Name: detection of protein ubiquitination sites by peptide enrichment and mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry at JoVE.com

Dette arbeidet er en del av prosjektet "Proteiner på jobben", et program fra Nederland Proteomics Centre finansiert av Nederlands organisasjon for vitenskapelig forskning (NWO) som en del av National Roadmap Large-Scale Research Facilities (prosjektnummer 184.032.201 ).

Alle metoder som er beskrevet her, er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (EDC) i Erasmus MC.
1. Prøveforberedelse
<ol><li>Kultiverte celler<ol>
<li>Velg en cellelinje av interesse (f.eks. HeLa eller osteosarkom [U2OS] celler) og vokse cellene i Dulbeccos Minimal Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% varme inaktivert føtal storfe serum (FBS) og 100 enheter / ml penicillin / streptomycin.</li>
		<li>For kvantitative proteomics eksperimenter, kulturceller i DMEM mangler ar...

<ol>
	<li>Clague, M. J., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+Same+molecule,+different+degradation+pathways.">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li><li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy:+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture.">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li><li>Bergink, S., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+ubiquitin+and+SUMO+modifications+in+DNA+repair.">Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair.</a> Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).</li><li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Code.">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li><li>Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+Linkage-Specific+Affimers+Reveal+Insights+into+K6-Linked+Ubiquitin+Signaling.">Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling.</a> Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).</li><li>Swatek, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+ubiquitin+chain+architecture+using+Ub-clipping.">Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping.</a> Nature. 572, 533-537 (2019).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analyses+Reveal+Divergent+Ubiquitylation+Site+Patterns+in+Murine+Tissues.">Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).</li><li>Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+Ubiquitylation+and+Phosphorylation+Signaling+in+Rapamycin-treated+Yeast+Cells.">Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).</li><li>Elia, A. E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomic+Atlas+of+Ubiquitination+and+Acetylation+in+the+DNA+Damage+Response.">Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response.</a> Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).</li><li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proteome-wide,+Quantitative+Survey+of+In+Vivo+Ubiquitylation+Sites+Reveals+Widespread+Regulatory+Roles.">A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).</li><li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Quantification+of+in+vivo+Changes+in+Protein+Ubiquitination+following+Proteasome+and+Deubiquitinase+Inhibition.">Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).</li><li>Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+reveals+extensive+remodeling+of+the+ubiquitinome+after+perturbation+of+the+proteasome+by+dsRNA+mediated+subunit+knockdown.">Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).</li><li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling.">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li><li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides.">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li><li>Rose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Multiplexed+Quantitative+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Ubiquitylomes.">Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes.</a> Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).</li><li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+standard+absolute+quantification+(PSAQ)+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools.">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li><li>Van Der Wal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+ubiquitylation+site+detection+by+Orbitrap+mass+spectrometry.">Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. (July), (2017).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li></ol>

Protokollen som er beskrevet her ble brukt på prøver fra ulike biologiske kilder, for eksempel kultiverte celler og in vivo vev. I alle tilfeller identifiserte vi tusenvis av diGly peptider, forutsatt at den totale proteininngangsmengden var minst 1 mg. Berikelsen ved hjelp av spesifikke antistoffer er svært effektiv, gitt at bare på det meste 100-150 svært lave rikelig diGly peptider ble identifisert fra hele celle lysates hvis ingen berikelse prosedyrer for ubiquitinated proteiner eller diGly peptider ble brukt. ?...

Bøyningen av ubiquitin til proteiner markerer dem for nedbrytning av proteasomen og er en avgjørende prosess i proteostase. C-terminal karboksylgruppen av ubiquitin danner et isopeptidbånd med lysin-ε-amino-gruppen avmålproteinet 1,2. I tillegg kan ubiquitin festes til andre ubiquitinmoduler, noe som resulterer i dannelse av homogene (dvs. K48 eller K11) eller forgrenet (dvs. heterogen eller blandet) polyubiquitinstrukturer1,3. Den mest kjente funksjonen til ubiquitin er dens rolle i proteasomal nedbrytning, mediert av K48-koblet polyubiquitin. Det har imidlertid blitt klart at både mono- så vel som polyubiquitination også spiller roller i mange prosesser som er uavhengige av nedbrytning av proteasom. For eksempel har K63-tilknyttede kjeder nondegradative roller i intracellulær handel, lysosomal nedbrytning, kinasesignalering og DNA-skaderespons4,5. De andre seks koblingstypene er mindre rikelig, og deres roller er fortsatt i stor grad gåtefulle, selv om de første indikasjonene på deres funksjoner i cellen dukker opp, hovedsakelig på grunn av utviklingen av nye verktøy for å muliggjøre koblingsspesifikk deteksjon6,7.
Massespektrometri har blitt et uunnværlig verktøy for proteomeanalyser, og i dag kan tusenvis av forskjellige proteiner fra nesten alle biologiske kilder identifiseres i et enkelt eksperiment. Et ekstra lag av kompleksitet presenteres ved posttranslational modifikasjoner (PTMs) av proteiner (f.eks fosforylering, metylering, acetylering og ubiquitination) som kan modulere proteinaktivitet. Storskala identifisering av PTM-bærende proteiner har også blitt gjort mulig av utviklingen i massespektrometrifeltet. Den relativt lave stoichiometry av peptider bærer PTMs sammenlignet med sine umodifiserte kolleger presenterer en teknisk utfordring og biokjemiskberikelse trinn er generelt nødvendig før massespektrometri analyse. I løpet av de siste to tiårene har flere ulike spesifikke berikelsesmetoder blitt utviklet for analyse av PTMs.
På grunn av de mangefasetterte rollene til proteinubiquitination i cellen, er det stor etterspørsel etter utvikling av analytiske metoder for påvisning av ubiquitination nettsteder på proteiner8. Anvendelsen av massespektrometriske metoder har ført til en eksplosjon av antall identifiserte ubiquitination nettsteder i frukt fly, mus, menneskelig, og gjær proteiner9,,10,11,12,13,14. Et stort skritt ble presentert ved utvikling av immunnedbørsbaserte berikelsesstrategier på peptidnivå ved hjelp av antistoffer rettet mot K-ε-GG restmotiv (også referert til som "diglycine" eller "diGly"). Disse diGly peptidene er produsert ved fordøyelsen av ubiquitinated proteiner ved hjelp av trypsin som protease15,16.
Her presenterer vi en optimalisert arbeidsflyt for å berike for diGly peptider ved hjelp av immunrensing og påfølgende deteksjon av Orbitrap massespektrometri. Ved hjelp av en kombinasjon av flere modifikasjoner av eksisterende arbeidsflyter, spesielt i prøvepreparatet og massespektrometristadiene, kan vi nå rutinemessig identifisere mer enn 23 000 diGly peptider fra en enkelt prøve av HeLa-celler behandlet med en proteasom hemmer og ~10 000 fra ubehandlede HeLa-celler. Vi har brukt denne protokollen til å lysates fra både umerkede og stabile isotop merking med aminosyrer i cellekultur (SILAC) merket HeLa celler samt til endogene prøver som hjernevev.
Denne arbeidsflyten presenterer et verdifullt tillegg til repertoar av verktøy for analyse av ubiquitination nettsteder for å avdekke den dype ubiquitinome. Følgende protokoll beskriver alle trinnene i arbeidsflyten i detalj.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Empore C18 Octadecyl disks</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>66883-U</td>
			<td>product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>UBPbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH130 resin, 3.5 &#956;m, 130 &#197;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nanoLC 1200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/F filter plug</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1825-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine, Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysyl Endopeptidase(LysC)</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLC oven</td>
			<td>MPI design, MS Wil GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher / Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLRP-S (300 &#197;, 50 &#181;m) polymeric reversed phase particles</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>PL1412-2K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-&#949;-GG) Kit</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>5562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036790</td>
			<td>Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein ubiquitination sites by peptide enrichment and mass spectrometry

Den posttranslationale modifikasjonen av proteiner av det lille proteinet ubiquitin er involvert i mange cellulære hendelser. Etter tryptisk fordøyelse av ubiquitinerte proteiner, kan peptider med en diglycine rest konjugert til epsilon aminogruppen lysin ('K-ε-diglycine' eller bare 'diGly') brukes til å spore tilbake det opprinnelige modifikasjonsstedet. Effektiv immunrensing av diGly peptider kombinert med sensitiv deteksjon av massespektrometri har resultert i en stor økning i antall ubiquitination nettsteder identifisert oppdatert. Vi har gjort flere forbedringer i denne arbeidsflyten, inkludert offline høy pH omvendt fase fraksjon av peptider før berikelseprosedyren, og inkludering av mer avanserte peptidfragmenteringsinnstillinger i ionruting multipol. Også mer effektiv opprydding av prøven ved hjelp av en filterbasert plugg for å beholde antistoffperlene resulterer i en større spesifisitet for diGly peptider. Disse forbedringene resulterer i rutinemessig påvisning av mer enn 23.000 diGly peptider fra humane livmorhalskreftceller (HeLa) celle lysates på proteasome hemming i cellen. Vi viser effekten av denne strategien for grundig analyse av ubiquitinome profiler av flere forskjellige celletyper og in vivo prøver, for eksempel hjernevev. Denne studien presenterer et originalt tillegg til verktøykassen for proteinubiquitinasjonsanalyse for å avdekke den dype cellulære ubiquitinome.

Ubiquitinated proteiner etterlater en 114.04 Da diglycine rest på målet lysin rester når proteinene fordøyes med trypsin. Masseforskjellen forårsaket av dette motivet ble brukt til å entydig gjenkjenne ubiquitinasjonens sted i et massespektrometrieksperiment. Strategien som vi beskriver her er en toppmoderne metode for berikelse og påfølgende identifisering av diGly peptider ved nanoflow LC-MS/ MS (Figur 1A). I denne studien ble både...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry at JoVE.com

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Vi presenterer en metode for rensing, deteksjon og identifisering av diGly peptider som stammer fra ubiquitinerte proteiner fra komplekse biologiske prøver. Den presenterte metoden er reproduserbar, robust og overgår publiserte metoder med hensyn til dybdenivået i ubiquitinome-analysen.

Påvisning av protein ubiquitination nettsteder av peptid berikelse og masse spektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Den post translasjonelle modifikasjonen av proteiner av det lille proteinet ubiquitin er involvert i mange hendelser i cellen. Denne studien presenterer et originalt tillegg til verktøykassen for proteinubiquitination analyse. Vi bruker berikelsesteknikker og massespektrometri for å avdekke det dype ubiquitinome.Vi har gjort flere forbedringer i analysen av diGly peptider som stammer fra ubiquitinated proteiner. Disse inkluderer rå peptid fraksjonering før berikelse, og anvendelsen av mer avanserte peptid fragmentering innstillinger i Orbitrap. Til sammen resulterer dette i en større dekning av ubiquitinome.Flere aspekter av protokollen er vanskelig å beskrive med ord. Visualisering av noen av de viktigste trinnene er avgjørende for å kunne gjenta disse analysene av ulike operatorer i et annet laboratorium. Prosedyren vil bli demonstrert av Karel Bezstarosti, som er senior tekniker i laboratoriet mitt.Begynn med å forberede kultiverte celler eller mus hjernevev for eksperimentet. Hvis du arbeider med celler, lyse cellen pellet fra en 150 centimeter kvadrert kulturplate i to milliliter iskald, 50 millimolar Tris HCL med 0,5% natrium deoxycholate. Kok lysatet ved 95 grader Celsius i fem minutter.Deretter sonikere det ved fire grader Celsius i 10 minutter. Hvis du bruker in vivo mus hjernevev, lyse det i en iskald buffer som inneholder 100 millimolar Tris HCL, 12 millimolar natrium deoxycholate og 12 millimolar natrium N-lauroylsarcosinate. Sonicate lysate i 10 minutter ved fire grader Celsius.Kok det deretter i fem minutter ved 95 grader Celsius. Deretter kvanter den totale proteinmengden ved hjelp av et kalorimetrisk absorbans BCA proteinanalysesett, som bør være minst flere milligram for vellykket diGly peptidimmunoprecipitation. For SILAC-eksperimenter blander du de lette og tunge merkede proteinene i et ett til ett forhold basert på den totale proteinmengden.Reduser alle proteiner med fem millimolar DTT i 30 minutter ved 50 grader Celsius. Og deretter alkylate dem med 10 millimolar iodoacetamid i 15 minutter i mørket. Utfør deretter proteinfordøyelsen med Lys-C i fire timer.Og trypsin fordøyelsen over natten på 30 grader Celsius, eller ved romtemperatur. På neste dag, dele prøven i to to milliliter Eppendorf rør og legge TFA til fordøyd prøven til en endelig konsentrasjon på 0,5%Sentrifuge den på 10,000 ganger G i 10 minutter for å utløse og fjerne alt vaskemiddel. Samle peptidet som inneholder supernatant for påfølgende fraksjonering.Bruk høy pH omvendt fase C18 kromatografi for å fraksjonere tryptiske peptider. Forbered en tom seks milliliter kolonnepatron fylt med 0,5 gram stasjonært fasemateriale for ca 10 milligram proteinfordøye. Legg peptidene på den tilberedte kolonnen og vask den med ca. 10 volumer på 0,1%TFA, etterfulgt av 10 mengder vann.Elute peptidene i tre fraksjoner ved hjelp av 10 kolonnevolumer på henholdsvis 10 millimolar ammoniumformat med henholdsvis syv, 13,5 og 50 %acetonitril. Deretter litholyse alle fraksjoner. En batch av ubiquitin rester motiv antistoffer konjugert til protein En agarose perle slurry er delt inn i seks like fraksjoner.Oppløs de tre peptidfraksjonene i henhold til manuskriptets retninger og spinn ned ruskene. Tilsett supernatantene til de tre brøkene til perleslurken mens du holder de tre andre brøkene på is. Og inkuber dem i to timer ved fire grader Celsius på en rotatorenhet.Deretter spinner du ned perlene. Overfør det overnaturlige til en frisk batch av perler. Og gjenta inkubasjonen med de resterende tre perleslamkefraksjonene.Oppbevar supernativa for påfølgende global proteomanalyse. Og overfør perlene til 200 mikroliter pipettespisser utstyrt med en GFF filterplugg. Sett spissene i 1,5 milliliter rør utstyrt med en sentrifuge tips adapter og vaske perlene tre ganger med 200 mikroliter iskald IAP buffer, etterfulgt av tre vasker med iskaldt renset vann.Spinn ned kolonnene på 200 ganger G i to minutter mellom vaskene, og pass på at du ikke lar kolonnen kjøre tørr. Etter den siste vasken, elute peptidene med to sykluser ved 50 mikroliter på 0,15% TFA. Desalt peptidene med en C18-trinnsspiss og tørk dem med vakuumsentrigering.Utfør LC-MS/MS-eksperimenter på et sensitivt massespektrometer skrevet til et nanostrøms LC-system. Kolonnen er satt opp i henhold til manuskriptretninger og holdt på 50 grader Celsius. Bruk massespektrometeret i dataavhengig anskaffelsesmodus.Samle MS1 massespektra ved høy oppløsning med en automatisert forsterkning kontrollert målinnstilling på 4E5 og en maksimal injeksjonstid på 50 millisekunder. Utfør massespektrometrianalysen i mest intens første modus, ved hjelp av topphastighetsmetoden med en total syklustid på tre sekunder. Utfør deretter en ny runde med DDA MS-analyse i minst intens første modus, noe som sikrer optimal påvisning av lave overflodspeptider.Filtrer forløperionene i henhold til deres ladetilstander og monoisotopisk toppoppdrag. Og utelukke tidligere forhørte forløpere dynamisk i 60 sekunder. Isoler peptidforløpere med et quadrupole massefilter satt til en bredde på 1,6 Thomson.Deretter samle MS2 spektra i ion fellen på en automatisert gevinst kontroll av 7E3 med en maksimal injeksjonstid på 50 millisekunder og HCD kollisjon energi på 30% Analyser massespektrometri råfiler ved hjelp av en passende søkemotor, for eksempel fritt tilgjengelig MaxQuant programvarepakke basert på Andromeda søkemotor. Åpne MaxQuant, og velg de riktige rådatafilene. Angi antall prosessorer og klikk på kategorien Gruppespesifikke parametere.Velg fordøyelse, og tillate tre tapte cleavages. Velg deretter endringer og legg diGly til de variable endringene. Velg kategorien globale parametere, og legg til riktig proteinsekvensdatabase.La de andre innstillingene være som standard, og trykk start for å utføre databasesøket. For kvantitativ analyse av SILAC eksperimentfiler, angi mangfoldet til to, og velg de tunge aminosyreetikettene. Når søket er ferdig, importerer du tekstfilene til Perseus.Denne protokollen ble brukt til å identifisere ubiquitination steder i proteiner fra kultiverte celler og in vivo materiale ved å oppdage diGly peptider med nanoflow LC-MS / MS. Flere forbedringer ble gjort i den eksisterende protokollen som resulterte i høyere antall oppdagede diGly peptider. En råoljefraksjon i tre fraksjoner ble utført før immunforebutning.En av brøkene inneholder ubiquitins egen K48 modifisert tryptisk diGly peptid, som er preget av en bred topp i LC kromatogram. Videre ble peptidfragmenteringsregimet justert for å kombinere LC-MS-løpene med de høyeste første og laveste første fragmenteringsregimene i dataanalyseprosedyren, som produserte mer enn 4000 ekstra unike diGly peptider. Mer enn 23, 000 diGly peptider kan rutinemessig identifiseres fra en enkelt prøve av HeLa celler behandlet med en proteasom hemmer.Av alle diGly peptider identifisert over tre biologiske replikere skjermer, mer enn 9,000 var til stede i alle tre, mens mer enn 17,000 var til stede i minst to av tre repliker. Antall peptid identifikasjoner er svært betinget av mengden av inndatamateriale. Et omtrentlig antall identifiserte diGly peptider kan forventes avhengig av startmaterialet, men disse tallene er bare estimater og vil også avhenge av hvilken type massespektrometer som brukes.Når du utfører denne protokollen, tidligere erfaring med massespektrometri basert proteomics metoder og håndtering og analysere minutt prøvebeløp ville sikkert være en fordel. MaxQuant-programvaren kan erstattes av en annen databasesøkealgoritme. Også en annen type massespektrometer kan brukes.Resultatene i form av peptid identifikasjoner kan litt variere, men dette er typisk for noen massespektrometri basert proteomics analyse. Ubiquitin er viktig i utviklingen av mediert proteinforringelse, men spiller også en rolle i mange andre prosesser i cellen. Dypere kunnskap om ubiquitin som en post translasjonell modifikasjon er avgjørende for å bedre forstå sin funksjon.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Enkel manipulering av arkitekturer i Protein-basert Hydrogels for celle kultur programmer

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyp proteom profilering av isobar merking, omfattende flytende Ture, massespektrometri og Software-baserte kvantifisering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal utarbeidelse av Formalin fast prøver for peptid basert Matrix assistert Laser desorpsjon/ionisering massespektrometri Imaging arbeidsflyter

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til sonde elektrospray ionisering massespektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolutt kvantifisering av Cell-fri protein syntese metabolisme av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

En Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) plattform for undersøkelse av peptidbiosyntetiske enzymer

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...