Name: detection of protein ubiquitination sites by peptide enrichment and mass spectrometry
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry at JoVE.com

Эта работа является частью проекта "Белки на работе", программы Нидерландского центра протеомики, финансируемого Нидерландской организацией научных исследований (НВО) в рамках Национальной дорожной карты крупномасштабных научно-исследовательских учреждений (проект No 184.032.201 ).

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (EDC) Erasmus MC.
1. Подготовка образца
<ol><li>Культурные клетки<ol>
<li>Выберите линию интереса клеток (например, HeLa или остеосаркома (U2OS) и вырастите клетки в мини-орлином ср...

<ol>
	<li>Clague, M. J., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+Same+molecule,+different+degradation+pathways.">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li><li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy:+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture.">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li><li>Bergink, S., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+ubiquitin+and+SUMO+modifications+in+DNA+repair.">Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair.</a> Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).</li><li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Code.">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li><li>Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+Linkage-Specific+Affimers+Reveal+Insights+into+K6-Linked+Ubiquitin+Signaling.">Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling.</a> Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).</li><li>Swatek, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+ubiquitin+chain+architecture+using+Ub-clipping.">Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping.</a> Nature. 572, 533-537 (2019).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analyses+Reveal+Divergent+Ubiquitylation+Site+Patterns+in+Murine+Tissues.">Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).</li><li>Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+Ubiquitylation+and+Phosphorylation+Signaling+in+Rapamycin-treated+Yeast+Cells.">Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).</li><li>Elia, A. E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomic+Atlas+of+Ubiquitination+and+Acetylation+in+the+DNA+Damage+Response.">Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response.</a> Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).</li><li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proteome-wide,+Quantitative+Survey+of+In+Vivo+Ubiquitylation+Sites+Reveals+Widespread+Regulatory+Roles.">A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).</li><li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Quantification+of+in+vivo+Changes+in+Protein+Ubiquitination+following+Proteasome+and+Deubiquitinase+Inhibition.">Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).</li><li>Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+reveals+extensive+remodeling+of+the+ubiquitinome+after+perturbation+of+the+proteasome+by+dsRNA+mediated+subunit+knockdown.">Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).</li><li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling.">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li><li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides.">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li><li>Rose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Multiplexed+Quantitative+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Ubiquitylomes.">Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes.</a> Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).</li><li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+standard+absolute+quantification+(PSAQ)+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools.">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li><li>Van Der Wal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+ubiquitylation+site+detection+by+Orbitrap+mass+spectrometry.">Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. (July), (2017).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li></ol>

Описанный здесь протокол был применен к образцам из различных биологических источников, таких как культивированные клетки и ткани in vivo. Во всех случаях мы выявили тысячи диглы пептидов, при условии, что общее количество ввода белка было не менее 1 мг. Обогащение с использованием конкрет...

Спряжение убиквитина к белкам знаменует их для деградации протеасомы и является решающим процессом в протеостазе. C-терминал carboxyl группа убиквитина образует изопептид связи с лизином и амино группы целевого белка1,2. Кроме того, убиквитин может быть прикреплен к другим модулям побиквитина, что приводит к образованию однородных (т.е. K48 или K11) или разветвленных (т.е. неоднородных или смешанных) поликубиквитовых структур1,3. Наиболее известной функцией убиквитин является его роль в протеасомальной деградации, при посредничестве K48-связанных полиубиквитин. Тем не менее, стало ясно, что как моно-, так и полиубичицинация также играют роль во многих процессах, которые не зависят от деградации протеасомы. Например, цепи, связанные с K63, играют недеградную роль во внутриклеточной торговле, лисосомальной деградации, сигнализации киназы и ответе повреждения ДНК4,,5. Другие шесть типов связей менее обильные и их роли по-прежнему в значительной степени загадочные, хотя первые указания об их функциях в ячейке появляются, в основном из-за разработки новых инструментов для обеспечения связи конкретных обнаружения6,7.
Масс-спектрометрия стала незаменимым инструментом для анализа протеомов, и в настоящее время тысячи различных белков практически из любого биологического источника могут быть идентифицированы в одном эксперименте. Дополнительный уровень сложности представлен постпереводными модификациями (ПТМ) белков (например, фосфорилированием, метилированием, ацетилированием и убиквитинированием), которые могут модулировать белковую активность. Крупномасштабная идентификация PTM-несущих белков также стала возможной благодаря изменениям в области масс-спектрометрии. Относительно низкая стойчиометрия пептидов, несущих ПТМ по сравнению с их неизмененными аналогами, представляет собой техническую проблему, и шаги биохимического обогащения, как правило, необходимы до анализа масс-спектрометрии. За последние два десятилетия для анализа ПТМ было разработано несколько различных конкретных методов обогащения.
Из-за многогранной роли убиквитина белка в клетке, существует большой спрос на разработку аналитических методов для обнаружения мест убиквитина на белках8. Применение масс-спектрометрических методов привело к взрыву числа выявленных мест убиквитинации в плодовой мухе, мыши, человеческих и дрожжевых белках99,10,,11,,12,,13,14. Важным шагом стала разработка стратегий обогащения на основе иммунопрецидации на уровне пептида с использованием антител, направленных против остатков мотива K-A-GG (также называемого «диглицином» или «дигли»). Эти диглы пептиды производятся при переваривании убиквитинаированных белков с помощью трипсина в качестве протеаза15,16.
Здесь мы представляем оптимизированный рабочий процесс для обогащения диглы пептидов с помощью иммуноочищенности и последующего обнаружения масс-спектрометрией Orbitrap. Используя комбинацию нескольких модификаций существующих рабочих процессов, особенно на этапах подготовки образцов и масс-спектрометрии, мы можем регулярно идентифицировать более 23 000 пептидов диГлли из одного образца клеток HeLa, обработанных протеасомой ингибитор и 10 000 фунтов от необработанных клеток HeLa. Мы применили этот протокол к лисатам как от немаркированной, так и изотопной маркировки аминокислотами в клеточной культуре (SILAC) с маркировкой клеток HeLa, а также к эндогенным образцам, таким как ткани мозга.
Этот рабочий процесс представляет собой ценное дополнение к репертуару инструментов для анализа убиквитинации сайтов для того, чтобы раскрыть глубокий убикитино. Следующий протокол подробно описывает все этапы рабочего процесса.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Empore C18 Octadecyl disks</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>66883-U</td>
			<td>product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>UBPbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSH130 resin, 3.5 &#956;m, 130 &#197;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nanoLC 1200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/F filter plug</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1825-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine, Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysyl Endopeptidase(LysC)</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLC oven</td>
			<td>MPI design, MS Wil GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher / Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLRP-S (300 &#197;, 50 &#181;m) polymeric reversed phase particles</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>PL1412-2K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-&#949;-GG) Kit</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>5562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036790</td>
			<td>Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein ubiquitination sites by peptide enrichment and mass spectrometry

Постпереводная модификация белков мелким белком убиквитин участвует во многих клеточных событиях. После триптического переваривания убиквитированных белков, пептиды с остатками диглицина, спряченные с группой аминокислот эпсилона ('K---дигизина или просто 'diGly') могут быть использованы для отслеживания первоначального места модификации. Эффективная иммуноочищенность дигли пептидов в сочетании с чувствительным обнаружением масс-спектрометрией привела к значительному увеличению числа выявленных на сегодняшний день участков убиквитинации. Мы внесли ряд улучшений в этот рабочий процесс, в том числе в автономном режиме высокой рН обратной фазы фракции пептидов до процедуры обогащения, а также включение более продвинутых параметров фрагментации пептида в ионную размыва. Кроме того, более эффективная очистка образца с помощью фильтра на основе штепсельной вилки для того, чтобы сохранить бусы антитела приводит к большей специфичности для диGly пептидов. Эти улучшения приводят к регулярному обнаружению более 23000 диглы пептидов из клеток рака шейки матки человека (HeLa) клеточные лисаты на протеасомы ингибирование в клетке. Мы показываем эффективность этой стратегии для углубленного анализа профилей убикитиномы нескольких различных типов клеток и образцов in vivo, таких как ткани мозга. Это исследование представляет собой оригинальное дополнение к инструментарию для анализа убиквитинации белка, чтобы раскрыть глубокий клеточный убикитино.

Убиквитинатированные белки оставляют остатки 114.04 Da diglycine на остатке лизина цели когда протеины усваиваются с трипсином. Массовая разница, вызванная этим мотивом, была использована для однозначного распознавания места убиквитина в эксперименте масс-спектрометрии. Ст...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry at JoVE.com

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Мы представляем метод очистки, обнаружения и идентификации диглы пептидов, которые происходят из убиквитинаированных белков из сложных биологических образцов. Представленный метод воспроизводим, надежен и превосходит опубликованные методы по уровню глубины анализа убикитиномы.

Обнаружение мест убиквитирования белка путем обогащения пептида и масс-спектрометрии

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Пост-трансляционная модификация белков мелким белковый убиквитин участвует во многих событиях в клетке. Это исследование представляет собой оригинальное дополнение к инструментарию для анализа убиквитинации белка. Мы используем методы обогащения и масс-спектрометрию, чтобы раскрыть глубокий убиквитином.Мы внесли несколько улучшений в анализ пептидов diGly, которые происходят из убиквитинированных белков. К ним относятся грубая пептидная фракцио орбита до обогащения и применение более продвинутых параметров фрагментации пептидов в Orbitrap. Altogether это приводит к в более большом охвате ubiquitinome.Некоторые аспекты протокола трудно описать словами. Визуализация некоторых ключевых шагов имеет важное значение для того, чтобы иметь возможность повторить эти анализы различных операторов в другой лаборатории. Процедуру продемонстрирует Карел Безстарости, старший техник в моей лаборатории.Начните с подготовки культурных клеток или ткани мозга мыши для эксперимента. При работе с клетками, подышать гранулы клеток из одного 150 сантиметров в квадрате культуры пластины в двух миллилитров ледяной, 50 миллимолярной Tris HCL с 0,5% деоксихолата натрия. Отварить лисат при 95 градусах по Цельсию в течение пяти минут.Затем sonicate его при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут. При использовании ткани мозга мыши in vivo вынизывают ее в ледяном буфере, содержащем 100 миллимоляров Tris HCL, 12 миллимоляров деоксихолата натрия и 12 миллимоляров натрия N-lauroylsarcosinate. Sonicate лисировать в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию.Затем варить его в течение пяти минут при 95 градусах по Цельсию. Далее, количественно общее количество белка с помощью калориметрической абсорбции BCA белка анализ комплект, который должен быть по крайней мере несколько миллиграммов для успешного диГли пептид иммунопреципитации. Для экспериментов SILAC смешайте легкие и тяжелые помеченные белки в соотношении один к одному в зависимости от общего количества белка.Уменьшите все белки с пятью миллимолярами DTT в течение 30 минут при 50 градусах цельсия. А затем алкилат их с 10 миллимолярия иодоацетамида в течение 15 минут в темноте. Затем выполняем переваривание белка с Lys-C в течение четырех часов.И трипсин пищеварения на ночь при температуре 30 градусов по Цельсию, или при комнатной температуре. На следующий день разделите образец на две миллилитровые трубы Eppendorf и добавьте TFA в переваренный образец до конечной концентрации 0,5%Центрифуга его в 10 000 раз G в течение 10 минут, чтобы осаждать и удалить все моющие средства. Соберите пептид, содержащий супернатант для последующей фракционации.Используйте высокое рН обратной фазы C18 хроматографии для фракции триптических пептидов. Подготовь пустой шестими миллилитровый колонку картриджа, наполненный 0,5 граммами стационарного фазового материала для около 10 миллиграммов белкового дайджеста. Загрузите пептиды на подготовленную колонку и вымойте ее примерно 10 томами 0,1%TFA, а затем 10 томов воды.Уполнося пептиды на три фракции, используя 10 объемов столбцов 10 миллимолярия аммония с 7, 13,5 и 50%ацетонитрилом, соответственно. Затем, litholyse все фракции. Одна партия убиквитина остатки мотив антител, конъюгированных с белком агароза шарик суспензии делится на шесть равных фракций.Растворите три пептидные фракции в соответствии с рукописными указаниями и вращайся вниз по обломкам. Добавьте супернатанты из трех фракций в суспензию из бисера, сохраняя при этом остальные три фракции на льду. И инкубировать их в течение двух часов при четырех градусах по Цельсию на ротаторе.Затем, спина вниз бисера. Перенесите супернатант на свежую партию бисера. И повторите инкубацию с оставшимися тремя фракциями суспензии бисера.Храните супернатанты для последующего глобального протеомного анализа. И передать бисер на 200 микролитров пипетки советы оснащены GFF фильтр штепсельной вилкой. Положите кончики в 1,5 миллилитровые трубки, оснащенные адаптером кончика центрифуги, и помойте бисер три раза 200 микролитров ледяного буфера IAP, а затем три моет ледяной очищенной водой.Спин вниз колонны на 200 раз G в течение двух минут между моет, убедившись, что не дать колонке иссякнуть. После окончательной стирки, elute пептиды с двумя циклами на 50 микролитров 0,15%TFA. Desalt пептиды с C18 этапе кончика и высушить их с вакуумной центрифугации.Выполните эксперименты LC-MS/MS на чувствительном масс-спектрометре в сочетании с системой nanoflow LC. Колонна настроена в соответствии с рукописными указаниями и хранится на уровне 50 градусов по Цельсию. Эксплуатация масс-спектрометра в режиме получения данных.Соберите спектры массы MS1 с высоким разрешением с автоматизированной управляемой целью усиления 4E5 и максимальным временем впрыска 50 миллисекунд. Выполните анализ масс-спектрометрии в наиболее интенсивном первом режиме, используя метод наибольшей скорости с общим временем цикла в три секунды. Затем выполните второй раунд анализа DDA MS в наименее интенсивном первом режиме, который обеспечит оптимальное обнаружение пептидов низкого изобилия.Фильтр ионов-предшественников в соответствии с их состояниями заряда и моноизотопным пиковым назначением. И исключить ранее допрошенных предшественников динамически в течение 60 секунд. Изолировать пептидные прекурсоры с квадрупольным массовым фильтром шириной 1,6 Томсона.Затем соберите спектры MS2 в ионной ловушке при автоматическом контроле усиления 7E3 с максимальным временем впрыска 50 миллисекунд и энергией столкновения HCD 30%Анализируйте необработанные файлы масс-спектрометрии с помощью соответствующей поисковой системы, такой как свободно доступный набор программного обеспечения Max'u'ut на основе поисковой системы Andromeda. Откройте Max'u'ut и выберите соответствующие необработанные файлы данных. Установите количество процессоров и нажмите на вкладку конкретных параметров группы.Выберите пищеварение, и позволяют три пропущенных расщепления. Затем выберите модификации и добавьте diGly к переменным изменениям. Выберите вкладку глобальных параметров и добавьте правильную базу данных последовательности белка.Оставьте другие настройки по умолчанию и нажмите начать выполнять поиск по базе данных. Для количественного анализа файлов экспериментов SILAC установите множественность до двух и выберите тяжелые аминокислотные этикетки. Когда поиск закончен, импортируют текстовые файлы в Персей.Этот протокол был использован для выявления мест убиквитина в белках из культурных клеток и виво материала путем обнаружения диГли пептидов с нанопоток LC-MS/MS. В существующий протокол было вносясь несколько улучшений, что привело к увеличению числа обнаруженных пептидов диГли. Грубая фракционирование на три фракции была выполнена до иммунопреципиентации.Одна из фракций содержит собственный K48 модифицированный триптический пептид диГли, который характеризуется широким пиком в хроматограмме LC. Кроме того, режим фрагментации пептидов был скорректирован, чтобы объединить пробеги LC-MS с самыми высокими первыми и самыми низкими режимами первой фрагментации в процедуре анализа данных, которые произвели более 4000 дополнительных уникальных пептидов diGly. Более 23 000 пептидов диГли можно регулярно идентифицировать из одного образца клеток HeLa, обработанных ингибитором протеасомы.Из всех пептидов diGly, идентифицированных на трех биологических экранах репликации, более 9000 присутствовали во всех трех, в то время как более 17 000 присутствовали по крайней мере в двух из трех репликаций. Количество идентификаций пептидов в значительной степени зависит от количества входного материала. Приблизительное количество идентифицированных пептидов diGly можно ожидать в зависимости от исходного материала, но эти цифры являются лишь оценками, а также будет зависеть от типа используемого масс-спектрометра.При выполнении этого протокола, предыдущий опыт работы с масс-спектрометрии на основе методов протеомики и обработки и анализа мельчайших объемов выборки, безусловно, было бы выгодно. Программное обеспечение Max'u'ut может быть заменено любым другим алгоритмом поиска базы данных. Также может быть использован другой тип масс-спектрометра.Результаты с точки зрения пептидной идентификации могут немного отличаться, но это характерно для любой масс-спектрометрии на основе протеомики анализа. Убиквитин имеет важное значение в процессе деградации опосредованного белка, но также играет роль во многих других процессах в клетке. Более глубокое знание убиквитина как пост-трансляционной модификации имеет решающее значение для лучшего понимания его функции.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Простое управление архитектуры в гидрогели на основе белков для приложений культуры клеток

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Глубокая протеома профилирование Изобарический маркировки, обширные жидкостная хроматография, масс-спектрометрии и при содействии программного обеспечения количественной оценки

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Оптимальная подготовка формалин фиксированной образцы для пептида основан матрицу помогает лазерная десорбция/ионизации масс-спектрометрия визуализации рабочих процессов

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

НитропептидНое профилирование и идентификация Иллюстрировано Ангиотензином II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Образец Подготовки для зонда Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Абсолютная количественная количественная количественная количественная метания белка без клеток путем обратной фазы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Количественный анализ клеточного липидома Сахаромиса Церевизии с использованием жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Платформа масс-спектрометрии обмена водорода и дейтерия (HDX-MS) для изучения пептидных биосинтетических ферментов

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...