Name: a high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by automated phenotypic profiling of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-14T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

De auteurs bedanken CGC kandidatuur verzenden de C. elegans. Dit werk werd gesteund door de nationale sleutel onderzoek en ontwikkeling programma van China (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); Nationale Natural Science Foundation van China Grant (#31401025, #81273108, #81641184), de hoofdstad gezondheidsonderzoek en de ontwikkeling van speciaal Project in Peking (#2011-1013-03), het Fonds van de Opening van de Beijing belangrijkste laboratorium voor milieutoxicologie (# 2015HJDL03), en de Stichting van de natuurwetenschappen van de noordoostelijke provincie Shandong, China (ZR2017BF041).

Het protocol volgt de richtsnoeren van de verzorging van de dieren van de dier-ethische commissie van de Peking-centrum voor ziektepreventie en -bestrijding in China.
1. chemische preparaten
<ol><li>Verkrijgen chemicaliën (tabel 1 en Tabel van materialen).</li>
	<li>Het bepalen van de hoogste en de laagste dosering van de afzonderlijke chemische stoffen voor een minimumconcentratie van 100% letaliteit (LC100, 24 uur per dag) en een maximale concentratie van...

<ol>
	<li>Anderson, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+behavioral+toxicity+with+Caenorhabditis+elegans.">Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+assessing+chemical+toxicity+using+a+Caenorhabditis+elegans+reproduction+assay.">A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).</li><li>Boyd, W. A., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+sensitivity+of+three+nematode+species+to+copper+and+their+utility+in+aquatic+and+soil+toxicity+tests.">Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).</li><li>Dengg, M., van Meel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+model+system+for+rapid+toxicity+assessment+of+pharmaceutical+compounds.">Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).</li><li>Schouest, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+assessment+of+chemicals+using+Caenorhabditis+elegans+and+optical+oxygen+respirometry.">Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).</li><li>Sprando, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+rank+order+water+soluble+compounds+according+to+their+toxicity+using+Caenorhabditis+elegans,+a+Complex+Object+Parametric+Analyzer+and+Sorter,+and+axenic+liquid+media.">A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media.</a> Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).</li><li>Wang, D., Xing, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+locomotion+behavioral+defects+induced+by+acute+toxicity+from+heavy+metal+exposure+in+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology.</a> Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+chemical+acute+toxicity+between+the+nematode+and+the+rodent.">Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent.</a> Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+genetic+mutations+and+chemical+exposures+on+Caenorhabditis+elegans+feeding:+evaluation+of+a+novel,+high-throughput+screening+assay.">Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay.</a> PLoS One. 2 (12), 1259 (2007).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+and+prediction+of+toxicity+of+chemicals+using+an+automated+phenotypic+profiling+of+Caenorhabditis+elegans.">Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18 (2018).</li><li>Moyson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+effects+of+copper,+cadmium,+and+zinc+on+mortality+and+behavior+of+Caenorhabditis+elegans.">Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+DMSO+is+dependent+on+sir-2.1+and+daf-16.">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Effect+of+the+ToxCast+Phase+I+and+Phase+II+Chemicals+in+Caenorhabditis+elegans+and+Corresponding+Responses+in+Zebrafish,+Rats,+and+Rabbits.">Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits.</a> Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).</li></ol>

De voordelen van C. elegans hebben geleid tot het toenemende gebruik ervan in de toxicologie9, zowel voor mechanistische studies en high-throughput screening benaderingen. Een grotere rol voor C. elegans in aanvulling op andere modelsystemen in toxicologisch onderzoek is opmerkelijk in de afgelopen jaren, met name voor de beoordeling van de snelle toxiciteit van nieuwe chemicaliën. Dit artikel bevat een nieuwe bepaling van hoge-doorvoer, kwantitatieve screening van worm fenotype...

Samen met de snelle ontwikkeling van chemische verbindingen die zijn toegepast op de industriële productie en het dagelijks leven van mensen, is het belangrijk om te bestuderen van de toxiciteit van de modellen voor de chemische stoffen. In veel gevallen is het knaagdier diermodel aangewend om te evalueren van de potentiële toxiciteit van verschillende chemische stoffen op de gezondheid. In het algemeen, wordt de bepaling van de letale concentratie (dat wil zeggen, de getest 50% letale dosis [LD50] van verschillende chemische stoffen) gebruikt als de traditionele parameter in een in vivo knaagdier (rat/muis)-model dat is tijdrovend en zeer duur. Bovendien, als gevolg van de verminderen, verfijnen of vervangen (3R)-beginsel dat is essentieel voor het welzijn van dieren en ethiek, nieuwe methoden waarmee voor de vervanging van hogere dieren zijn waardevol voor wetenschappelijk onderzoek1,2,3 . C. elegans is een free-living nematode die geïsoleerd uit bodem is. Het heeft grote schaal gebruikt als een organisme onderzoek in het laboratorium vanwege zijn gunstige kenmerken, zoals een korte levensduur, gemakkelijke teelt en efficiënte reproductie. Daarnaast worden vele fundamentele biologische paden, met inbegrip van fundamentele fysiologische processen en stress reacties in C. elegans, bewaard in hogere zoogdieren4,5,6,7 , 8. in een aantal vergelijkingen die wij en anderen hebben gedaan, er is een goede overeenstemming tussen C. elegans toxiciteit en toxiciteit bij knaagdieren9waargenomen. Dit alles maakt C. elegans een goed model voor het testen van de effecten van chemische toxicities in vivo.
Sommige studies gekwantificeerd onlangs, de fenotypische kenmerken van C. elegans. De functies kunnen worden gebruikt om de toxicities van3,10 van de2,van de chemische stoffen en de veroudering van wormen11te analyseren. Ook ontwikkelden we een methode die een vloeibaar worm culturing systeem en een analysesysteem combineert, waarin de wormen gekweekt in een 384-well plaat onder verschillende chemische behandelingen12 zijn. Deze kwantitatieve techniek heeft ontwikkeld om te analyseren automatisch de 33 parameters van C. elegans na 12-24h van chemische behandeling in een 384-well plaat met vloeistof. Een geautomatiseerde Microscoop stadium wordt gebruikt voor experimentele video acquisitie. De video's worden verwerkt door een speciaal ontworpen programma en 33 kenmerken in verband met de wormen bewegende gedrag worden gekwantificeerd. De methode wordt gebruikt om te kwantificeren van de worm fenotypen onder de behandeling van 10 verbindingen. Uit de resultaten blijkt dat verschillende toxicities als de fenotypen van C. elegans veranderen kunnen. Deze gekwantificeerde fenotypen kunnen worden gebruikt voor het identificeren en voorspellen van de acute toxiciteit van verschillende chemische verbindingen. Het algemene doel van deze methode is de observatie en fenotypische kwantificering van experimenten met C. elegans in een vloeibare cultuur te vergemakkelijken. Deze methode is nuttig voor de toepassing van C. elegans in chemische toxiciteit evaluaties en fenotype ondermeer, die helpen bij het voorspellen van de acute toxiciteit van verschillende chemische verbindingen en stelt een prioriteitenlijst op met voor meer traditionele de tests van de beoordeling van het chemische toxiciteit in een knaagdier model. Bovendien, kan deze methode worden toegepast om de toxiciteit screening en het testen van nieuwe chemische producten of de verbinding als het voedsel additieve agent verontreiniging, pharmacautical verbindingen, milieu exogene stof, enzovoort.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">59300</td>
			<td style="width:407px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384-well plates</td>
			<td style="width:171px;">Throme</td>
			<td style="width:175px;">142761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Bacto</td>
			<td style="width:175px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Atropine sulfate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">PHL80892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Bleach buffer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">21074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CCD camera</td>
			<td style="width:171px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">AxioCam HRm</td>
			<td style="width:407px;">Zeiss microscopy GmbH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">24105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Glycerol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">K-Medium</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">LB Broth&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">10&#160;g/L&#160;Tryptone,&#160;5&#160;g/L&#160;Yeast&#160;Extract,&#160;5&#160;g/L&#160;NaCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:207px;">NGM Plate</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td>Bacto</td>
			<td style="width:175px;">211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">795496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">795488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">PPB buffer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">shaker</td>
			<td style="width:171px;">ZHICHENG</td>
			<td style="width:175px;">ZWY-200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">71382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium fluoride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">s7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">239305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">The link of program</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Zeiss automatic microscope&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">AXIO Observer.Z1</td>
			<td style="width:407px;">Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by automated phenotypic profiling of caenorhabditis elegans

Het toepassen van toxiciteit van chemische stoffen in hogere orde organismen, zoals muizen of ratten, is tijdrovend en duur, als gevolg van hun lange levensduur en onderhoud kwesties. Integendeel, de nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) heeft voordelen zodat het een ideale keuze voor toxiciteitstests: een korte levensduur, gemakkelijke teelt en efficiënte reproductie. Hier beschrijven we een protocol voor de automatische fenotypische profilering van C. elegans in een 384-well-plate. De nematode wormen zijn gekweekt in een 384-well plaat met vloeibare middellange en chemische behandeling en video's zijn genomen van elk putje te kwantificeren van de chemische invloed op 33 worm functies. Experimentele resultaten aantonen dat de gekwantificeerde fenotype functies kunnen classificeren en voorspellen van de acute toxiciteit voor verschillende chemische verbindingen en een prioriteitenlijst op met voor meer traditionele chemische toxiciteit assessment tests in een knaagdier model stelt.

We hebben de fenotypen van wormen blootgesteld aan verschillende concentraties van meer dan 10 chemische stoffen12getest. In de test, werden 33 verschillende functies gekwantificeerd voor elke chemische verbinding op drie tijdstippen (0 h, 12 h en 24 h). Eerder, werd een vergelijking tussen een handleiding en een automatische analyse van een levensduur test gedaan11,12. In deze test vonden we dat chemische ...

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Een kwantitatieve methode is ontwikkeld om te identificeren en te voorspellen van de acute toxiciteit van chemische stoffen door het automatisch analyseren de fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans. Dit protocol wordt beschreven hoe behandelen van wormen met chemicaliën in een 384-well-plate, vastleggen van video's en kwantificeren van toxicologische verwante fenotypen.

Een High-throughput Assay voor de voorspelling van de chemische toxiciteit door geautomatiseerde fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

C.elegans toxicologische test is waardevol. Dit protocol beschrijft hoe c.elegans te behandelen met chemicaliën in een 384-put plaat, video's vast te leggen en toxicologische gerelateerde fenotypes te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het identificeren en voorspellen van de potentiële acute toxiciteit van een chemische stof.Deze kwantitatieve techniek is ontwikkeld om automatisch de 33 parameters van C.elegans te analyseren na 12 tot 24 uur chemische behandeling in een 384-put plaat met vloeibaar medium. C.elegans is waardevol als een goed model van snelle toxiciteitsbeoordeling voor nieuwe chemische stoffen. Als muizen, het kan worden toegepast op de toxiciteit screening en testen van nieuwe chemische stoffen, of de verbinding als het voedsel additieve agent vervuiling, farmaceutische verbinding, milieu exogene verbinding, en ga zo maar door.Lees het protocol zorgvuldig en volg altijd de met stap voor stap, dan zul je de goede zijn. Visuele demonstratie is gemakkelijker voor de gebruiker om de werking van elke stap te zien, en het resultaat van de bewerking. Het demonstreren van de procedure zal Wenjing Zhang en Gaochao Han.Het zijn afgestudeerde studenten van mijn laboratorium. Om te beginnen, voer een voorlopige worm dodelijkheid test voor een nieuwe chemische stof, om de hoogste dosering te bepalen, en de laagste dosering, die de minimale concentratie van 100% letaliteit, en de maximale concentratie van 100% niet-letaliteit. Bereid voor dit experiment zeven gradiëntconcentraties cadmiumchloride voor.Om twee keer de hoogste geconcentreerde wateroplossing voor te bereiden, los 92,8 milligram cadmiumchloridevast poeder op in een centrifugebuis gevuld met acht milliliter K-medium. Vortex om te mengen. Nadat het poeder volledig is opgelost, gebruik dan een pipet om tot 10 milliliter te vullen.Bereid de andere concentratieniveaus door verdunning met K-medium. In een super schone bank, gebruik maken van een steriele tip om een enkele kolonie van E.coli OP50 pick uit de streep plaat, en plaats het in de kolf met 100 milliliter LB bouillon om de kolonie inenten. Laat het 's nachts groeien bij 37 graden Celsius in de couveuse shaker.Giet NGM in een 90 milliliter plastic petriplaat. Zaad elke plaat met 300 microliter E.coli OP50 oplossing. Incubeer N2-wormen op de NGM-platen met OP50 bij 20 graden Celsius gedurende ongeveer 2 tot 3 dagen, totdat de meeste wormen het volwassen stadium hebben bereikt.Met steriel water, was gravid wormen in een 15 milliliter steriele kegelbuis om te oogsten. Laat de wormen minstens 2 minuten tot rust komen. Aspirate het water en voeg vijf milliliter bleekwater buffer.Vortex de buis voor vijf minuten, en zet de buis in een centrifuge te draaien op een relatieve middelpuntvliedende kracht van 1300 gedurende 30 seconden om de eieren pellet. Gebruik een pipet om de supernatant aan tezuigen. Voeg vijf milliliter gesteriliseerd water in de buis om de eieren te wassen, en vortex de buis voor vijf seconden.Centrifuge de buis gedurende 30 seconden, bij een relatieve middelpuntvliedende kracht van 1300. Verwijder de supernatant en voeg vijf milliliter gesteriliseerd water toe om opnieuw te wassen. Pipette de eieren op een nieuwe NGM plaat met OP50.Broed ze 's nachts uit op 20 graden Celsius. De volgende ochtend bereiken de uitgebroede wormen het L1-stadium. Na ongeveer 40 uur bereiken de wormen het L4-stadium.Met K medium, was de L4 fase wormen uit de Petri platen in een 50 milliliter steriele conische buis. Pipette 50 microliters van de wormvloeistof van de buis naar een glazen glijbaan. Gebruik onder een stereomicroscoop een pipet om de concentratie van wormen aan te passen aan ongeveer 40 dieren per 100 microliter K-medium.Voeg 50 microliter van het voorbereide medium toe aan elke put van de 384-put plaat. Deze gesynchroniseerde L4 fase wormen zijn klaar voor volgende behandeling door chemicaliën. Voordat u de chemicaliën toevoegt, plaatst u de 384-putplaat, met de gesynchroniseerde wormen op het automatische podium, en stel u een videocamera in met de geprogrammeerde acquisitieprocedure.In de 384-well plaat, wormen worden behandeld met zes tot zeven doseringen van elke individuele chemische, met acht parallelle putten met 50 microliters van de twee keer chemische oplossing voor elke dosering. Bereid ten minste drie groepen van acht parallelle putten van K medium als een controle. Voeg 50 microliter van de twee keer chemische oplossing voor elke put.Stel de tijd in als het nuluurpunt. Zet vervolgens de 384-put plaat in de incubator shaker ingesteld op 20 graden Celsius, en 80 omwentelingen per minuut. Verwijder na een gewenste tijd de plaat uit de couveuse en breng deze over naar het automatische podium.Maak video's van elke put van de plaat, op 12 uur, en op 24 uur om de fenotypes van de wormen te controleren. Als u wilt beginnen met het verwerken van de experimentele video, zet u de videobestanden over naar de computer. Klik via de grafische gebruikersinterface op de knop Selecteren om de map bronafbeeldingen te kiezen.Voeg de middelste resultaatmap toe. De middelste resultaten omvatten de gesegmenteerde beelden, die nuttig zijn voor de visuele observatie van de verwerkte beelden. Voeg de map met het eindresultaat toe in de interface.Stel de parameter gemiddelde wormgrootte in op 2.000 in het tekstvak Wormgrootte in de interface. Stel de drempelwaarde van de verplaatste verhouding in op 0,93 in de interface. Klik op de knop Analyseren om de verwerking van de afbeelding te starten.Het ontwikkelde programma kan wormen herkennen en fenotypes automatisch kwantificeren. In dit experiment werden 33 verschillende kenmerken gekwantificeerd voor de behandeling van cadmiumchloride op drie tijdstippen, nuluur, 12 uur en 24 uur. Experimentele beelden tonen aan dat de wormen sneller stierven naarmate de chemische concentratie toenam.In het begin was er geen significant verschil tussen de controle en chemische behandelingen. Na 12 uur behandeling werden de wormen behandeld met een hoge concentratie rechter en minder gebogen dan bij lagere concentraties of in controlegroepen. De belangrijkste aslengte van worm lichaam bedekte regio toegenomen naarmate de tijd toenam.Er is ook een gradiënttrend van lagere naar hogere chemische concentraties in zowel de belangrijkste as als in de kleine aslengte. De beweeglijkheid van de wormen, gebaseerd op het gebied en de verhouding, vertoonde vergelijkbare patronen. In het begin werd geen significant verschil waargenomen.Naarmate de tijd verstreek, de wormen in de controlegroep toonde een stabiele afname van de beweeglijkheid. Na 12 en 24 uur vertoonden de wormen die met cadmiumchloride werden behandeld significante verschillen in beweeglijkheid, vergeleken met controlegroepen. Bovendien vertoonden de wormen onder behandelingen met een hogere concentratie een zwakkere beweeglijkheid, vergeleken met de wormen onder behandelingen met een lagere concentratie.Samengevat, deze techniek effent een manier van snelle toxiciteit beoordeling in meerdere gebieden. Onderzoekers die de methode kunnen toepassen op de noodanalyse van toxiciteit in door voedsel overgedragen toxicose, de veiligheidsevaluatie van farmaceutische verbindingen, evenals de acute toxiciteitsscreening, en de detectie van nieuwe chemische stoffen, en de milieu-exogene verbindingen. Het cadmiumchloride is een lage giftige stof.Draag handschoenen en een masker tijdens uw behandeling en volg de gebruiksaanwijzing.

Research

JoVE Journal

Environment

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Bepaling van Microbiële extracellulaire enzymactiviteit in Waters, bodem en sedimenten behulp High Throughput Microplaat Testen

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

High-throughput Fluorometrische Meting van Potentiële Soil Extracellular Enzyme Activiteiten

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Geoptimaliseerd Negatieve kleuring: een High-throughput protocol voor de behandeling Kleine en Asymmetric Protein Structure door Electron Microscopy

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Physical, Chemical and Biological Characterization of Six Biochars Produced for the Remediation of Contaminated Sites

Fysische, chemische en biologische karakterisering van Six Biochars Geproduceerd voor de sanering van verontreinigde locaties

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

High-throughput screening van weerspannigheid Variaties in lignocellulose: Total Lignine, Lignine monomeren, en enzymatische Sugar release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

High-throughput, Microscale Protocol voor de analyse van verwerking Parameters en voedingswaarde in maïs (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Een 3-dimensionale (3D)-sjabloon voor High Throughput Zebrafish Embryo Arraying afgedrukt

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderofoor High-throughput Screening van milieu monsters: plantaardige weefsels, Bulk bodems en rhizosfeer bodems

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Met behulp van Caenorhabditis elegans voor het bestuderen van trans-en multi-generationele effecten van toxicantia

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Gestandaardiseerde methoden voor het meten van inductie van de heat shock response in Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...