Name: detection of protein ubiquitination sites by peptide enrichment and mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry at JoVE.com

עבודה זו היא חלק מהפרוייקט "חלבונים בעבודה", תוכנית של הולנד פרוטאומניקס מרכז ממומן על ידי הארגון הולנד למחקר מדעי (NWO) במסגרת מפת הדרכים הלאומית מתקנים מחקר בקנה מידה גדול (מספר פרוייקט 184.032.201 ).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (EDC) של ארסמוס MC.
1. הכנה לדוגמא
<ol><li>תאים מתורבתים<ol>
<li>בחר קו תא של עניין (למשל, הלה או אוסטאוסרקומה [U2OS] תאים) ולגדול את התאים בינונית נשר מינימלי של דולבקה (DMEM) שיושלם עם 10% חום בלתי מופעל באמצעות סרום העוברי ...

<ol>
	<li>Clague, M. J., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+Same+molecule,+different+degradation+pathways.">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li><li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy:+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture.">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li><li>Bergink, S., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+ubiquitin+and+SUMO+modifications+in+DNA+repair.">Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair.</a> Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).</li><li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Code.">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li><li>Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+Linkage-Specific+Affimers+Reveal+Insights+into+K6-Linked+Ubiquitin+Signaling.">Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling.</a> Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).</li><li>Swatek, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+ubiquitin+chain+architecture+using+Ub-clipping.">Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping.</a> Nature. 572, 533-537 (2019).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analyses+Reveal+Divergent+Ubiquitylation+Site+Patterns+in+Murine+Tissues.">Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).</li><li>Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+Ubiquitylation+and+Phosphorylation+Signaling+in+Rapamycin-treated+Yeast+Cells.">Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).</li><li>Elia, A. E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomic+Atlas+of+Ubiquitination+and+Acetylation+in+the+DNA+Damage+Response.">Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response.</a> Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).</li><li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proteome-wide,+Quantitative+Survey+of+In+Vivo+Ubiquitylation+Sites+Reveals+Widespread+Regulatory+Roles.">A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).</li><li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Quantification+of+in+vivo+Changes+in+Protein+Ubiquitination+following+Proteasome+and+Deubiquitinase+Inhibition.">Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).</li><li>Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+reveals+extensive+remodeling+of+the+ubiquitinome+after+perturbation+of+the+proteasome+by+dsRNA+mediated+subunit+knockdown.">Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).</li><li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling.">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li><li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides.">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li><li>Rose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Multiplexed+Quantitative+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Ubiquitylomes.">Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes.</a> Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).</li><li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+standard+absolute+quantification+(PSAQ)+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools.">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li><li>Van Der Wal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+ubiquitylation+site+detection+by+Orbitrap+mass+spectrometry.">Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. (July), (2017).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li></ol>

הפרוטוקול המתואר כאן חל על דגימות ממקורות ביולוגיים שונים, כגון תאים מתורבתים ורקמות vivo. בכל המקרים זיהינו אלפי פפטידים diGly, בתנאי הסכום הכולל של החלבון כמות היה לפחות 1 מ ג. העשרה שימוש בנוגדנים ספציפיים היא יעילה מאוד, בהתחשב בכך שרק ברוב 100-150 מאוד נמוך מאוד הפפטידים diGly זוהו מתוך ליטים תא ?...

בניין של אוביקוויב לחלבונים מסמן אותם עבור השפלה על ידי פרוטאסדום והוא תהליך מכריע ב פרוטאוסטזיס. C-טרמינל קרבוקסילי הקבוצה של הצורות אוביקוויב בקשר עם הקבוצה ליזין ε-אמינו של חלבון היעד1,2. בנוסף, אוביקוויב יכול להיות מצורף מודולים אחרים אוביקוויב, וכתוצאה מכך היווצרות של הומוגנית (כלומר, K48 או K11) או מסוקנים (כלומר1, הטרוגנית או מעורב) polyubiquitinמבנים 1,3. הפונקציה הידועה ביותר של אוביקוויב היא תפקידה השפלה פרוטאספאל, בתיווך על ידי K48 מקושרים polyubiquitin. עם זאת, התברר כי הן מונו, כמו גם polyubiquitination גם לשחק תפקידים בתהליכים רבים כי הם עצמאיים של השפלה על ידי פרוטאסדום. למשל, רשתות מקושרות K63 יש תפקידים nondegradative בסחר תאיים, השפלה ליסוזומיום, איתות קינאז, ואת הנזק DNA תגובה4,5. שישה סוגי ההצמדה האחרים הם פחות שופע ותפקידם הם עדיין במידה רבה, למרות הסימנים הראשונים על התפקודים שלהם בתא הם המתעוררים, בעיקר בגלל התפתחות של כלים חדשניים כדי לאפשר זיהוי ספציפי הצמדה6,7.
ספקטרומטר מסה הפכה כלי הכרחי עבור ניתוחים פרוטדום וכיום אלפי חלבונים שונים כמעט כל מקור ביולוגי ניתן לזהות בניסוי אחד. שכבה נוספת של מורכבות מוצגת על ידי שינויים בפוסט-שינוי (למשל, זירחון, מתילציה, מרחלציה ואוביקווינציה) אשר יכולים לווסת את פעילות החלבונים. זיהוי בקנה מידה גדול של חלבונים PTM הנושאת גם התאפשר על ידי התפתחויות בשדה ספקטרומטר המסה. הסטואיצ'ימטריה הנמוכה יחסית של פפטידים הנושאים את הדבר המקביל לעמיתיהם שאינם שונו מציג אתגר טכני ושלבי העשרה ביוכימיים נחוצים בדרך כלל לפני ניתוח הספקטרומטר ההמוני. במהלך שני העשורים האחרונים פותחו מספר שיטות העשרה ספציפיות לניתוח של "פטין".
בגלל התפקידים הרב ביותר של אוביקוויטים חלבונים בתא, יש דרישה גדולה לפיתוח שיטות אנליטיות לאיתור אתרים אוביקווינציה על חלבונים8. היישום של שיטות ספקטרומטרי המוני הוביל לפיצוץ של מספר האתרים המזוהים אוביקווילנציה בתוך מעוף פירות, עכבר, אדם, ושמרים חלבונים9,10,11,12,13,14. צעד מרכזי הוצג על ידי פיתוח אסטרטגיות העשרה המבוססות על immunoprecipitation ברמה פפטיד באמצעות נוגדנים בבימויו של K-ε-GG מוטיב שארית (המכונה גם "diglycine" או "diGly"). הפפטידים האלה מיוצרים על העיכול של חלבונים אוביקטילביים באמצעות טריפסין כפרוטאז15,16.
כאן, אנו מציגים זרימת עבודה ממוטבת כדי להעשיר את הפפטידים diGly באמצעות immunopurification ובעקבות גילוי על ידי ספקטרומטר המסה של אורדרראפ. באמצעות שילוב של מספר שינויים של זרימות עבודה קיימות, במיוחד בהכנה לדוגמה ובשלבים ספקטרומטר המסה, עכשיו אנחנו יכולים לזהות באופן שגרתי יותר מ 23,000 הפפטידים diGly ממדגם אחד של תאי הלה שטופלו עם פרוטאסדום מעכבי ו-~ 10,000 מתאי הלה לא מטופל. יש לנו להחיל את הפרוטוקול הזה כדי lysates מתוך תיוג איזוטופ יציב ו יציבה עם חומצות אמינו בתרבות התא (SILAC) המסומנים תאי הלה, כמו גם לדגימות אנדוגניים כגון רקמת המוח.
זרימת עבודה זו מציגה תוספת רבת ערך לרפרטואר של כלים לניתוח של האתרים אוביקווינציה על מנת לחשוף את אוביקוויבידום עמוק. הפרוטוקול הבא מתאר את כל השלבים של זרימת העבודה בפירוט.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Empore C18 Octadecyl disks</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>66883-U</td>
			<td>product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>UBPbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH130 resin, 3.5 &#956;m, 130 &#197;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nanoLC 1200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/F filter plug</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1825-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine, Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysyl Endopeptidase(LysC)</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLC oven</td>
			<td>MPI design, MS Wil GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher / Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLRP-S (300 &#197;, 50 &#181;m) polymeric reversed phase particles</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>PL1412-2K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-&#949;-GG) Kit</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>5562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036790</td>
			<td>Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein ubiquitination sites by peptide enrichment and mass spectrometry

השינוי הפוסט-ממדי של חלבונים על ידי החלבון הקטן אוביקוויפין מעורב באירועים סלולריים רבים. לאחר העיכול הטריפטי של חלבונים אוביקוויטיים, פפטידים עם שארית דיגליצין מצוזרת לקבוצת האמינו אפסילון של ליזין (K-ε-diglycine ' או פשוט ' diGly ') ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר האתר המקורי שינוי. החיסונית יעילה של פפטידים diGly בשילוב עם זיהוי רגיש על ידי ספקטרומטר מסה הביא לעלייה עצומה במספר האתרים אוביקווינציה שזוהו עד היום. עשינו מספר שיפורים בזרימת עבודה זו, כולל גבוהה במצב לא מקוון pH-שלב לאחור השבר של פפטידים לפני הליך העשרה, והכללת הגדרות פיצול פפטיד מתקדמות יותר ב-multipole הניתוב יונים. גם, ניקוי יעיל יותר של המדגם באמצעות תקע מבוסס מסנן כדי לשמור על חרוזים הנוגדן תוצאות ספציפיות יותר עבור פפטידים diGly. שיפורים אלה התוצאה של הגילוי השגרתי של יותר מ 23,000 diGly פפטידים מתאי סרטן צוואר הרחם האנושי (הלה) תא lysates על עיכוב פרוטאסדום בתא. אנו מראים את היעילות של אסטרטגיה זו לניתוח מעמיק של הפרופילים אוביקווינוביים של מספר סוגי תאים שונים ובדגימות vivo, כגון רקמת המוח. מחקר זה מציג תוספת מקורית לארגז הכלים עבור ניתוח אוביקווינציה חלבונים כדי לחשוף את אוביקוויבידום הסלולר עמוק.

חלבונים אוביקווילביים להשאיר את שארית 114.04 Da דה דיגליצין על השאריות ליזין היעד כאשר החלבונים מתעכלים טריפסין. ההפרש ההמוני שנגרם על-ידי מוטיב זה שימש לזיהוי משמעי של האתר של אוביקווינציה בניסוי ספקטרומטר המוני. האסטרטגיה שאנו מתארים כאן היא שיטה מתקדמת ליצירת העשרה והזד...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry at JoVE.com

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

אנו מציגים שיטה לטיהור, איתור וזיהוי של פפטידים diGly שמקורם בחלבונים אוביקטיביים מדגימות ביולוגיות מורכבות. השיטה המוצגת מופצת, איתנה, ומבצעת שיטות שפורסמו ביחס לרמת העומק של האנליזה האוביקווינופית.

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

השינוי שלאחר התרגום של חלבונים על ידי חלבון קטן ubiquitin מעורב באירועים רבים בתא. מחקר זה מציג תוספת מקורית לארגז הכלים לניתוח חלבון בכל מקום. אנו משתמשים בטכניקות העשרה ובספקטרומטריית מסה כדי לחשוף את ההכל העמוק.ביצענו מספר שיפורים בניתוח של פפטידים diGly שמקורם חלבונים בכל מקום. אלה כוללים שבר פפטיד גולמי לפני העשרה, ואת היישום של הגדרות פיצול פפטיד מתקדמות יותר Orbitrap. בסך הכל התוצאה היא כיסוי גדול יותר של ubiquitinome.קשה לתאר מספר היבטים של הפרוטוקול במילים. הדמיה של חלק מהצעדים העיקריים חיונית כדי להיות מסוגל לחזור על ניתוחים אלה על ידי מפעיל אחר במעבדה אחרת. ההליך יוכח על ידי קארל Bezstarosti, שהוא טכנאי בכיר במעבדה שלי.התחל על ידי הכנת תאים מתורבתים או רקמת המוח של העכבר לניסוי. אם עובדים עם תאים, lyse גלולת התא מצלחת אחת 150 ס"מ בריבוע תרבות בשני מיליליטר של קרח קר, 50 מילימולר טריס HCL עם 0.5% נתרן deoxycholate. מרתיחים את הלט ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.ואז sonicate אותו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אם משתמשים ברקמת המוח של עכבר vivo, lyse אותו במאגר קר קרח המכיל 100 מילימולר טריס HCL, 12 מילימולאר נתרן deoxycholate ו 12 מילימולאר נתרן N-lauroylsarcosinate. סוניקאט למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.ואז להרתיח אותו במשך חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מכמתים את כמות החלבון הכוללת באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA סופגת קלורימטרית, שאמורה להיות לפחות כמה מיליגרם לכשל חיסוני מוצלח של פפטיד diGly. לניסויי SILAC, ערבבו את החלבונים הקלים והכבדים ביחס של אחד לאחד בהתבסס על כמות החלבון הכוללת.להפחית את כל החלבונים עם 5 מילימולר DTT במשך 30 דקות ב 50 מעלות צלזיוס. ולאחר מכן אלקילאט אותם עם 10 מילימולרים iodoacetamide במשך 15 דקות בחושך. לאחר מכן לבצע עיכול חלבון עם Lys-C במשך ארבע שעות.ועיכול טריפסין לילה ב 30 מעלות צלזיוס, או בטמפרטורת החדר. למחרת, לחלק את המדגם לשני צינורות Eppendorf שני מיליליטר ולהוסיף TFA לדגימה מתעכל לריכוז הסופי של 0.5% צנטריפוגה זה ב 10, 000 פעמים G במשך 10 דקות כדי לזרז ולהסיר את כל חומר הניקוי. לאסוף את הפפטיד המכיל על טבעי עבור שברים הבאים.השתמש pH גבוה הפוך שלב C18 כרומטוגרפיה כדי לשבר את פפטידים טריפטי. הכינו מחסנית עמודים ריקה של שישה מיליליטר מלאה בחומר פאזה נייח של 0.5 גרם לכ-10 מיליגרם של תקציר חלבונים. טוענים את הפפטידים על העמוד המוכן ושוטפים אותו בכ-10 כרכים של 0.1%TFA, ואחריו 10 כמויות מים.אלתר את הפפטידים לשלושה שברים באמצעות 10 כרכים עמודה של 10 מילימור אמוניום formate עם שבעה, 13.5 ו 50% אצטוניטריל, בהתאמה. לאחר מכן, ליטוליזה כל השברים. קבוצה אחת של נוגדני מוטיב מוטיב בכל מקום מצומד חלבון תרחיף חרוז אגרוז מחולק לשישה שברים שווים.ממיסים את שלושת שברי הפפטיד לפי הוראות כתב היד ומסתובבים במורד ההריסות. מוסיפים את העל-טבעיים של שלושת השברים לתרחץ חרוזים תוך שמירה על שלושת השברים האחרים על הקרח. ותמהר אותם במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס ביחידת מסובב.לאחר מכן, סובב את חרוזים. מעבירים את העל-טבעי לקבוצה טרייה של חרוזים. ולחזור על הדגירה עם שלושת שברי תרחיף חרוזים הנותרים.אחסן את העל-טבעיים לניתוח פרוטאום גלובלי עוקב. ולהעביר את חרוזים 200 טיפים פיפטה microliter מצויד תקע מסנן GFF. שים את הטיפים לתוך 1.5 צינורות מיליליטר מצויד מתאם קצה צנטריפוגה ולשטוף את חרוזים שלוש פעמים עם 200 microliters של חיץ קרח קר IAP, ואחריו שלוש שטיפות עם מים מטוהרים קרים כקרח.סובבו את העמודים פי 200 G במשך שתי דקות בין הכביסה, ודאגו לא לתת לעמוד להתייבש. לאחר הכביסה הסופית, ללטף את הפפטידים עם שני מחזורים ב 50 microliters של 0.15% TFA. מפלים את הפפטידים עם קצה שלב C18 ומייבשים אותם בצנטריפוגה ואקום.בצע ניסויי LC-MS/MS על ספקטרומטר מסה רגיש יחד עם מערכת LC ננו-זרימה. הטור הוקם על פי הוראות כתב היד ושמור על 50 מעלות צלזיוס. הפעילו את ספקטרומטר המסה במצב רכישה תלוי נתונים.אסוף את ספקטרום המסה MS1 ברזולוציה גבוהה עם הגדרת יעד מבוקרת רווח אוטומטית של 4E5 וזמן הזרקה מרבי של 50 אלפיות שניה. בצע את ניתוח ספקטרומטריית המסה במצב הראשון האינטנסיבי ביותר, באמצעות שיטת המהירות העליונה עם זמן מחזור כולל של שלוש שניות. לאחר מכן לבצע סיבוב שני של ניתוח MS DDA במצב ראשון אינטנסיבי לפחות, אשר יבטיח זיהוי אופטימלי של פפטידים שפע נמוך.סנן את היונים המבשרים בהתאם למדינות המטען שלהם ולהצהלה מונואיזוטופית. ואל תכלול מבשרים שנחקרו בעבר באופן דינמי למשך 60 שניות. בודד מבשרי פפטיד עם מסנן מסה מרובעת מוגדר לרוחב של 1.6 תומסון.לאחר מכן לאסוף ספקטרום MS2 במלכודת היונים בשליטה אוטומטית להשיג של 7E3 עם זמן הזרקה מרבי של 50 אלפיות שנייה ואנרגיית התנגשות HCD של 30%לנתח את הספקטרומטריה מסה קבצי גלם באמצעות מנוע חיפוש מתאים, כגון חבילת תוכנה MaxQuant זמין בחופשיות המבוסס על מנוע החיפוש אנדרומדה. פתח את MaxQuant ובחר את קבצי הנתונים הגולמיים המתאימים. הגדר את מספר המעבדים ולחץ על הכרטיסיה פרמטרים ספציפיים לקבוצה.בחר עיכול, ולאפשר שלושה מחשוף שלא נענו. לאחר מכן בחרו שינויים והוסיפו דיגלי לשינויים המשתנים. בחר את לשונית הפרמטרים הגלובלית והוסף את מסד הנתונים הנכון של רצף החלבון.השאר את ההגדרות האחרות כברירת מחדל ולחץ על התחל לבצע את החיפוש במסד הנתונים. לניתוח כמותי של קבצי ניסוי SILAC, הגדר את הרבי לשניים ובחר את תוויות חומצות האמינו הכבדות. לאחר סיום החיפוש, יבא את קבצי הטקסט לתוך פרסאוס.פרוטוקול זה שימש לזיהוי אתרי בכל מקום בחלבונים מתאים מתורבתים וחומר vivo על ידי גילוי פפטידים diGly עם ננו-זרימה LC-MS/MS. מספר שיפורים נעשו בפרוטוקול הקיים אשר הביא למספרים גבוהים יותר של פפטידים diGly שזוהו. שבר גולמי לשלושה שברים בוצע לפני immunoprecipitation.אחד השברים מכיל פפטיד טריגלי שונה K48 של Ubiquitin, המאופיין בפסגה רחבה בכרומטוגרמת LC. יתר על כן, משטר פיצול פפטיד הותאם לשלב את ריצות LC-MS עם משטר הפיצול הראשון והנמוך ביותר בהליך ניתוח נתונים, אשר הפיק יותר מ 4, 000 פפטידים ייחודיים נוספים diGly. יותר מ 23, 000 פפטידים diGly ניתן לזהות באופן שגרתי מדגם אחד של תאי HeLa שטופלו מעכבי פרוטאזום.מכל הפפטידים הדיגליים שזוהו על פני שלושה מסכי שכפול ביולוגיים, יותר מ-9,000 היו נוכחים בכל השלושה, בעוד שיותר מ-17,000 היו נוכחים בלפחות שניים מתוך שלושה שכפולים. מספר זיהויי הפפטיד מותנה מאוד בכמות חומר הקלט. מספר משוער של פפטידים diGly מזוהה ניתן לצפות בהתאם לחומר ההתחלתי, אבל מספרים אלה הם רק הערכות יהיה גם תלוי בסוג של ספקטרומטר מסה בשימוש.בעת ביצוע פרוטוקול זה, ניסיון קודם עם שיטות פרוטאומיקה מבוססות ספקטרומטריית מסה וטיפול וניתוח כמויות מדגם דקות בהחלט יהיה יתרון. התוכנה MaxQuant יכול להיות מוחלף על ידי כל אלגוריתם חיפוש מסד נתונים אחר. כמו כן ניתן להשתמש בסוג אחר של ספקטרומטר מסה.התוצאות במונחים של זיהוי פפטיד עשויות להיות שונות במקצת, אבל זה אופייני לכל ספקטרומטריית מסה המבוססת על פרוטומיקה. Ubiquitin חשוב בהתקדמות של השפלת חלבון מתווך, אבל גם ממלא תפקיד בתהליכים רבים אחרים בתא. ידע מעמיק יותר של ubiquitin כשינוי שלאחר תרגום הוא חיוני כדי להבין טוב יותר את תפקידו.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...