘤[U2OS]细胞），并在Dulbecco的最小鹰中（DMEM）中生长细胞，并辅以10%热灭活胎儿牛血清（FBS）和100单位/mL青霉素/链霉素。</li>
		<li>对于定量蛋白质组学实验，DMEM中的培养细胞缺乏精氨酸和莱氨酸。该介质必须补充10%...

<ol>
	<li>Clague, M. J., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+Same+molecule,+different+degradation+pathways.">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li><li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy:+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture.">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li><li>Bergink, S., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+ubiquitin+and+SUMO+modifications+in+DNA+repair.">Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair.</a> Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).</li><li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Code.">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li><li>Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+Linkage-Specific+Affimers+Reveal+Insights+into+K6-Linked+Ubiquitin+Signaling.">Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling.</a> Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).</li><li>Swatek, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+ubiquitin+chain+architecture+using+Ub-clipping.">Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping.</a> Nature. 572, 533-537 (2019).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analyses+Reveal+Divergent+Ubiquitylation+Site+Patterns+in+Murine+Tissues.">Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).</li><li>Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+Ubiquitylation+and+Phosphorylation+Signaling+in+Rapamycin-treated+Yeast+Cells.">Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).</li><li>Elia, A. E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomic+Atlas+of+Ubiquitination+and+Acetylation+in+the+DNA+Damage+Response.">Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response.</a> Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).</li><li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proteome-wide,+Quantitative+Survey+of+In+Vivo+Ubiquitylation+Sites+Reveals+Widespread+Regulatory+Roles.">A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).</li><li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Quantification+of+in+vivo+Changes+in+Protein+Ubiquitination+following+Proteasome+and+Deubiquitinase+Inhibition.">Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).</li><li>Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+reveals+extensive+remodeling+of+the+ubiquitinome+after+perturbation+of+the+proteasome+by+dsRNA+mediated+subunit+knockdown.">Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).</li><li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling.">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li><li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides.">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li><li>Rose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Multiplexed+Quantitative+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Ubiquitylomes.">Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes.</a> Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).</li><li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+standard+absolute+quantification+(PSAQ)+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools.">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li><li>Van Der Wal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+ubiquitylation+site+detection+by+Orbitrap+mass+spectrometry.">Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. (July), (2017).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li></ol>

此处描述的协议适用于各种生物来源的样本，如培养细胞和体内组织。在所有情况下，我们确定了数千个二甘肽，前提是蛋白质总输入量至少为1毫克。使用特定抗体的富集效率很高，因为如果不应用泛化蛋白或二甘肽的浓缩程序，则从全细胞裂解物中最多只能发现100-150个非常低的多脂二甘肽。显然，敏感的质谱是获得大量二Gly鉴定的先决条件。尽管我们已经成功地使用了几种不同的质谱仪，但?...

泛蛋白与蛋白质的结合标志着蛋白酶体降解，是蛋白酶病的关键过程。泛素的C端卡博基组与目标蛋白11、22的裂氨酸-氨基组形成等肽键。此外，泛素可以附着在其他泛素模块上，导致形成均匀（即K48或K11）或分支（即异质或混合）聚氨基金结构11、3。3泛蛋白的最广为人知的功能是它在蛋白酶体降解中的作用，由K48链接的多聚丙酮介导。然而，很明显，单一和多聚二化在许多独立于蛋白酶体降解的过程中也扮演着角色。例如，K63相关链在细胞内贩运、肌营养不良退化、激酶信号和DNA损伤反应44、55等具有非降解作用。其他六种链接类型较少，它们的作用仍然在很大程度上是神秘的，尽管关于它们在细胞中功能的最初迹象正在出现，这主要是因为开发了新工具，使链接特定的检测66，7。7
质谱法已成为蛋白质组分析不可或缺的工具，如今，几乎任何生物来源的数千种不同的蛋白质都可以在单个实验中被识别。蛋白质（例如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛化）的翻译后修饰（如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛化）又提出了一层复杂性，这些蛋白质可以调节蛋白质活性。大规模识别PTM轴承蛋白也通过质谱学领域的发展成为可能。与未修改的肽相比，携带PTM的肽的渗透量相对较低，这带来了技术挑战，在质谱分析之前，一般需要生化浓缩步骤。在过去二十年中，为分析PTM开发了几种不同的具体浓缩方法。
由于蛋白质泛化在细胞中的多方面作用，因此对开发分析方法以检测蛋白质8的泛化位点有很大的需求。质谱方法的应用，导致果蝇、小鼠、,人类和酵母蛋白9、10、11、12、13、1410,11中已识别的9泛化位点数量激增。12,13,14在肽水平上开发基于免疫沉淀的浓缩策略，利用针对K-+-GG残余图案的抗体（也称为"diglycine"或"diGly"）提出了一个重大步骤。这些二甘肽是在消化泛化蛋白时产生的，使用胰蛋白酶作为蛋白酶15，16。15,
在这里，我们提出了一个优化的工作流程，以丰富使用免疫纯化和Orbitrap质谱检测的二Gly肽。结合现有工作流程的多项修改，特别是在样品制备和质谱阶段，我们现在可以从用蛋白酶体处理的HeLa细胞单个样本中常规识别超过 23，000 个二Gly 肽未经治疗的HeLa细胞的抑制剂和±10，000。我们应用了该协议，从未标记和稳定的同位素标签与氨基酸在细胞培养（SILAC）标记HeLa细胞，以及内源性样本，如脑组织。
此工作流为分析无所不在位点以揭示深层泛化值的工具系列提供了宝贵的补充。以下协议详细介绍了工作流的所有步骤。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Empore C18 Octadecyl disks</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>66883-U</td>
			<td>product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>UBPbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH130 resin, 3.5 &#956;m, 130 &#197;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nanoLC 1200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/F filter plug</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1825-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine, Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysyl Endopeptidase(LysC)</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLC oven</td>
			<td>MPI design, MS Wil GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher / Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLRP-S (300 &#197;, 50 &#181;m) polymeric reversed phase particles</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>PL1412-2K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-&#949;-GG) Kit</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>5562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036790</td>
			<td>Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein ubiquitination sites by peptide enrichment and mass spectrometry

小蛋白泛蛋白对蛋白质的翻译后修饰涉及许多细胞事件。在尝试消化泛化蛋白后，肽与裂解性菌体残留物结合到裂解酶的epsilon氨基酸组（"K-+-diglyin"或简称"diGly"）可用于追踪原始修饰部位。二甘肽的有效免疫纯化与质谱的敏感检测相结合，导致迄今发现的泛化位点数量大幅增加。我们对此工作流进行了多项改进，包括在浓缩过程之前对肽进行离线高 pH 反向相分馏，以及将更高级的肽碎片设置包含在电子路由多极中。此外，使用基于过滤器的插头更有效地清理样品，以保留抗体珠子，从而对二Gly肽产生更大的特异性。这些改进导致在细胞中的蛋白酶体抑制下，从人类子宫颈癌细胞（HeLa）细胞裂化物中常规检测23，000多二格脂肽。我们展示了此策略对几种不同细胞类型和体内样本（如脑组织）的泛素谱的深入分析的功效。本研究为蛋白质泛化分析的工具箱提供了原始添加内容，以揭示深层细胞泛化。

当蛋白质用胰蛋白酶消化时，泛化蛋白在目标莱氨酸残留物上留下114.04 Da diglycine残留物。这个图案引起的质量差异用于在质谱实验中明确识别泛化位点。我们在这里描述的策略是一种最先进的方法，用于通过纳米流LC-MS/MS浓缩和随后识别二甘肽（图1A）。在这项研究中，培养细胞和体内物质都被用作蛋白质的生物来源，但该协议与任何蛋...

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Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

我们提出了一种从复杂生物样本中泛化的蛋白质中产生的二Gly肽的纯化、检测和鉴定方法。在泛源分析的深度级别方面，该方法具有可重复性、健壮性，优于已发布的方法。

通过肽浓缩和质谱检测蛋白质泛化位点检测

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

小蛋白泛素对蛋白质的转化后修饰参与细胞中的许多事件。本研究为蛋白质泛化分析工具箱提供了原始补充。我们使用浓缩技术和质谱法来揭示深泛素。我们对源自泛素蛋白的二元肽的分析做了一些改进。其中包括浓缩前的粗肽分馏，以及在轨道中应用更先进的肽碎片设置。总之，这导致泛基的覆盖范围更大。协议的几个方面很难用语言来描述。可视化某些关键步骤对于能够在不同的实验室中由不同的操作员重复这些分析至关重要。该程序将由卡雷尔·贝兹斯塔罗斯蒂演示，他是我实验室的高级技术人员。首先为实验准备培养细胞或小鼠脑组织。如果与细胞一起使用，将细胞颗粒从一个150厘米的方形培养板中解碎，在两毫升的冰冷中，50毫升Tris HCL与0.5%的脱氧二甘酸钠。在95摄氏度下将酸盐煮沸5分钟。然后在4摄氏度下进行10分钟的声波化。如果使用体内小鼠脑组织，在含有100毫摩尔Tris HCL、12毫摩尔钠脱氧二甘酸酯和12毫摩尔钠N-劳罗伊尔斯科盐的冰冷缓冲液中解液。在4摄氏度下对酸盐进行10分钟的声波化。然后在95摄氏度下煮5分钟。接下来，使用热量测量吸收度 BCA 蛋白质测定试剂盒对总蛋白质量进行定量，该试剂盒至少应为几毫克，用于成功的二肽免疫沉淀。对于SILAC实验，根据蛋白质总量，将轻质和重标记蛋白以一对一的比例混合。在50摄氏度下，使用5毫摩尔DTT减少所有蛋白质30分钟。然后，在黑暗中用10毫摩尔碘乙酰胺来炼金，用15分钟。然后用Lys-C进行4小时的蛋白质消化。在30摄氏度或室温下过夜消化。第二天，将样品分成两毫升Eppendorf管，将TFA加入消化样品，最终浓度为0.5%，在10000倍G下离心，10分钟沉淀并去除所有洗涤剂。收集含有上能的肽，以便随后进行分馏。使用高 pH 反向相 C18 色谱对尝试肽进行分馏。准备一个空的六毫升柱盒，里面装满了 0.5 克固定相材料，用于约 10 毫克蛋白质消化。将肽加载到准备好的柱上，用大约 10 卷 0.1%TFA 洗涤，然后用 10 卷水清洗。使用10列体积10毫摩尔铵的10个多肽将肽分成三个分数，分别具有7、13.5%和50%的乙酰酸。然后，点燃所有分数。一批与蛋白质 A agarose 珠浆结合的泛素残余图案抗体被分成六个相等的分数。根据手稿方向溶解三个肽部分，然后旋转碎片。将三个分数的超自然剂添加到珠浆中，同时将其他三个分数留在冰上。并在旋转装置上孵育两小时，在4摄氏度下。然后，旋转珠子。将上一液转移到新鲜批次的珠子上。并重复孵育与剩余的三个珠浆分数。存储超生剂以进行后续全局蛋白质组分析。将珠子转移到配备 GFF 滤清器插头的 200 微升移液器尖端。将尖端放入装有离心尖端适配器的1.5毫升管中，用200微升的冰冷 IAP 缓冲液洗三次珠子，然后用冰冷纯净水洗三次。在洗涤之间以 200 次 G 向下旋转柱子两分钟，确保不要让柱子干涸。最后洗涤后，用两个周期洗两个周期，在 50 微升 0.15% TFA。用 C18 级尖端对肽进行脱盐，然后用真空离心干燥。在与纳米流LC系统耦合的敏感质谱仪上执行LC-MS/MS实验。柱子按照稿稿指示设置，保持在50摄氏度。在数据相关采集模式下操作质谱仪。以高分辨率收集 MS1 质谱，自动增益控制目标设置为 4E5，最长喷射时间为 50 毫秒。在最激烈的第一模式下执行质谱分析，使用总循环时间为三秒的最高速度方法。然后以最不激烈的第一模式进行第二轮DDA MS分析，从而确保低丰度肽的最佳检测。根据前体离子的电荷状态和单同位素峰分配过滤前体离子。并动态排除先前询问的前体 60 秒。分离肽前体，四极性质量过滤器设置为1.6汤姆森的宽度。然后收集MS2光谱在离子陷阱在自动增益控制7E3与最大注入时间50毫秒和HCD碰撞能量30%分析质谱原始文件使用适当的搜索引擎，如基于仙女座搜索引擎的免费提供的MaxQuant软件套件。打开 MaxQuant 并选择相应的原始数据文件。设置处理器数量并单击组特定参数选项卡。选择消化，并允许三个错过的裂解。然后选择修改并添加到变量修改中。选择全局参数选项卡并添加正确的蛋白质序列数据库。将其他设置保留为默认设置，然后按"开始"执行数据库搜索。对于SILAC实验文件的定量分析，将多重性设置为两个，并选择重氨基酸标签。搜索完成后，将文本文件导入 Perseus。该协议用于通过检测纳米流LC-MS/MS的二元肽，识别培养细胞和体内物质蛋白质中的泛化位点。对现有协议进行了若干改进，导致检测到的二肽数量增加。在免疫沉淀之前，对三个分数进行了粗略的分馏。其中一个分数含有泛素自己的K48改性二元肽，其特点是LC色谱图中具有宽峰。此外，对肽碎片制度进行了调整，将LC-MS运行与数据分析过程中最高的第一和最低的第一碎片制度相结合，从而产生了4000多个额外独特的二维肽。从用蛋白酶体抑制剂治疗的一个 HeLa 细胞样本中，可以常规地识别出超过 23，000 种二元肽。在三个生物复制屏里识别的所有二肽中，超过9000种存在于所有三个复制的屏幕中，而超过1.7万种存在于至少三个复制的两个中。肽鉴定的数量高度取决于输入材料的数量。根据起始材料，可以预期大约数量的已识别二元肽，但这些数字只是估计，也将取决于使用的质谱仪的类型。在执行此协议时，以前基于质谱法的蛋白质组学方法的经验以及处理和分析微小样本量肯定有利。MaxQuant 软件可以由任何其他数据库搜索算法替换。也可以使用不同类型的质谱仪。肽鉴定的结果可能略有不同，但这是典型的任何质谱学为基础的蛋白质组学测定。泛素在中化蛋白降解过程中很重要，但在细胞的许多其他过程中也起着一定的作用。对泛素作为翻译后修改的更深入的了解对于更好地了解其功能至关重要。

Research

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Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

用等压标记、广泛的液相色谱法、质谱法和软件辅助定量技术进行深层蛋白质组分析

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

多肽基基质辅助激光解吸/电离质谱成像中福尔马林固定样品的优化制备工作流

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

血管紧张蛋白II图解的硝酸分析与鉴定

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

探头电喷电镀质谱的样品制备

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

通过反相液相-质谱法对无细胞蛋白合成代谢的绝对定量

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

使用液色谱结合串联质谱法对糖皮质酶细胞脂质的定量分析

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

氢-铀交换质谱仪（HDX-MS）平台，用于研究肽生物合成酶

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...