Name: detection of protein ubiquitination sites by peptide enrichment and mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00
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この作品は、オランダ科学研究機構(NWO)が国家ロードマップの大規模研究施設(プロジェクト番号184.032.201)の一環として資金を提供するオランダ・プロテオミクス・センターのプログラム「プロテインズ・アット・ワーク」の一環です。).

ここに記載されているすべての方法は、エラスムスMCの制度的動物のケアと使用委員会(EDC)によって承認されています。
1. サンプル準備
<ol><li>培養細胞<ol>
<li>目的の細胞株(例えば、HeLaまたは骨肉腫[U2OS]細胞)を選択し、10%の熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)および100単位/mLペニシリン/ストレプトマイシンを補ったDulbeccoのミニマルイーグルミディアム(DMEM)の細胞を成長させま...

<ol>
	<li>Clague, M. J., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+Same+molecule,+different+degradation+pathways.">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li><li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy:+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture.">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li><li>Bergink, S., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+ubiquitin+and+SUMO+modifications+in+DNA+repair.">Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair.</a> Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).</li><li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Code.">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li><li>Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+Linkage-Specific+Affimers+Reveal+Insights+into+K6-Linked+Ubiquitin+Signaling.">Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling.</a> Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).</li><li>Swatek, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+ubiquitin+chain+architecture+using+Ub-clipping.">Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping.</a> Nature. 572, 533-537 (2019).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analyses+Reveal+Divergent+Ubiquitylation+Site+Patterns+in+Murine+Tissues.">Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).</li><li>Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+Ubiquitylation+and+Phosphorylation+Signaling+in+Rapamycin-treated+Yeast+Cells.">Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).</li><li>Elia, A. E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomic+Atlas+of+Ubiquitination+and+Acetylation+in+the+DNA+Damage+Response.">Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response.</a> Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).</li><li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proteome-wide,+Quantitative+Survey+of+In+Vivo+Ubiquitylation+Sites+Reveals+Widespread+Regulatory+Roles.">A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).</li><li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Quantification+of+in+vivo+Changes+in+Protein+Ubiquitination+following+Proteasome+and+Deubiquitinase+Inhibition.">Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).</li><li>Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+reveals+extensive+remodeling+of+the+ubiquitinome+after+perturbation+of+the+proteasome+by+dsRNA+mediated+subunit+knockdown.">Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).</li><li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling.">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li><li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides.">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li><li>Rose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Multiplexed+Quantitative+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Ubiquitylomes.">Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes.</a> Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).</li><li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+standard+absolute+quantification+(PSAQ)+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools.">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li><li>Van Der Wal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+ubiquitylation+site+detection+by+Orbitrap+mass+spectrometry.">Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. (July), (2017).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li></ol>

ここで説明するプロトコルは、培養細胞および生体組織などの様々な生物学的源からのサンプルに適用された。すべてのケースで、我々は、総タンパク質入力量が少なくとも1mgであることを提供し、数千のdiGlyペプチドを同定した。ユビキチン化タンパク質またはジグリーペプチドの濃縮手順が適用されていない場合、細胞全体のライセートから同定されたのは、100-150個の非常に低いジグリ?...

ユビキチンからタンパク質への結合は、プロテアソームによる分解を示すものであり、プロテオスタシスにおいて重要なプロセスです。ユビキチンのC末端カルボキシル基は、標的タンパク質11,22のリジンε-アミノ基とイソペプチド結合を形成する。また、ユビキチンは他のユビキチンモジュールに付着することができ、その結果、均質(すなわち、K48またはK11)または分岐(すなわち、不均質または混合)のポリウビキチン構造11、33の形成をもたらす。ユビキチンの最もよく知られた機能は、プロテアソーム分解におけるその役割であり、K48結合ポリウビキチンによって媒介される。しかし、モノ-とポリユビキチン化の両方が、プロテアソームによる分解とは無関係な多くのプロセスにおいて役割を果たしていることも明らかになっている。例えば、K63連結鎖は、細胞内密売、リソソーム分解、キナーゼシグナル伝達、およびDNA損傷応答44,55において非分解的役割を有する。他の6つのリンケージタイプはあまり豊富ではなく、その役割は依然としてほとんど謎めいているが、細胞内のそれらの機能に関する最初の徴候は、主にリンケージ特異的検出66、77を可能にする新しいツールの開発のために出現している。
質量分析はプロテオーム解析に欠かせないツールとなっており、現在では、事実上あらゆる生物学的源から数千種類の異なるタンパク質を1回の実験で同定することができます。複雑さの追加の層は、タンパク質活性を調節することができるタンパク質の翻訳後修飾(PTM)のタンパク質(例えば、リン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化)によって提示される。PTMを含むタンパク質の大規模同定は、質量分析分野の発展によっても可能となっています。PTMを持つペプチドの比較的低い化学測定は、その非修飾の対応物と比較して技術的な課題を提示し、一般的に質量分析の前に生化学的濃縮ステップが必要です。過去20年間、PTMの分析のためにいくつかの異なる特異的な濃縮方法が開発されました。
細胞内のタンパク質ユビキチン化の多面的役割のため、タンパク質8上のユビキチン化部位の検出のための分析方法の開発に大きな需要がある。,質量分析法の適用は、フルーツフライ、マウス、ヒト、および酵母タンパク質,,9、10、11、12、13、1410,中の9同定されたユビキチン化部位の数の爆発に至った。111213主要なステップは、K-ε-GGレムナントモチーフ('diglycine'または「diGly」とも呼ばれる)に対する抗体を用いたペプチドレベルでの免疫沈降ベースの濃縮戦略の開発によって提示された。これらのdiGlyペプチドは、プロテアーゼ15、16,16としてトリプシンを使用してユビキチン化タンパク質の消化時に産生される。
ここでは、眼窩質量分析法による免疫精製とその後の検出を用いて、diGlyペプチドを濃縮するための最適化されたワークフローを提示する。既存のワークフローのいくつかの変更の組み合わせを使用して、特にサンプル調製および質量分析段階で、プロテアソームで処理されたHeLa細胞の単一サンプルから23,000以上のdiGlyペプチドを日常的に同定できるようになりました。阻害剤および、治療されていないHeLa細胞から〜10,000。このプロトコルは、細胞培養中のアミノ酸による標識のない安定同位体(SILAC)のHeLa細胞と脳組織などの内因性サンプルの両方に、このプロトコルを適用しました。
このワークフローは、深いユビキチノメを明らかにするために、ユビキチン化部位の分析のためのツールのレパートリーに貴重な追加を提示します。次のプロトコルは、ワークフローのすべての手順を詳細に説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Empore C18 Octadecyl disks</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>66883-U</td>
			<td>product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>UBPbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH130 resin, 3.5 &#956;m, 130 &#197;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nanoLC 1200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/F filter plug</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1825-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine, Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysyl Endopeptidase(LysC)</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLC oven</td>
			<td>MPI design, MS Wil GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher / Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLRP-S (300 &#197;, 50 &#181;m) polymeric reversed phase particles</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>PL1412-2K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-&#949;-GG) Kit</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>5562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036790</td>
			<td>Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein ubiquitination sites by peptide enrichment and mass spectrometry

ユビキチンの小さなタンパク質によるタンパク質の翻訳後修飾は、多くの細胞イベントに関与しています。ユビキチン化タンパク質のトリプティック消化後、リジンのイプシロンアミノ基に結合したデグリシン残骸を有するペプチド('K-ε-diglycine'または単に「diGly」)を使用して、元の改変部位を追跡することができます。質量分析による感度検出と組み合わせたdiGlyペプチドの効率的な免疫精製は、最新のユビキチン化部位の数を大幅に増加させた。濃縮手順の前に、ペプチドのオフライン高pH逆相分画、イオンルーティング多極に、より高度なペプチド断片化設定を含めることなど、このワークフローにいくつかの改良を加えました。また、抗体ビーズを保持するためにフィルタベースのプラグを使用したサンプルのクリーンアップがより効率的に行われるため、diGlyペプチドに対する特異性が高くなります。これらの改善は、ヒト子宮頸癌細胞(HeLa)細胞の細胞リセートから23,000以上のdiGlyペプチドを細胞内のプロテアソーム阻害時に日常的に検出する結果となる。我々は、脳組織などのいくつかの異なる細胞型およびインビボサンプルのユビキチノメプロファイルの詳細な分析のためのこの戦略の有効性を示す。本研究は、深い細胞ユビキチノメを明らかにするためのタンパク質ユビキチン化分析のためのツールボックスにオリジナルの追加を提示します。

ユビキチン化されたタンパク質は、タンパク質がトリプシンで消化されると、標的リジン残基に114.04ダジグリシン残骸を残します。このモチーフによって引き起こされる質量差は、質量分析実験においてユビキチン化の部位を明確に認識するために用いられた。ここで説明する戦略は、ナノフローLC-MS/MSによるdiGlyペプチドの濃縮とその後の同定のための最先端の方法...

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Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

複雑な生体試料から生じるユビキチン化タンパク質を起源とするdiGlyペプチドの精製、検出、同定方法を紹介します。提示された方法は、ユビキチノメ分析の深さのレベルに関して、再現性、堅牢性、および優れたメソッドを上回る。

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

ユビキチンの小タンパク質によるタンパク質の翻訳後修飾は、細胞内の多くの事象に関与している。本研究は、タンパク質ユビキチン化分析のためのツールボックスに独自の追加を提示します。深いユビキチノメを発見するために濃縮技術と質量分析を使用しています。ユビキチン化タンパク質由来のdiGlyペプチドの分析を幾つか改善しました。これらには、濃縮前の粗ペプチド分画、およびOrbitrapにおけるより高度なペプチド断片化設定の適用が含まれる。全体として、ユビキチノメのより大きなカバレッジになります。プロトコルのいくつかの側面は、言葉で記述することは困難です。いくつかの重要なステップの視覚化は、異なるラボで異なるオペレータによってこれらの分析を繰り返すことができるように不可欠です。この手順は、私の研究室の上級技術者であるカレル・ベスタロスティによって実証されます。実験のために培養細胞またはマウス脳組織を準備することから始めます。細胞を使用する場合は、150センチメートル平方の培養プレートから1つの150センチメートルの2ミリリットルの氷冷、50ミリモルトリスHCL、0.5%デオキシコール酸ナトリウムを含む分解します。95°Cで5分間煮ます。その後、摂氏4度で10分間超音波処理します。生体内マウス脳組織を使用する場合は、100ミリモルトリスHCL、12ミリモルナトリウムデオキシコール酸12ミリモルモルナトリウム、12ミリモルモルナトリウムN-ラウロイルスカルソシネートを含む氷冷緩衝液でライスする。4°Cで10分間、ライセートを超音波処理します。その後、摂氏95度で5分間沸騰させます。次に、BCAタンパク質アッセイキットの熱量吸光度を用いて全タンパク量を定量し、これは、正常なdiGlyペプチド免疫沈降のために少なくとも数ミリグラムでなければならない。SILAC実験では、軽い標識タンパク質と重い標識タンパク質を、総タンパク質量に基づいて1対1の比率で混合します。5ミリモルDTTですべてのタンパク質を摂氏50度で30分間減らします。そして、その後、暗闇の中で15分間10ミリモルヨウアセトアミドでそれらをアルキル化します。その後、Lys-Cで4時間タンパク質消化を行います。そして、トリプシン消化は摂氏30度、または室温で一晩。翌日、サンプルを2本のミリリットルエペンドルフチューブに分け、消化されたサンプルにTFAを加え、10,000倍のGで10分間0.5%遠心分離機の最終濃度にして、すべての洗剤を沈殿させ、除去します。その後の分画のために上清を含むペプチドを収集する。高pH逆相C18クロマトグラフィーを使用して、トリプティックペプチドを分画します。約10ミリグラムのタンパク質消化のために0.5グラムの定常相材料で満たされた空の6ミリリットルカラムカートリッジを準備します。準備したカラムにペプチドを積み込み、約10ボリュームの0.1%TFAで洗浄し、続いて10ボリュームの水を洗浄します。ペプチドを、それぞれ7、13.5、50%アセトニトリルを有する10ミリモルアンモニウムシギマの10カラム量を用いて3つの分数に溶出する。その後、すべての分数を点灯します。タンパク質Aアガロースビーズスラリーに結合したユビキチン残骸モチーフ抗体の1つのバッチは、6等分に分割される。原稿の方向に従って3つのペプチド画分を溶解し、破片を回転させます。氷の上に他の3つの画分を保ちながら、ビーズスラリーに3つの分数の上澄み物を追加します。そして、回転器ユニット上の摂氏4度で2時間インキュベートします。次に、ビーズを回転させます。上清を新鮮なビーズのバッチに移します。残りの3つのビーズスラリー画分でインキュベーションを繰り返します。その後のグローバルプロテオーム解析のために上清を保存します。そして、GFFフィルタープラグを装備した200マイクロリットルピペットチップにビーズを移します。遠心分離機の先端アダプターを装備した1.5ミリリットルのチューブにチップを入れ、200マイクロリットルの氷冷IAPバッファーでビーズを3回洗浄し、続いて氷冷精製水で3回洗浄します。200回Gで200倍の柱を回転させ、2分間、カラムを乾燥させないようにします。最終洗浄後、0.15%TFAの50マイクロリットルで2サイクルでペプチドを溶出します。C18段先端でペプチドを脱塩し、真空遠心分離で乾燥させます。ナノフローLCシステムに結合された感度の高い質量分析計でLC-MS/MS実験を行います。列は原稿の方向に従って設定され、摂氏50度に保たれる。データ依存取得モードで質量分析計を操作します。4E5の自動ゲイン制御ターゲット設定と50ミリ秒の最大射出時間で、MS1マススペクトルを高解像度で収集します。最も強烈な第 1 モードで質量分析分析を実行し、合計サイクル時間 3 秒の最高速度法を使用します。次に、DDA MS分析の第2ラウンドを最も強い第1モードで行い、低量のペプチドの最適な検出を確実にします。前駆体イオンを電荷状態とモノアイソトピックピーク割り当てに従ってフィルターします。そして、以前に尋問された前駆体を60秒間動的に除外します。4重極質量フィルターを 1.6 トムソンの幅に設定したペプチド前駆体を分離します。その後、最大射出時間50ミリ秒の7E3の自動ゲイン制御でイオントラップ内のMS2スペクトルを収集し、HCD衝突エネルギーを30%にして、アンドロメダ検索エンジンに基づいて自由に利用できるMaxQuantソフトウェアスイートなどの適切な検索エンジンを使用して、質量分析生ファイルを分析します。MaxQuant を開き、適切な生データ ファイルを選択します。プロセッサの数を設定し、グループ固有のパラメータタブをクリックします。消化を選択し、3つの切断を逃すことを可能にします。次に、変更を選択し、変数の変更に diGly を追加します。グローバルパラメータタブを選択し、正しいタンパク質配列データベースを追加します。他の設定をデフォルトのままにして、start キーを押してデータベース検索を実行します。SILAC実験ファイルの定量分析では、多重度を2に設定し、重いアミノ酸ラベルを選択します。検索が終了したら、テキスト ファイルを Perseus にインポートします。このプロトコルは、ナノフローLC-MS/MSを用いたdiGlyペプチドを検出することによって、培養細胞およびインビボ材料からタンパク質中のユビキチン化部位を同定するために使用された。既存のプロトコルにいくつかの改良が加えられたため、検出されたdiGlyペプチドの数が多くなりました。免疫沈降前に3つの画分に粗分化を行った。画分の1つはユビキチン自身のK48修飾トリプティックジグリペプチドを含み、LCクロマトグラムの広いピークを特徴とする。さらに、ペプチド断片化レジームを調整し、LC-MSランをデータ分析手順における最も高い第1および最低の最初の断片化レジーレジーと組み合わせ、4,000個以上のユニークなdiGlyペプチドを生成した。23,000以上のdiGlyペプチドは、プロテアソーム阻害剤で処理されたHeLa細胞の単一サンプルから日常的に同定することができる。3つの生物学的複製スクリーンで同定されたすべてのdiGlyペプチドのうち、9,000以上が3つの全てに存在し、17,000以上が3つの複製のうち少なくとも2つ中存在していた。ペプチド同定の数は、入力材料の量に非常に依存しています。同定されたdiGlyペプチドの数は出発物質によって期待できますが、これらの数値は推定のみであり、使用される質量分析計の種類にも依存します。このプロトコルを実施する際には、質量分析ベースのプロテオミクス法と微量サンプル量の取り扱いと分析に関する以前の経験が確実に有利であろう。MaxQuantソフトウェアは、他のデータベース検索アルゴリズムに置き換えることができます。また、異なるタイプの質量分析計を使用してもよい。ペプチド同定の観点からは結果が若干異なる場合がありますが、これは質量分析法ベースのプロテオミクスアッセイに典型的です。ユビキチンは、媒介タンパク質分解の進行において重要であるが、細胞内の他の多くのプロセスにおいても役割を果たしている。翻訳後修飾としてのユビキチンのより深い知識は、その機能をよりよく理解するために重要です。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

ペプチド ベースのマトリックスのためにサンプルを固定ホルマリンの最適な準備支援レーザー脱離イオン化質量分析イメージング ワークフロー

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

アンジオテンシンIIによるニトロペプチドプロファイリングと同定

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

プローブエレクトロスプレーイオン化質量分析のためのサンプル調製

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

逆相液体クロマトグラフィー-質量分析法による無細胞タンパク質合成代謝の絶対定量

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞リピドームの定量的解析

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

ペプチド生合成酵素を調べた水素重水素交換質量分析(HDX-MS)プラットフォーム

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...