Name: detection of protein ubiquitination sites by peptide enrichment and mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00
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이 작품은 국가 로드맵 대규모 연구 시설 (프로젝트 번호 184.032.201)의 일환으로 네덜란드 과학 연구 기구 (NWO)에 의해 자금을 조달 네덜란드 Proteomics 센터의 프로그램 "직장에서 단백질"프로젝트의 일부입니다 ).

여기에 설명된 모든 방법은 에라스무스 MC의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(EDC)에 의해 승인되었습니다.
1. 견본 준비
<ol><li>배양 된 세포<ol>
<li>관심 있는 세포주(예: HeLa 또는 골육종 [U2OS] 세포)를 선택하고 10% 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS)과 100 단위/mL 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 덜베코의 최소 독수리 배지(DMEM)에서 세포를 성장시다.</li>
		<li>정량적 프로테오믹스...

<ol>
	<li>Clague, M. J., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+Same+molecule,+different+degradation+pathways.">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li><li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy:+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture.">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li><li>Bergink, S., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+ubiquitin+and+SUMO+modifications+in+DNA+repair.">Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair.</a> Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).</li><li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Code.">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li><li>Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+Linkage-Specific+Affimers+Reveal+Insights+into+K6-Linked+Ubiquitin+Signaling.">Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling.</a> Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).</li><li>Swatek, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+ubiquitin+chain+architecture+using+Ub-clipping.">Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping.</a> Nature. 572, 533-537 (2019).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analyses+Reveal+Divergent+Ubiquitylation+Site+Patterns+in+Murine+Tissues.">Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).</li><li>Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+Ubiquitylation+and+Phosphorylation+Signaling+in+Rapamycin-treated+Yeast+Cells.">Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).</li><li>Elia, A. E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomic+Atlas+of+Ubiquitination+and+Acetylation+in+the+DNA+Damage+Response.">Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response.</a> Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).</li><li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proteome-wide,+Quantitative+Survey+of+In+Vivo+Ubiquitylation+Sites+Reveals+Widespread+Regulatory+Roles.">A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).</li><li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Quantification+of+in+vivo+Changes+in+Protein+Ubiquitination+following+Proteasome+and+Deubiquitinase+Inhibition.">Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).</li><li>Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+reveals+extensive+remodeling+of+the+ubiquitinome+after+perturbation+of+the+proteasome+by+dsRNA+mediated+subunit+knockdown.">Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).</li><li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling.">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li><li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides.">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li><li>Rose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Multiplexed+Quantitative+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Ubiquitylomes.">Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes.</a> Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).</li><li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+standard+absolute+quantification+(PSAQ)+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools.">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li><li>Van Der Wal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+ubiquitylation+site+detection+by+Orbitrap+mass+spectrometry.">Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. (July), (2017).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li></ol>

여기서 기재된 프로토콜은 배양된 세포 및 생체내 조직과 같은 다양한 생물학적 공급원으로부터의 샘플에 적용되었다. 모든 경우에 우리는 diGly 펩티드의 수천을 확인, 총 단백질 입력 량이 적어도 이었다는 것을 제공 1 mg. 특이적 항체를 이용한 농축은 유비퀴틴화 단백질 또는 diGly 펩티드에 대한 농축 절차가 적용되지 않은 경우 전체 세포 용해물에서 만 100-150 매우 낮은 풍부한 diGly 펩티드만이 ?...

단백질에 유비퀴틴의 융합은 프로테아솜에 의한 분해를 표시하고 프로테오스타증에서 중요한 과정입니다. 유비퀴틴의 C 말단 카르복실 그룹은 표적 단백질1,,2의리신 θ-아미노 기와 이소펩티드 결합을 형성한다. 또한, 유비퀴틴은 다른 유비퀴틴 모듈에 부착될 수 있으며, 이로 인해 균질한(즉, K48 또는 K11) 또는 분기(즉, 이질성 또는 혼합) 폴리유비퀴틴구조1,,3의형성을 초래한다. 유비퀴틴의 가장 잘 알려진 기능은 K48 연결 폴리유비퀴틴에 의해 매개된 프로테소말 분해에서의 역할입니다. 그러나, 모노-뿐만 아니라 polyubiquitination 또한 proteasome에 의한 분해와 무관하게 많은 프로세스에서 역할을 한다는 것이 분명해졌습니다. 예를 들어, K63 연결 체인은 세포 내 인신 매매, 리소좀 분해, 키나아제 신호 및 DNA 손상 반응4,,5에서비분해적 역할을 합니다. 다른 6개의 연계 유형은 덜 풍부하고 그들의 역할은 여전히 대체로 수수께끼이지만, 세포에서의 기능에 대한 첫 번째 징후가 나타나고 있지만, 주로 링크지 별검출을가능하게하는 새로운 도구의 개발로 인해 6,7.
질량 분석법은 프로테오메 분석을 위한 필수 도구가 되었으며, 오늘날 거의 모든 생물학적 공급원으로부터 수천 개의 다른 단백질이 단일 실험에서 확인될 수 있습니다. 복잡성의 추가 층은 단백질 활동을 조절할 수 있는 단백질의 번역 후 수정 (PTM)에 의해 제시됩니다 (예를 들어, 인산화, 메틸화, 아세틸화 및 유비퀴틴화). PTM 베어링 단백질의 대규모 식별은 질량 분석 분야의 개발에 의해 가능하게 되었습니다. PTM을 함유하는 펩티드의 상대적으로 낮은 화학적 분석은 수정되지 않은 펩티드에 비해 기술적 과제를 제시하며, 질량 분석 분석 이전에 는 생화학적 농축 단계가 일반적으로 필요하다. 지난 2년 동안 PTM 분석을 위해 여러 가지 특정 농축 방법이 개발되었습니다.
세포에서 단백질 유비퀴틴화의 다각적인 역할 때문에, 단백질 에 대한 유비퀴틴화 부위의 검출을 위한 분석 방법의 개발에 대한 수요가 매우 크다8. 질량 분광 방법의 적용은 과일 플라이, 마우스, 인간 및 효모 단백질9,,10,,11,,12,,13,,14에서확인 된 유비퀴틴 화 부위의 수의 폭발로 이어졌다. 주요 단계는 K-θ-GG 잔여 모티프('디글리신' 또는 'diGly'라고도 함)에 대한 항체를 사용하여 펩타이드 수준에서 면역 침전 기반 농축 전략의 개발에 의해 제시되었다. 이들 디글리 펩티드는 프로테아제15,,16으로서트립신을 사용하여 유비퀴틴화 단백질의 소화시 생산된다.
여기서, 우리는 Orbitrap 질량 분광법에 의한 면역 정화 및 후속 검출을 사용하여 diGly 펩티드를 풍부하게 하는 최적화된 워크플로우를 제시합니다. 특히 시료 전처리 및 질량 분석 단계에서 기존 워크플로우의 여러 변형을 조합하여 proteasome로 처리된 HeLa 세포의 단일 샘플에서 23,000개 이상의 diGly 펩타이드를 일상적으로 식별할 수 있습니다. 억제제 및 치료되지 않은 HeLa 세포로부터 ~10,000. 우리는 세포 배양에 있는 아미노산으로 표지되지 않은 안정한 동위원소 표지둘 다에서 용해하기 위하여 이 프로토콜을 적용했습니다 (SILAC) HeLa 세포를 표지하고 두뇌 조직과 같은 내인성 견본에.
이 워크플로우는 깊은 유비퀴티노메를 발견하기 위해 유비퀴틴 사이트를 분석하기 위한 도구의 레퍼토리에 귀중한 추가를 제공합니다. 다음 프로토콜은 워크플로의 모든 단계를 자세히 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Empore C18 Octadecyl disks</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>66883-U</td>
			<td>product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>UBPbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH130 resin, 3.5 &#956;m, 130 &#197;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nanoLC 1200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/F filter plug</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1825-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine, Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysyl Endopeptidase(LysC)</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLC oven</td>
			<td>MPI design, MS Wil GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher / Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLRP-S (300 &#197;, 50 &#181;m) polymeric reversed phase particles</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>PL1412-2K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-&#949;-GG) Kit</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>5562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036790</td>
			<td>Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein ubiquitination sites by peptide enrichment and mass spectrometry

작은 단백질 유비퀴틴에 의한 단백질의 번역 후 변형은 많은 세포 이벤트에서 관여한다. 유비퀴틴화된 단백질의 트리펩티드 소화 후, 리신의 엡실론 아미노 그룹('K-θ-디글리신' 또는 단순히 'diGly')에 컨쥬게이징된 디글리신 잔재를 함유한 펩티드를 원래의 수정 부위를 추적하는데 사용할 수 있다. 질량 분석법에 의한 민감한 검출과 결합된 diGly 펩티드의 효율적인 면역정화는 현재까지 확인된 유비퀴틴화 부위의 수가 크게 증가하였다. 우리는 농축 절차 이전에 펩타이드의 오프라인 높은 pH 역상 분획및 이온 라우팅 멀티폴에 보다 진보된 펩티드 단편화 설정을 포함하는 이 워크플로우를 몇 가지 개선했습니다. 또한, 항체 비드를 보유하기 위해 필터 기반 플러그를 사용하여 시료를 보다 효율적으로 정리하면 diGly 펩티드에 대한 더 큰 특이성을 초래한다. 이러한 개선은 인간 자궁 경부암 세포 (HeLa) 세포에서 23,000 개 이상의 diGly 펩티드의 일상적인 검출을 초래하여 세포에서 프로테아좀 억제에 따라 용해됩니다. 우리는 몇몇 다른 세포 모형및 두뇌 조직과 같은 생체 내 견본의 보편성 프로파일의 심층 분석을 위한 이 전략의 효험을 보여줍니다. 이 연구는 깊은 세포 유비퀴티노메를 밝히기 위해 단백질 유비퀴틴 분석을 위한 도구 상자에 원래 추가된 것을 제시합니다.

유비퀴틴화 단백질은 단백질이 트립신으로 소화될 때 대상 리신 잔류물 위에 114.04 Da 디글리신 잔재를 남깁니다. 이 모티프에 의한 질량 차이는 질량 분석 실험에서 유비퀴틴화 부위를 명확하게 인식하는 데 사용되었습니다. 여기서 설명하는 전략은 나노흐름 LC-MS/MS에 의한 diGly 펩티드의 농축 및 후속 식별을 위한 최첨단방법(그림 1A)입니다.</s...

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Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

작은 단백질 유비퀴틴에 의한 단백질의 번역 후 변형은 세포내의 많은 사건에 관여한다. 이 연구는 단백질 유비쿼터티화 분석을 위한 툴박스에 원래 추가된 것을 제시합니다. 우리는 깊은 유비쿼터티노메를 밝히기 위해 농축 기술과 질량 분광법을 사용합니다.우리는 유비쿼터티 단백질에서 유래하는 diGly 펩티드의 분석에 몇몇 개선을 했습니다. 이들은 농축하기 전에 조질 펩티드 분획을 포함하고, Orbitrap에서 더 진보된 펩티드 단편화 설정의 적용. 전부이 유비 쿼터 티노메의 더 큰 범위 결과.프로토콜의 여러 측면을 단어로 설명하기가 어렵습니다. 일부 주요 단계의 시각화는 다른 랩의 다른 작업자가 이러한 분석을 반복할 수 있어야 합니다. 절차는 내 실험실에서 수석 기술자 인 Karel Bezstarosti에 의해 입증될 것입니다.실험을 위한 배양된 세포 또는 마우스 두뇌 조직을 준비하는 것으로 시작합니다. 세포와 함께 작동하는 경우, 얼음 감기의 두 밀리리터에 하나의 150 센티미터 제곱 배양 플레이트에서 세포 펠릿을 lyse, 50 0.5 %의 탈옥 나트륨 과 트리S HCL. 용액을 섭씨 95도에서 5분간 끓입니다.그런 다음 섭씨 4도에서 10 분 동안 초음파 처리하십시오. 생체 내 마우스 뇌 조직을 사용하는 경우, 100 밀리머 트리스 HCL, 12 밀리머 나트륨 deoxycholate 및 12 밀리머 나트륨 N-lauroylsarcosinate를 포함하는 얼음 차가운 버퍼에 lyse. 섭씨 4도에서 10분 동안 용사를 음초음파 처리합니다.그런 다음 섭씨 95도에서 5 분간 끓입니다. 다음으로, 칼로리 흡광도 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 총 단백질 양을 양량화하며, 이는 성공적인 diGly 펩티드 면역 침전을 위해 적어도 몇 밀리그램이어야 한다. SILAC 실험의 경우, 총 단백질 량에 따라 빛과 무거운 라벨단백질을 1 대 1 비율로 혼합한다.섭씨 50도에서 30분 동안 5밀리몰러 DTT로 모든 단백질을 줄입니다. 그리고 그 후 어둠 속에서 15 분 동안 10 밀리마일라 요오도아세타미드로 그들을 알킬 수 있습니다. 그런 다음 Lys-C로 4 시간 동안 단백질 소화를 수행합니다.그리고 트립신 소화는 섭씨 30도, 또는 실온에서 하룻밤. 다음 날, 샘플을 2밀리리터 Eppendorf 튜브 2개로 나누고 TFA를 소화된 시료에 0.5%의 최종 농도로 10, 000배 G에서 10분간 침전하고 제거합니다. 후속 분획을 위해 상체가 함유된 펩티드를 수집합니다.고pH 역상 C18 크로마토그래피를 사용하여 트립틱 펩티드를 분별하십시오. 단백질 다이제스트의 대략 10 밀리그램을 위한 고정상 물질의 0.5 그램으로 채워진 빈 6 밀리리터 컬럼 카트리지를 준비합니다. 펩티드를 준비된 컬럼에 적재하고 약 10권의 0.1%TFA로 세척한 다음 10권의 물로 세척합니다.펩티드를 10개의 컬럼 부피를 사용하여 각각 7, 13.5 및 50%의 아세토나이트를 함유하고 있습니다. 그런 다음, 모든 분수 를 litholyse. 단백질 A 아가로즈 비드 슬러리에 컨쥬게이트된 유비퀴틴 잔재 모티프 항체의 1배치는 6개의 동등한 분획으로 나뉩니다.원고 방향에 따라 세 개의 펩티드 분획을 녹이고 이물질을 회전시합니다. 얼음에 다른 세 분획을 유지하면서 비드 슬러리에 세 분획의 슈퍼 네이트인을 추가합니다. 그리고 회전기 단위에 섭씨 4도에서 2 시간 동안 그들을 배양.그런 다음 구슬을 회전시합니다. 상체를 신선한 구슬 배치로 옮기습니다. 그리고 나머지 세 개의 비드 슬러리 분획으로 인큐베이션을 반복합니다.후속 글로벌 프로테오메 분석을 위해 수퍼네티어를 저장합니다. 그리고 구슬을 GFF 필터 플러그가 장착된 200 마이크로리터 파이펫 팁으로 전송합니다. 원심분리기 팁 어댑터가 장착된 1.5 밀리리터 튜브에 팁을 넣고 얼음 차가운 IAP 버퍼 200 마이크로리터로 구슬을 세 번 씻은 다음 얼음 냉간 정제수로 세 번 세척합니다.열을 200회 G로 회전시켜 세서즈 사이에 2분간 회전하여 컬럼을 건조하게 만들지 않도록 합니다. 마지막 세척 후, 0.15%TFA의 50 마이크로리터에서 2사이클로 펩티드를 엘테. C18 단계 끝으로 펩티드를 탈염하고 진공 원심 분리로 건조시합니다.나노플로우 LC 시스템에 결합된 민감한 질량 분광계에서 LC-MS/MS 실험을 수행합니다. 이 열은 원고의 지시에 따라 설정되어 섭씨 50도에 유지됩니다. 데이터 종속 획득 모드에서 질량 분광계를 작동합니다.4E5의 자동 게인 제어 대상 설정과 최대 주입 시간 50 밀리초로 MS1 질량 스펙트럼을 고해상도로 수집합니다. 총 사이클 시간이 3초인 최고 속도 방법을 사용하여 가장 강렬한 첫 번째 모드에서 질량 분광법 분석을 수행합니다. 그런 다음 낮은 풍부 펩티드의 최적의 검출을 보장합니다 가장 강렬한 첫 번째 모드에서 DDA MS 분석의 두 번째 라운드를 수행합니다.전구체 이온을 충전 상태 및 단일화 피크 할당에 따라 필터링합니다. 그리고 이전에 심문된 전구체를 60초 동안 동적으로 제외합니다. 1.6 Thomson의 폭으로 설정된 쿼드러폴 질량 필터로 펩티드 전구체를 분리합니다.그런 다음 최대 주입 시간 50밀리초와 HCD 충돌 에너지 30%의 자동 게인 제어에서 이온 트랩에서 MS2 스펙트럼을 수집하여 안드로메다 검색 엔진을 기반으로 자유롭게 사용할 수 있는 MaxQuant 소프트웨어 제품군과 같은 적절한 검색 엔진을 사용하여 질량 분석 원시 파일을 분석합니다. MaxQuant를 열고 적절한 원시 데이터 파일을 선택합니다. 프로세서 수를 설정하고 그룹 특정 매개 변수 탭을 클릭합니다.소화를 선택하고 세 개의 누락된 골짜기를 허용합니다. 그런 다음 수정 사항을 선택하고 변수 수정에 diGly를 추가합니다. 전역 매개 변수 탭을 선택하고 올바른 단백질 서열 데이터베이스를 추가합니다.다른 설정을 기본값으로 두고 데이터베이스 검색을 수행하기 위해 누릅니다. SILAC 실험 파일의 정량적 분석을 위해 복합성을 2개로 설정하고 중아미노산 라벨을 선택합니다. 검색이 완료되면 텍스트 파일을 Perseus로 가져옵니다.이 프로토콜은 나노플로우 LC-MS/MS를 이용한 디글리 펩티드를 검출함으로써 배양된 세포 및 생체 내 물질의 단백질에서 유비쿼터티닝 부위를 식별하는 데 사용되었다. 검출된 디글리 펩티드의 수가 더 많은 기존 프로토콜에 대한 몇 가지 개선이 이루어졌다. 면역 침전 전에 3개의 분획으로 조분획을 수행했습니다.분수 중 하나는 LC 크로마토그램의 넓은 피크를 특징으로하는 유비퀴틴의 자체 K48 변형 된 트립틱 디그 펩티드를 함유하고 있습니다. 더욱이, 펩티드 단편화 정권은 LC-MS 실행을 데이터 분석 절차에서 가장 높은 첫 번째 및 최저 제1 단편화 요법과 결합하도록 조정되었으며, 이는 4, 000 개 이상의 고유 디글리 펩티드를 생산했다. 23개 이상의, 000 디글리 펩타이드는 프로테좀 억제제로 처리된 HeLa 세포의 단일 샘플에서 일상적으로 식별될 수 있다.3개의 생물학적 복제 스크린을 통해 확인된 모든 diGly 펩티드의, 9, 000 이상은 3개의 복제중 적어도 2개에서 존재한 반면, 3개 모두에 존재했습니다. 펩티드 식별의 수는 입력 재료의 양에 매우 우발적이다. 확인된 디글리 펩타이드의 대략적인 수는 시작 물질에 따라 예상될 수 있지만, 이러한 숫자는 추정일 뿐이며 사용되는 질량 분광계의 종류에 따라 달라집니다.이 프로토콜을 수행할 때 질량 분석 기반 프로테오믹스 방법과 미세 샘플 양을 처리하고 분석한 이전 경험은 확실히 유리할 것입니다. MaxQuant 소프트웨어는 다른 데이터베이스 검색 알고리즘으로 대체될 수 있습니다. 또한 다른 유형의 질량 분광계가 사용될 수 있다.펩티드 식별의 관점에서 결과는 약간 다를 수 있습니다, 그러나 이것은 어떤 질량 분광계 기지를 둔 proteomics 분석에 대 한 일반적이다. 유비퀴틴은 중재된 단백질 분해의 진행에 중요하지만, 또한 세포내의 많은 다른 프로세스에서 역할을 한다. 번역 후 수정으로 유비퀴틴에 대한 깊은 지식은 그 기능을 더 잘 이해하는 데 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

연구

생화학

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

펩타이드 기반 매트릭스 샘플을 고정 하는 포 르 말린의 최적의 준비 지원 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징 워크플로

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

안지오텐신 II에 의해 설명 니트로 펩티드 프로파일링 및 식별

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

프로브 전기 분무 이온화 질량 분광법을 위한 샘플 준비

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

펩타이드 생합성 효소를 조사하기 위한 수소-신투륨 교환 질량 분광법(HDX-MS) 플랫폼

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...