Name: detection of protein ubiquitination sites by peptide enrichment and mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry at JoVE.com

Dette arbejde er en del af projektet "Proteiner på arbejdspladsen", et program under det nederlandske Proteomics Center finansieret af Den Nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO) som en del af den nationale køreplan Store forskningsfaciliteter (projekt nummer 184.032.201 ).

Alle de metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (EDC) under Erasmus MC.
1. Forberedelse af prøver
<ol><li>Dyrkede celler<ol>
<li>Vælg en cellelinje af interesse (f.eks HeLa eller osteosarkom [U2OS] celler) og vokse cellerne i Dulbecco's Minimal Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% varme inaktiveret føtal kvæg serum (FBS) og 100 enheder / ml penicillin / streptomycin.</li>
		<li>Til kvantitative proteomiske eksperimenter mangler dy...

<ol>
	<li>Clague, M. J., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+Same+molecule,+different+degradation+pathways.">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li><li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy:+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture.">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li><li>Bergink, S., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+ubiquitin+and+SUMO+modifications+in+DNA+repair.">Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair.</a> Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).</li><li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Code.">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li><li>Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+Linkage-Specific+Affimers+Reveal+Insights+into+K6-Linked+Ubiquitin+Signaling.">Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling.</a> Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).</li><li>Swatek, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+ubiquitin+chain+architecture+using+Ub-clipping.">Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping.</a> Nature. 572, 533-537 (2019).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analyses+Reveal+Divergent+Ubiquitylation+Site+Patterns+in+Murine+Tissues.">Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).</li><li>Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+Ubiquitylation+and+Phosphorylation+Signaling+in+Rapamycin-treated+Yeast+Cells.">Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).</li><li>Elia, A. E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomic+Atlas+of+Ubiquitination+and+Acetylation+in+the+DNA+Damage+Response.">Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response.</a> Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).</li><li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proteome-wide,+Quantitative+Survey+of+In+Vivo+Ubiquitylation+Sites+Reveals+Widespread+Regulatory+Roles.">A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).</li><li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Quantification+of+in+vivo+Changes+in+Protein+Ubiquitination+following+Proteasome+and+Deubiquitinase+Inhibition.">Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).</li><li>Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+reveals+extensive+remodeling+of+the+ubiquitinome+after+perturbation+of+the+proteasome+by+dsRNA+mediated+subunit+knockdown.">Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).</li><li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling.">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li><li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides.">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li><li>Rose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Multiplexed+Quantitative+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Ubiquitylomes.">Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes.</a> Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).</li><li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+standard+absolute+quantification+(PSAQ)+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools.">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li><li>Van Der Wal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+ubiquitylation+site+detection+by+Orbitrap+mass+spectrometry.">Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. (July), (2017).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li></ol>

Den protokol, der er beskrevet her, blev anvendt på prøver fra forskellige biologiske kilder, såsom dyrkede celler og in vivo-væv. I alle tilfælde identificerede vi tusindvis af diGly peptider, forudsat at den samlede proteintilførselsmængde var mindst 1 mg. Tilsætningen ved hjælp af specifikke antistoffer er yderst effektiv, da der kun blev identificeret 100-150 meget lave diGly peptider fra hele cellelysater, hvis der ikke blev anvendt nogen berigelsesprocedurer for ubiquitinerede proteiner eller diGly peptide...

Konjugeringen af ubiquitin til proteiner markerer dem for nedbrydning af proteasomet og er en afgørende proces i proteostasis. C-terminal carboxyl gruppen af ubiquitin danner en isopeptid obligation med lysin ε-amino gruppe af målet protein1,2. Desuden kan ubiquitin fastgøres til andre ubiquitinmoduler, hvilket resulterer i dannelse af homogene (dvs.1,3 Den mest kendte funktion ubiquitin er dens rolle i proteasomal nedbrydning, medieret af K48-linked polyubiquitin. Men det er blevet klart, at både mono- såvel som polyubiquitination også spiller roller i mange processer, der er uafhængige af nedbrydning af proteasomet. For eksempel har K63-forbundne kæder ikke-nedbrydende roller i intracellulær handel, lysosomal nedbrydning, kinase signalering, og DNA-skader svar4,5. De øvrige seks koblingstyper er mindre rigelige, og deres roller er stadig i vid udstrækning gådefulde, selv om de første indikationer om deres funktioner i cellen er ved at opstå, hovedsagelig på grund af udviklingen af nye værktøjer til at muliggøre sammenkædningsspecifik detektion6,7.
Massespektrometri er blevet et uundværligt redskab til proteomanalyser, og i dag kan tusindvis af forskellige proteiner fra stort set alle biologiske kilder identificeres i et enkelt eksperiment. Et yderligere lag af kompleksitet præsenteres ved posttranslationelle modifikationer (PTMs) af proteiner (f.eks. fosforylering, methylering, acetylation og allestedsnærværelse), som kan modulere proteinaktivitet. Det er også blevet muligt at identificere PTM-bærende proteiner i stor skala som følge af udviklingen inden for massespektrometriområdet. Den relativt lave stoichiometri af peptider med PTMs sammenlignet med deres umodificerede modstykker udgør en teknisk udfordring, og biokemiske berigelsestrin er generelt nødvendige forud for massespektrometrianalysen. I løbet af de sidste to årtier er der udviklet flere forskellige specifikke tilsætningsmetoder til analyse af ptm'er.
På grund af de mangefacetterede roller protein allestedsnærværende i cellen, der er en stor efterspørgsel efter udvikling af analytiske metoder til påvisning af allestedsnærværende steder på proteiner8. Anvendelsen af massespektrometriske metoder har ført til en eksplosion af antallet af identificerede allestedsnærværende steder i frugtflue, mus, menneske og gær proteiner9,10,11,12,13,14. Et vigtigt skridt blev præsenteret ved udviklingen af immunudfældningsbaserede berigelsesstrategier på peptidniveau ved hjælp af antistoffer rettet mod K-ε-GG-restmotivet (også kaldet »diglycine« eller »diGly«). Disse diGly peptider er produceret ved fordøjelsen af ubiquitinated proteiner ved hjælp af trypsin som protease15,16.
Her præsenterer vi en optimeret arbejdsgang for at berige diGly peptider ved hjælp af immunrensning og efterfølgende detektion af Orbitrap massespektrometri. Ved hjælp af en kombination af flere ændringer af eksisterende arbejdsgange, især i prøveforberedelsen og massespektrometristadierne, kan vi nu rutinemæssigt identificere mere end 23.000 diGly peptider fra en enkelt prøve af HeLa-celler behandlet med et proteasom og ~10.000 fra ubehandlede HeLa-celler. Vi har anvendt denne protokol på lysater fra både umærkede og stabile isotopmærkning med aminosyrer i cellekultur (SILAC) mærket HeLa-celler samt endogene prøver såsom hjernevæv.
Denne arbejdsgang præsenterer en værdifuld tilføjelse til repertoiret af værktøjer til analyse af allestedsnærværende steder for at afdække den dybe ubiquitinom. Følgende protokol beskriver alle trin i arbejdsprocessen i detaljer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Empore C18 Octadecyl disks</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>66883-U</td>
			<td>product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>UBPbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH130 resin, 3.5 &#956;m, 130 &#197;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nanoLC 1200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/F filter plug</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1825-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine, Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysyl Endopeptidase(LysC)</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLC oven</td>
			<td>MPI design, MS Wil GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher / Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLRP-S (300 &#197;, 50 &#181;m) polymeric reversed phase particles</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>PL1412-2K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-&#949;-GG) Kit</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>5562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036790</td>
			<td>Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein ubiquitination sites by peptide enrichment and mass spectrometry

Den posttranslationelle ændring af proteiner af den lille protein ubiquitin er involveret i mange cellulære begivenheder. Efter tryptisk fordøjelse af ubiquitinerede proteiner kan peptider med en diglycine rest konjugeret til epsilon aminogruppen af lysin ('K-ε-diglycine' eller blot 'diGly') bruges til at spore tilbage det oprindelige modifikationssted. Effektiv immunrensning af diGly peptider kombineret med følsom påvisning ved massespektrometri har resulteret i en enorm stigning i antallet af allestedsnærværende steder identificeret up to date. Vi har foretaget flere forbedringer af denne arbejdsgang, herunder offline høj pH reverse-fase fraktionering af peptider forud for berigelse procedure, og inddragelse af mere avancerede peptid fragmentering indstillinger i ion routing multipole. Også mere effektiv oprydning af prøven ved hjælp af et filter-baseret stik for at bevare antistofperlerne resulterer i en større specificitet for diGly peptider. Disse forbedringer resulterer i rutinemæssig påvisning af mere end 23,000 diGly peptider fra humane livmoderhalskræft celler (HeLa) celle lysater på proteasomhæmning i cellen. Vi viser effekten af denne strategi for dybdegående analyse af ubiquitinomprofiler af flere forskellige celletyper og af in vivo-prøver, såsom hjernevæv. Denne undersøgelse præsenterer en original tilføjelse til værktøjskassen for protein allestedsnærværende analyse for at afdække den dybe cellulære ubiquitinom.

Ubiquitinated proteiner efterlader en 114.04 Da diglycine rest på målet lysinrester, når proteinerne er fordøjet med trypsin. Masseforskellen forårsaget af dette motiv blev brugt til utvetydigt at genkende stedet for allestedsnærværelse i et massespektrometrieksperiment. Den strategi, vi beskriver her, er en state-of-the-art metode til berigelse og efterfølgende identifikation af diGly peptider ved nanoflow LC-MS/ MS (Figur 1A). I den...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry at JoVE.com

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Vi præsenterer en metode til rensning, påvisning og identifikation af diGly peptider, der stammer fra ubiquitinated proteiner fra komplekse biologiske prøver. Den præsenterede metode er reproducerbar, robust og overgår offentliggjorte metoder med hensyn til dybden af ubiquitinomanalysen.

Påvisning af proteinubiquitinationssteder ved peptidberigelse og massespektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Den post translationelle modifikation af proteiner af det lille protein ubiquitin er involveret i mange begivenheder i cellen. Denne undersøgelse præsenterer en original tilføjelse til værktøjskassen for protein ubiquitination analyse. Vi bruger berigelsesteknikker og massespektrometri til at afdække det dybe ubiquitinome.Vi har foretaget flere forbedringer til analysen af diGly peptider, der stammer fra ubiquitinerede proteiner. Disse omfatter rå peptid fraktionering før berigelse, og anvendelsen af mere avancerede peptid fragmentering indstillinger i Orbitrap. Alt i alt dette resulterer i en større dækning af ubiquitinome.Flere aspekter af protokollen er vanskelige at beskrive i ord. Visualisering af nogle af de vigtigste trin er afgørende for at kunne gentage disse analyser af forskellige operatører i et andet laboratorium. Proceduren vil blive demonstreret af Karel Bezstarosti, der er en ledende tekniker i mit laboratorium.Begynd med at forberede dyrkede celler eller mus hjernevæv til eksperimentet. Hvis der arbejdes med celler, lyse celle pellet fra en 150 centimeter kvadreret kultur plade i to milliliter iskold, 50 millimolar Tris HCL med 0,5% natrium deoxycholate. Kog lysatet ved 95 grader Celsius i fem minutter.Derefter sonikere det ved fire grader Celsius i 10 minutter. Hvis der skal bruge in vivo mus hjernevæv, lyse det i en iskold buffer indeholdende 100 millimolar Tris HCL, 12 millimolar natrium deoxycholate og 12 millimolar natrium N-lauroylsarcosinate. Sonikere lysatet i 10 minutter ved fire grader Celsius.Derefter koges det i fem minutter ved 95 grader Celsius. Dernæst mængdesmængde det samlede protein beløb ved hjælp af en kalorimetrisk absorbans BCA protein assay kit, som bør være mindst flere milligram for vellykket diGly peptid immunoprecipation. Til SILAC-eksperimenter blandes de lette og tunge mærkede proteiner i et forhold på 1-1 baseret på den samlede proteinform.Reducer alle proteiner med fem millimolar DTT i 30 minutter ved 50 grader Celsius. Og efterfølgende alkylerede dem med 10 millimolar iodoacetamid i 15 minutter i mørke. Derefter udføre protein fordøjelse med Lys-C i fire timer.Og trypsin fordøjelse natten over ved 30 grader Celsius, eller ved stuetemperatur. Den næste dag opdeles prøven i to to milliliter Eppendorf-rør, og TFA tilsættes den fordøjede prøve til en endelig koncentration på 0,5 %Centrifuge den ved 10.000 gange G i 10 minutter for at udfælde og fjerne alt vaskemiddel. Peptid, der indeholder supernatant, opsamls til efterfølgende fraktionering.Brug høj pH omvendt fase C18 kromatografi til at fraktionere tryptiske peptider. Forbered en tom seks milliliter kolonne patron fyldt med 0,5 gram stationærfase materiale til omkring 10 milligram protein fordøje. Læg peptiderne på den forberedte kolonne, og vask den med ca. 10 volumener på 0,1% TFA efterfulgt af 10 volumener vand.Peptider ne eluteres i tre fraktioner med 10 kolonnevolumener på henholdsvis 10 millimolar ammonium formate med henholdsvis syv, 13,5 og 50%acetonitril. Derefter litholyse alle fraktioner. Et parti ubiquitin rest motiv antistoffer konjugeret til protein A agarose perle gylle er opdelt i seks lige store fraktioner.Opløs de tre peptid fraktioner i henhold til manuskriptet retninger og spin ned snavs. Tilsæt supernatanterne af de tre fraktioner til perleslæden, mens de øvrige tre fraktioner opbevares på is. Og inkuber dem i to timer ved fire grader Celsius på en rotator enhed.Drej derefter perlerne ned. Overfør supernatant til en frisk parti perler. Og gentag inkubationen med de resterende tre perle gylle fraktioner.Opbevar supernatanterne til efterfølgende global proteomanalyse. Og overfør perlerne til 200 mikroliterpipettespidser udstyret med et GFF filterstik. Sæt spidserne i 1,5 milliliter rør udstyret med en centrifuge spids adapter og vask perlerne tre gange med 200 mikroliter iskold IAP buffer, efterfulgt af tre vasker med iskoldt renset vand.Drej kolonnerne ned ved 200 gange G i to minutter mellem vaskene, og sørg for ikke at lade kolonnen løbe tør. Efter den endelige vask, elutere peptider med to cyklusser på 50 mikroliter af 0,15% TFA. Afsalt pepderne med en C18 fase spids og tør dem med vakuum centrifugering.Udføre LC-MS/MS-eksperimenter på et følsomt massespektrometer, der er koblet til et nanoflow-LC-system. Kolonnen er sat op i henhold til manuskript retninger og holdes på 50 grader Celsius. Arbejd massespektrometeret i dataafhængig anskaffelsestilstand.Opsaml MS1-massespektrene ved høj opløsning med en automatiseret forstærkningskontrolleret målindstilling på 4E5 og en maksimal injektionstid på 50 millisekunder. Udfør massespektrometrianalysen i den mest intense første tilstand ved hjælp af tophastighedsmetoden med en samlet cyklustid på tre sekunder. Derefter udføre en anden runde af DDA MS analyse i mindst intens første tilstand, som vil sikre optimal påvisning af lav overflod peptider.Filtrer forløberen i henhold til deres ladning stater og monoisotopisk peak opgave. Og udelukke tidligere forhørte prækursorer dynamisk i 60 sekunder. Isoler peptidprækursorer med et firdobbelt massefilter indstillet til en bredde på 1,6 Thomson.Derefter indsamle MS2 spektre i ionfælden ved en automatiseret gevinst kontrol af 7E3 med en maksimal injektionstid på 50 millisekunder og HCD kollision energi på 30% Analysér massespektrometri rå filer ved hjælp af en passende søgemaskine, såsom frit tilgængelige MaxQuant software suite baseret på Andromeda søgemaskine. Åbn MaxQuant, og vælg de relevante rådatafiler. Angiv antallet af processorer, og klik på fanen Gruppespecifikke parametre.Vælg fordøjelse, og giv mulighed for tre mistede spaltninger. Vælg derefter ændringer, og føj diGly til de variable ændringer. Vælg fanen Globale parametre, og tilføj den korrekte proteinsekvensdatabase.Lad de andre indstillinger være standard, og tryk på Start for at udføre databasesøgningen. For kvantitativ analyse af SILAC eksperiment filer, indstille mangfoldighed til to, og vælg de tunge aminosyre etiketter. Når søgningen er færdig, skal du importere tekstfilerne til Perseus.Denne protokol blev anvendt til at identificere ubiquitinationssteder i proteiner fra dyrkede celler og in vivo-materiale ved at detektere diGly peptider med nanoflow LC-MS/MS. Der blev foretaget flere forbedringer af den eksisterende protokol, hvilket resulterede i et højere antal påviste diGly-peptider. Der blev udført en rå fraktionering i tre fraktioner før immunafslutning.En af fraktionerne indeholder ubiquitins eget K48 modificerede tryptisk diGly peptid, som er kendetegnet ved en bred top i LC-kromatogrammet. Desuden blev peptidfragmenteringen justeret for at kombinere LC-MS-kørslerne med de højeste første og laveste første fragmenteringsordninger i dataanalyseproceduren, som producerede mere end 4.000 yderligere unikke diGly peptider. Mere end 23.000 diGly peptider kan rutinemæssigt identificeres fra en enkelt prøve af HeLa celler behandlet med en proteasomhæmmer.Af alle diGly peptider identificeret over tre biologiske replikat skærme, mere end 9, 000 var til stede i alle tre, mens mere end 17,000 var til stede i mindst to ud af tre replikater. Antallet af peptididentifikationer er stærkt betinget af mængden af inputmateriale. Et omtrentligt antal identificerede diGly peptider kan forventes afhængigt af udgangsmaterialet, men disse tal er kun skøn og vil også afhænge af den anvendte type massespektrometer.Når du udfører denne protokol, forudgående erfaring med massespektrometri baseret proteomics metoder og håndtering og analysere minutter prøve beløb ville helt sikkert være en fordel. MaxQuant-softwaren kan erstattes af enhver anden databasesøgningsalgoritme. Der kan også anvendes en anden type massespektrometer.Resultaterne i form af peptid identifikationer kan lidt forskellige, men dette er typisk for enhver masse spektrometri baseret proteomics assay. Ubiquitin er vigtig i udviklingen af medieret protein nedbrydning, men spiller også en rolle i mange andre processer i cellen. Dybere kendskab til ubiquitin som en post translationel modifikation er afgørende for bedre at forstå dens funktion.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Let Manipulation af arkitekturer i Protein-baseret Hydrogels til celle kultur applikationer

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyb proteomet profilering af Isobar mærkning, omfattende væskekromatografi, massespektrometri og Software-assisteret kvantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal forberedelse af Formalin fast prøver for peptid baseret Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation massespektrometri Imaging arbejdsprocesser

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til Sonde Elektrospray Ionization Mass Spektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantificering af celle frit protein syntese metabolisme ved omvendt fase-væskekromatografi-massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

En platform for hydrogendeuteriumudvekslingsmassespektrometri (HDX-MS) til undersøgelse af peptidbiosyntetiske enzymer

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...