Name: a high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by automated phenotypic profiling of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-14T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Forfatterne takke CGC til venligst at sende C. elegans. Dette arbejde blev støttet af nationale nøglen forskning og udvikling Program af Kina (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); National Natural Science Foundation i Kina Grant (#31401025, #81273108, #81641184), hovedstaden sundhedsforskning og udvikling af særlige projekt i Beijing (#2011-1013-03), fondens åbningen af Beijing centrale laboratorium af miljømæssige toksikologi (# 2015HJDL03), og Natural Science Foundation i Shandong-provinsen, Kina (ZR2017BF041).

Protokollen følger retningslinjerne dyrs pleje af dyr etiske komité i Beijing Center for sygdomsforebyggelse og -kontrol i Kina.
1. kemiske forberedelse
<ol><li>Få kemikalier (tabel 1 og Tabel af materialer).</li>
	<li>Bestemme de højeste og laveste dosering af de enkelte kemikalier til et minimum koncentration på 100% dødelighed (LC100, 24 h) og en maksimal koncentration af 100% nonlethality (LC0, 24 h) til orme. Brug mindst seks fortyndinger af den h...

<ol>
	<li>Anderson, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+behavioral+toxicity+with+Caenorhabditis+elegans.">Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+assessing+chemical+toxicity+using+a+Caenorhabditis+elegans+reproduction+assay.">A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).</li><li>Boyd, W. A., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+sensitivity+of+three+nematode+species+to+copper+and+their+utility+in+aquatic+and+soil+toxicity+tests.">Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).</li><li>Dengg, M., van Meel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+model+system+for+rapid+toxicity+assessment+of+pharmaceutical+compounds.">Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).</li><li>Schouest, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+assessment+of+chemicals+using+Caenorhabditis+elegans+and+optical+oxygen+respirometry.">Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).</li><li>Sprando, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+rank+order+water+soluble+compounds+according+to+their+toxicity+using+Caenorhabditis+elegans,+a+Complex+Object+Parametric+Analyzer+and+Sorter,+and+axenic+liquid+media.">A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media.</a> Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).</li><li>Wang, D., Xing, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+locomotion+behavioral+defects+induced+by+acute+toxicity+from+heavy+metal+exposure+in+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology.</a> Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+chemical+acute+toxicity+between+the+nematode+and+the+rodent.">Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent.</a> Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+genetic+mutations+and+chemical+exposures+on+Caenorhabditis+elegans+feeding:+evaluation+of+a+novel,+high-throughput+screening+assay.">Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay.</a> PLoS One. 2 (12), 1259 (2007).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+and+prediction+of+toxicity+of+chemicals+using+an+automated+phenotypic+profiling+of+Caenorhabditis+elegans.">Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18 (2018).</li><li>Moyson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+effects+of+copper,+cadmium,+and+zinc+on+mortality+and+behavior+of+Caenorhabditis+elegans.">Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+DMSO+is+dependent+on+sir-2.1+and+daf-16.">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Effect+of+the+ToxCast+Phase+I+and+Phase+II+Chemicals+in+Caenorhabditis+elegans+and+Corresponding+Responses+in+Zebrafish,+Rats,+and+Rabbits.">Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits.</a> Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).</li></ol>

Fordelene ved C. elegans har ført til den øgede brug i toksikologi9, både for Mekanistiske undersøgelser og høj overførselshastighed screening tilgange. En øget rolle for C. elegans i supplerer andre modelsystemer i toksikologiske forskning har været bemærkelsesværdig i de seneste år, især for den hurtige toksicitet vurdering af nye kemikalier. Denne artikel giver en ny analyse af høj overførselshastighed, kvantitativ screening af ormen fænotyper i en 384-godt plad...

Sammen med den hurtige udvikling af kemiske forbindelser anvendes til industriel produktion og folks daglige liv, er det vigtigt at undersøge toksicitet test modeller for kemikalier. I mange tilfælde, er de gnaver dyremodel ansat til at evaluere den potentielle toksicitet af forskellige kemikalier på sundhed. Bestemmelse af dødbringende koncentrationer (dvs. den analyserede 50% dødelig dosis [LD50] forskellige kemikalier) bruges generelt, som de traditionelle parameter i en gnaver (rotte/mus) model in vivo, som er tidskrævende og meget dyrt. Hertil kommer, på grund af Reducer, forfine, eller erstatte (3R) princippet, der er centrale for dyrevelfærd og etik, nye metoder, som giver mulighed for udskiftning af højere dyr er værdifulde for videnskabelig forskning1,2,3 . C. elegans er en fritlevende nematode, der har været isoleret fra jord. Det har været almindeligt anvendt som en forskning organisme i laboratoriet på grund af dets gavnlige egenskaber, såsom en kort levetid, nem dyrkning og effektiv reproduktion. Derudover er mange grundlæggende biologiske veje, herunder grundlæggende fysiologiske processer og stress reaktioner i C. elegans, bevaret i større pattedyr4,5,6,7 , 8. i et par af sammenligninger vi og andre har gjort, er der en god overensstemmelse mellem C. elegans toksicitet og toksicitet observeret i gnavere9. Alt dette gør C. elegans en god model til at teste effekten af kemiske toksicitet in vivo.
For nylig, nogle undersøgelser kvantificeres de fænotypiske egenskaber i C. elegans. Funktionerne kan bruges til at analysere toksicitet af kemikalier2,3,10 og ældning af orme11. Vi har også udviklet en metode, der kombinerer en flydende orm dyrkning system og et billede analysesystem, hvor ormene er kulturperler i en 384-godt plade under forskellige kemiske behandlinger12. Denne kvantitative teknik er udviklet til at automatisk analysere de 33 parametre af C. elegans efter 12-24h af kemisk behandling i en 384-godt plade med flydende medium. En automatiseret mikroskop fase bruges til eksperimenterende video erhvervelse. Videoerne er behandlet af en custom-designet program, og 33 funktioner med relation til orme bevægelige adfærd er kvantificeret. Metoden bruges til at kvantificere orm fænotyper under behandlingen af 10 forbindelser. Resultaterne viser, at forskellige toksicitet kan ændre fænotyper af C. elegans. Disse kvantificerede fænotyper kan bruges til at identificere og forudsige forskellige kemiske stoffer akutte toksicitet. Det overordnede mål med denne metode er at lette observation og fænotypiske kvantificering af eksperimenter med C. elegans i en flydende kultur. Denne metode er nyttig til anvendelse af C. elegans i kemiske toksicitet evalueringer og fænotype kvantificeringer, der hjælpe med at forudsige den akutte toksicitet af forskellige kemiske stoffer og fastsætte en prioriteringsliste for yderligere traditionelle kemiske toksicitet bedømmelse test i en gnaver model. Derudover kan denne metode anvendes til toksicitet screening og testning af nye kemikalier eller sammensat som food additive agent forurening, pharmacautical forbindelser, miljømæssige eksogene sammensatte og så videre.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">59300</td>
			<td style="width:407px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384-well plates</td>
			<td style="width:171px;">Throme</td>
			<td style="width:175px;">142761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Bacto</td>
			<td style="width:175px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Atropine sulfate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">PHL80892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Bleach buffer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">21074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CCD camera</td>
			<td style="width:171px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">AxioCam HRm</td>
			<td style="width:407px;">Zeiss microscopy GmbH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">24105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Glycerol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">K-Medium</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">LB Broth&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">10&#160;g/L&#160;Tryptone,&#160;5&#160;g/L&#160;Yeast&#160;Extract,&#160;5&#160;g/L&#160;NaCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:207px;">NGM Plate</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td>Bacto</td>
			<td style="width:175px;">211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">795496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">795488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">PPB buffer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">shaker</td>
			<td style="width:171px;">ZHICHENG</td>
			<td style="width:175px;">ZWY-200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">71382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium fluoride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">s7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">239305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">The link of program</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Zeiss automatic microscope&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">AXIO Observer.Z1</td>
			<td style="width:407px;">Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by automated phenotypic profiling of caenorhabditis elegans

Anvendelse af toksicitetstest af kemikalier i højere orden organismer, såsom mus eller rotter, er tidskrævende og dyrt, på grund af deres lange levetid og vedligeholdelse problemer. Tværtimod nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) har fordele ved at gøre det et ideelt valg for afprøvning af toksicitet: en kort levetid, nem dyrkning og effektiv reproduktion. Her, beskriver vi en protokol for den automatiske fænotypiske profilering af C. elegans i en 384-godt plade. Ødelægge orme er kulturperler i en 384-godt plade med flydende medium og kemisk behandling, og videoer er taget af hver brønd til at kvantificere de kemiske indflydelse på 33 orm funktioner. Eksperimentelle resultater viser, at de kvantificerede fænotype funktioner kan klassificere og forudsige den akutte toksicitet for forskellige kemiske stoffer og fastsætte en prioriteringsliste for yderligere traditionelle kemiske toksicitet bedømmelse test i en gnaver model.

Vi har testet fænotyper af orme udsættes for forskellige koncentrationer af mere end 10 kemikalier12. I testen, var 33 forskellige funktioner kvantificeres for hver kemisk forbindelse på tre gang point (0 h, 12 h og 24 h). Tidligere, var en sammenligning mellem en manuel og en automatisk analyse af en levetid assay gjort11,12. I denne analyse fandt vi, at kemikalier og koncentrationer kan påvirke orm f?...

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

En kvantitativ metode er blevet udviklet for at identificere og forudse kemikalier akutte toksicitet af automatisk analysere fænotypiske profilering af Caenorhabditis elegans. Denne protokol beskriver, hvordan du behandler orme med kemikalier i en 384-godt plade, fange videoer og kvantificere toksikologiske relaterede fænotyper.

En høj overførselshastighed Assay for forudsigelse af kemiske toksicitet af automatiseret fænotypiske profilering af Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

C.elegans toksikologisk analyse er værdifuld. Denne protokol beskriver, hvordan man behandler C.elegans med kemikalier i en 384-brønd plade, fange videoer, og kvantificere toksikologiske-relaterede fænotyper. Denne metode kan bidrage til at identificere og forudsige et kemikalies potentielle akutte toksicitet.Denne kvantitative teknik er udviklet til automatisk at analysere de 33 parametre for C.elegans efter 12 til 24 timers kemisk behandling i en 384-brønd plade med flydende medium. C.elegans er værdifuld som en god model for hurtig toksicitetsvurdering for nye kemikalier. Som mus, det kan anvendes til toksicitet screening og test af nye kemikalier, eller forbindelsen som tilsætningsstof agent forurening, farmaceutiske sammensatte, miljø udefrakommende sammensatte, og så videre.Læs protokollen omhyggeligt og følg altid med trin for trin, så vil du være den gode. Visuel demonstration er nemmere for brugeren at se betjeningen af hvert trin og resultatet af handlingen. Demonstration af proceduren vil blive Wenjing Zhang og Gaochao Han.De er kandidatstuderende fra mit laboratorium. Til at begynde, foretage en foreløbig orm dødelighed test for et nyt kemikalie, at bestemme den højeste dosis, og den laveste dosis, som er den mindste koncentration af 100% dødelighed, og den maksimale koncentration af 100% ikke-dødelighed. Til dette forsøg forberedes syv gradientkoncentrationer af cadmiumchlorid.For at forberede to gange den højeste koncentrerede vandige opløsning opløses 92,8 mg cadmiumchloridfast pulver i et centrifugerør fyldt med otte milliliter K-medium. Vortex at blande. Når pulveret er helt opløst, skal du bruge en pipette til at fylde op til 10 milliliter.De øvrige koncentrationsniveauer forberedes ved fortynding med K-medium. I en super ren bænk, skal du bruge en steril spids til at vælge en enkelt koloni af E.coli OP50 fra streak plade, og læg den i kolben med 100 milliliter LB bouillon til at vaccinere kolonien. Dyrk det natten over ved 37 grader Celsius i inkubator shaker.Hæld NGM i en 90 milliliter plast petri plade. Frø hver plade med 300 mikroliter af E.coli OP50 opløsning. Inkuber N2 orme på NGM plader med OP50 ved 20 grader Celsius i ca 2 til 3 dage, indtil de fleste af ormene har nået den voksne fase.Med sterilt vand, vaskes gravid orme ned i et 15 milliliter sterilt konisk centrifugerør, der skal høstes. Lad ormene slå sig ned i mindst 2 minutter. Aspirere vandet og tilsæt fem milliliter blegemiddel buffer.Vortex røret i fem minutter, og derefter sætte røret i en centrifuge til at spinde på en relativ centrifugalkraft på 1300 i 30 sekunder til pellet æggene. Brug en pipette til at aspirere supernatanten. Tilsæt fem milliliter steriliseret vand i røret for at vaske æggene, og vortex røret i fem sekunder.Centrifuge røret i 30 sekunder, ved en relativ centrifugalkraft på 1300. Fjern supernatant og tilsæt fem milliliter steriliseret vand til at vaske igen. Pipette æggene på en ny NGM plade med OP50.Inkuber dem ved 20 grader Celsius natten over. Næste morgen når de udklækkede orme L1-scenen. Efter ca. 40 timer når ormene L4-scenen.Med K medium, vaske L4 fase orme fra petripladerne i en 50 milliliter sterile koniske rør. Pipette 50 mikroliter af ormen væske fra røret til et glas dias. Under et stereomikroskop skal du bruge en pipette til at justere koncentrationen af orme til ca. 40 dyr pr. 100 mikroliter K-medium.Tilsæt 50 mikroliter af det forberedte medium i hver brønd af 384-brøndpladen. Disse synkroniserede L4 fase orme er klar til efter behandling af kemikalier. Før du tilføjer kemikalierne, skal du placere 384-brøndpladen med de synkroniserede orme på den automatiske scene og konfigurere videokameraet med den programmerede anskaffelsesprocedure.I 384-brønd plade, orme behandles med seks til syv doser af hvert enkelt kemikalie, med otte parallelle brønde, der indeholder 50 mikroliter af de to gange kemiske opløsning for hver dosis. Forbered mindst tre grupper af otte parallelle brønde af K medium som et kontrolelement. Tilføj 50 mikroliter af de to gange kemiske opløsning for hver brønd.Indstil klokkeslættet som nultimerspunkt. Derefter sætte 384-brønd plade i inkubator shaker indstillet til 20 grader Celsius, og 80 omdrejninger i minuttet. Efter et ønsket tidspunkt skal du fjerne pladen fra inkubatoren og overføre den til den automatiske fase.Tag videoer af hver brønd af pladen, på 12 timer, og på 24 timer for at kontrollere fænotyper af orme. Hvis du vil starte behandlingen af den eksperimentelle video, skal du overføre videofilerne til computeren. Via den grafiske brugergrænseflade skal du klikke på knappen Vælg for at vælge kildebillederne.Tilføj den midterste resultatmappe. De midterste resultater omfatter de segmenterede billeder, som er nyttige til visuel observation af de behandlede billeder. Tilføj den endelige resultatmappe i grænsefladen.Angiv parameteren for den gennemsnitlige ormstørrelse til 2.000 i tekstboksen Ormstørrelse i grænsefladen. Angiv tærsklen for flyttet forhold til 0,93 i grænsefladen. Klik på knappen Analysér for at starte billedbehandlingen.Det udviklede program kan genkende orme og kvantificere fænotyper automatisk. I dette eksperiment blev der kvantificeret 33 forskellige karakteristika for behandling af cadmiumchlorid på tre tidspunkter, nultimer, 12 timer og 24 timer. Eksperimentelle billeder viser, at ormene døde hurtigere, da den kemiske koncentration steg.I begyndelsen var der ingen signifikant forskel mellem kontrol og kemiske behandlinger. Efter 12 timers behandling blev de orme, der blev behandlet med en høj koncentration, mere lige og mindre buede end ved lavere koncentrationer eller i kontrolgrupper. Den største akse længde orm krop dækket region steg som tiden steg.Der er også en gradient tendens fra lavere til højere kemiske koncentrationer i både den store akse og i den mindre akse længde. Ormene'motilitet, baseret på området og forholdet, viste lignende mønstre. Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel i begyndelsen.Som tiden gik, viste ormene i kontrolgruppen et stabilt fald i motilitet. Efter 12 og 24 timer viste de orme, der blev behandlet med cadmiumchlorid, betydelige forskelle i motilitet sammenlignet med kontrolgrupper. Desuden viste ormene under højere koncentration behandlinger en svagere motilitet, sammenlignet med orme under lavere koncentration behandlinger.Sammenfattende viser denne teknik en måde at vurdere hurtig toksicitet på flere områder. Forskere, der kunne anvende metoden til akut analyse af toksicitet i fødevarer båret toksikose, sikkerhedsvurdering af farmaceutiske forbindelser, samt den akutte toksicitet screening, og påvisning af nye kemikalier, og de miljømæssige udefrakommende forbindelser. Cadmiumchlorid er et lavt giftigt stof.Brug handsker og en maske under håndteringen, og følg brugsanvisningen.

Research

JoVE Journal

Environment

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Bestemmelse af Mikrobiel Extracellular enzymaktivitet i Vand, Jord og sediment ved hjælp af High Throughput Mikropladekrav Analyser

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

High-throughput Fluorometric Måling af Potentiel Jord Ekstracellulære enzymaktiviteter

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimeret negativ farvning: en High-throughput protokol for behandlingen Små og asymmetrisk proteiners struktur ved elektronmikroskopi

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Physical, Chemical and Biological Characterization of Six Biochars Produced for the Remediation of Contaminated Sites

Fysisk, kemisk og biologisk karakterisering af Six Biochars produceret til rensning af forurenede industrigrunde

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

High-throughput screening af Modstridigheden Variationer i lignocelluloseholdige biomasse: Total Lignin lignin Monomerer og enzymatisk Sugar Frigivelse

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Høj overførselshastighed, individuel protokol for analyse af behandling parametre og ernæringsmæssige kvaliteter i majs (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

En 3-dimensionel (3D)-trykt skabelon for High Throughput zebrafisk Embryo opstilling

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Høj overførselshastighed Siderophore Screening fra miljøprøver: plante væv, Bulk jord og rhizosfære jord

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Brug af Caenorhabditis elegans til at studere Trans-og multi generations effekter af giftstoffer

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Standardiserede metoder til måling af induktion af varmechokresponsen i Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...