Name: a high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by automated phenotypic profiling of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-14T14:45:00
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Les auteurs remercient le CCG pour bien vouloir envoyer c. elegans. Ce travail a été soutenu par la National Key Research and Development Programme of China (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705) ; Fondation nationale des sciences naturelles de Chine Grant (#31401025, #81273108, #81641184), Capital Health recherche et développement d’un projet spécial à Pékin (#2011-1013-03), le fonds de l’ouverture du laboratoire de toxicologie de l’environnement (# clé Beijing 2015HJDL03) et la Fondation des sciences naturelles de la Province de Shandong, Chine (ZR2017BF041).

Le protocole suit les directives de protection des animaux du comité d’éthique animale du centre de Pékin pour la prévention et de contrôle en Chine.
1. préparation chimique
<ol><li>Obtenir des produits chimiques (tableau 1 et Table des matières).</li>
	<li>Déterminer la dose maximale et minimale des produits chimiques individuelle pour une concentration minimale de 100 % de létalité (LC100, 24 h) et une concentration maximale de 100 % nonlethali...

<ol>
	<li>Anderson, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+behavioral+toxicity+with+Caenorhabditis+elegans.">Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+assessing+chemical+toxicity+using+a+Caenorhabditis+elegans+reproduction+assay.">A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).</li><li>Boyd, W. A., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+sensitivity+of+three+nematode+species+to+copper+and+their+utility+in+aquatic+and+soil+toxicity+tests.">Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).</li><li>Dengg, M., van Meel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+model+system+for+rapid+toxicity+assessment+of+pharmaceutical+compounds.">Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).</li><li>Schouest, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+assessment+of+chemicals+using+Caenorhabditis+elegans+and+optical+oxygen+respirometry.">Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).</li><li>Sprando, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+rank+order+water+soluble+compounds+according+to+their+toxicity+using+Caenorhabditis+elegans,+a+Complex+Object+Parametric+Analyzer+and+Sorter,+and+axenic+liquid+media.">A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media.</a> Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).</li><li>Wang, D., Xing, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+locomotion+behavioral+defects+induced+by+acute+toxicity+from+heavy+metal+exposure+in+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology.</a> Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+chemical+acute+toxicity+between+the+nematode+and+the+rodent.">Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent.</a> Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+genetic+mutations+and+chemical+exposures+on+Caenorhabditis+elegans+feeding:+evaluation+of+a+novel,+high-throughput+screening+assay.">Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay.</a> PLoS One. 2 (12), 1259 (2007).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+and+prediction+of+toxicity+of+chemicals+using+an+automated+phenotypic+profiling+of+Caenorhabditis+elegans.">Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18 (2018).</li><li>Moyson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+effects+of+copper,+cadmium,+and+zinc+on+mortality+and+behavior+of+Caenorhabditis+elegans.">Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+DMSO+is+dependent+on+sir-2.1+and+daf-16.">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Effect+of+the+ToxCast+Phase+I+and+Phase+II+Chemicals+in+Caenorhabditis+elegans+and+Corresponding+Responses+in+Zebrafish,+Rats,+and+Rabbits.">Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits.</a> Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).</li></ol>

Les avantages de c. elegans ont conduit à son utilisation croissante en toxicologie9, tant pour les études mécanistiques et approches de criblage à haut débit. Un rôle accru pour le c. elegans en complément des autres systèmes de modèle dans la recherche toxicologique a été remarquable ces dernières années, en particulier pour l’évaluation de la toxicité rapide de nouveaux produits chimiques. Cet article fournit une nouvelle méthode de dosage de criblage haut d?...

Avec le développement rapid des composés chimiques appliqués à la production industrielle et de la vie quotidienne du peuple, il est important d’étudier la toxicité à l’essai des modèles pour les produits chimiques. Dans de nombreux cas, le modèle animal rongeur est employé pour évaluer la toxicité potentielle des différents produits chimiques sur la santé. En règle générale, la détermination des concentrations létales (c.-à-d. la dosé 50 % dose létale [DL50] de différents produits chimiques) est utilisée comme paramètre dans un modèle de rongeur (rat/souris) in vivo, traditionnel qui est long et très coûteux. En outre, en raison de la réduire, affiner ou remplacer (3R) principe qui est au cœur de l’éthique et du bien-être animal, de nouvelles méthodes qui permettent le remplacement des animaux supérieurs sont précieux pour la recherche scientifique1,2,3 . C. elegans est un nématode libre qui a été isolé du sol. Il a été largement utilisé comme un organisme de recherche en laboratoire en raison de ses caractéristiques bénéfiques, notamment une courte durée de vie, une culture facile et de reproduction efficace. En outre, plusieurs voies biologiques fondamentaux, y compris les processus physiologiques de base et les réactions de stress chez c. elegans, sont conservées dans les mammifères supérieurs4,5,6,7 , 8. dans quelques comparaisons nous et autres avons fait, il y a une bonne concordance entre le c. elegans ou toxique observé chez les rongeurs,9. Tout cela fait c. elegans , un bon modèle pour tester les effets de la toxicité chimique in vivo.
Récemment, certaines études quantifié les caractéristiques phénotypiques de c. elegans. Les caractéristiques peuvent être utilisés pour analyser la toxicité des produits chimiques2,3,10 et le vieillissement vers11. Nous avons également développé une méthode qui combine un ver liquid culture système et un système d’analyse image, où les vers sont cultivées dans une plaque 384 puits sous différents traitements chimiques12. Cette technique quantitative a été développée pour analyser automatiquement les 33 paramètres de c. elegans après 12 à 24 heures de traitement chimique dans une plaque 384 puits avec un milieu liquide. Une platine du microscope automatisé est utilisé pour l’acquisition vidéo expérimentale. Les vidéos sont traitées par un programme sur-mesure, et 33 caractéristiques liées au comportement de déplacement du ver sont quantifiées. La méthode est utilisée pour quantifier les phénotypes de ver dans le traitement des 10 composés. Les résultats montrent que les différentes toxicités peuvent altérer les phénotypes de c. elegans. Ces phénotypes quantifiées peuvent être utilisés pour identifier et prédire la toxicité aiguë de différents composés chimiques. L’objectif général de cette méthode est de faciliter l’observation et la quantification phénotypique des expériences avec le c. elegans en milieu liquide. Cette méthode est utile pour l’application de c. elegans dans les évaluations de la toxicité chimique et analyses quantitatives phénotype, ce qui aident à prédire la toxicité aiguë de différents composés chimiques et établir une liste de priorités pour les plus traditionnels tests d’évaluation de la toxicité chimique dans un modèle de rongeur. En outre, cette méthode peut être appliquée à la toxicité de dépistage et de tester de nouveaux produits chimiques ou le composé comme la pollution agent additif alimentaire, composés de pharmacautical, environnement composé exogène et ainsi de suite.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">59300</td>
			<td style="width:407px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384-well plates</td>
			<td style="width:171px;">Throme</td>
			<td style="width:175px;">142761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Bacto</td>
			<td style="width:175px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Atropine sulfate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">PHL80892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Bleach buffer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">21074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CCD camera</td>
			<td style="width:171px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">AxioCam HRm</td>
			<td style="width:407px;">Zeiss microscopy GmbH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">24105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Glycerol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">K-Medium</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">LB Broth&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">10&#160;g/L&#160;Tryptone,&#160;5&#160;g/L&#160;Yeast&#160;Extract,&#160;5&#160;g/L&#160;NaCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:207px;">NGM Plate</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td>Bacto</td>
			<td style="width:175px;">211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">795496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">795488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">PPB buffer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">shaker</td>
			<td style="width:171px;">ZHICHENG</td>
			<td style="width:175px;">ZWY-200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">71382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium fluoride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">s7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">239305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">The link of program</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Zeiss automatic microscope&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">AXIO Observer.Z1</td>
			<td style="width:407px;">Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by automated phenotypic profiling of caenorhabditis elegans

Essais de toxicité des produits chimiques chez les organismes supérieurs de commande, tels que les souris ou les rats, l’application, c’est long et coûteux, en raison de leur longue durée de vie et les problèmes d’entretien. Au contraire, le nématode Caenorhabditis elegans (c. elegans) a des avantages à en font un choix idéal pour les essais de toxicité : une courte durée de vie, une culture facile et de reproduction efficace. Nous décrivons ici un protocole pour le profilage phénotypique automatique de c. elegans dans une plaque 384 puits. Les vers nématodes sont cultivées dans une plaque 384 puits avec traitement moyen et chimique liquides et vidéos sont prises de chaque puits de quantifier l’influence chimique sur 33 caractéristiques de ver. Les résultats expérimentaux montrent que les caractéristiques de phénotype chiffrés peuvent classer et prédire la toxicité aiguë pour les différents composés chimiques et établir une liste de priorités pour les tests d’évaluation plus traditionnelle de la toxicité chimique dans un modèle de rongeur.

Nous avons testé les phénotypes vers exposés à différentes concentrations de plus de 10 produits chimiques12. Dans le test, 33 caractéristiques distinctes ont été quantifiées pour chaque produit chimique composé à trois points dans le temps (0 h, 12 h et 24h). Une comparaison entre un manuel et une analyse automatique d’un test de durée de vie a été faite auparavant,11,12. Dans ce test, nous...

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A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Une méthode quantitative a été développée pour identifier et prédire la toxicité aiguë de substances chimiques en analysant automatiquement la détermination des caractéristiques phénotypiques de Caenorhabditis elegans. Ce protocole décrit comment traiter les vers avec des produits chimiques dans une plaque 384 puits, capturer des vidéos et quantifier les phénotypes associés toxicologiques.

Un test haut débit pour la prévision de la toxicité chimique de profilage phénotypique automatisé de Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

L’analyse toxicologique de C.elegans est précieuse. Ce protocole décrit comment traiter C.elegans avec des produits chimiques dans une plaque de 384 puits, capturer des vidéos et quantifier les phénotypes liés à la toxicologie. Cette méthode pourrait aider à identifier et à prédire la toxicité aiguë potentielle d’un produit chimique.Cette technique quantitative a été développée pour analyser automatiquement les 33 paramètres de C.elegans après 12 à 24 heures de traitement chimique dans une plaque de 384 puits avec milieu liquide. C.elegans est précieux comme un bon modèle d’évaluation rapide de la toxicité pour les nouveaux produits chimiques. En tant que souris, il peut être appliqué au criblage et à l’essai de toxicité de nouveaux produits chimiques, ou du composé comme pollution d’agent additif alimentaire, composé pharmaceutique, composé exogène d’environnement, et ainsi de suite.Lisez attentivement le protocole et suivez toujours le avec étape par étape, alors vous serez le bon. La démonstration visuelle est plus facile pour l’utilisateur de voir le fonctionnement de chaque étape, et le résultat de l’opération. Wenjing Zhang et Gaochao Han feront la démonstration de la procédure.Ce sont des étudiants diplômés de mon laboratoire. Pour commencer, effectuer un test préliminaire de létalité des vers pour un nouveau produit chimique, pour déterminer le dosage le plus élevé, et le dosage le plus bas, qui sont la concentration minimale de 100% létalité, et la concentration maximale de 100% non létalité. Pour cette expérience, préparez sept concentrations de gradient de chlorure de cadmium.Pour préparer deux fois la solution aqueuse concentrée la plus élevée, dissoudre 92,8 milligrammes de poudre solide de chlorure de cadmium dans un tube de centrifugeuse rempli de huit millilitres de K moyen. Vortex à mélanger. Après la dissolution complète de la poudre, utiliser une pipette pour remplir jusqu’à 10 millilitres.Préparer les autres niveaux de concentration par dilution avec K moyen. Dans un banc super propre, utilisez une pointe stérile pour prélasser une seule colonie d’E.coli OP50 dans la plaque de strie et placez-la dans le flacon avec 100 millilitres de bouillon LB pour inoculer la colonie. Cultivez-le pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans le shaker incubateur.Verser le NGM dans une plaque petri en plastique de 90 millilitres. Ensemencer chaque assiette avec 300 microlitres de solution E.coli OP50. Incuber les vers N2 sur les plaques NGM avec OP50 à 20 degrés Celsius pendant environ 2 à 3 jours, jusqu’à ce que la plupart des vers aient atteint le stade adulte.Avec de l’eau stérile, laver les vers gravid dans un tube de centrifugeuse conique stérile de 15 millilitres à récolter. Laissez les vers s’installer pendant au moins 2 minutes. Aspirer l’eau et ajouter cinq millilitres de tampon d’eau de Javel.Vortex le tube pendant cinq minutes, puis mettre le tube dans une centrifugeuse pour tourner à une force centrifuge relative de 1300 pendant 30 secondes pour pelleter les oeufs. Utilisez une pipette pour aspirer le surnatant. Ajouter cinq millilitres d’eau stérilisée dans le tube pour laver les œufs et vortexer le tube pendant cinq secondes.Centrifugeuse du tube pendant 30 secondes, à une force centrifuge relative de 1300. Retirer le surnatant et ajouter cinq millilitres d’eau stérilisée pour le laver à nouveau. Pipette les oeufs sur une nouvelle plaque NGM avec OP50.Incubez-les à 20 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, les vers éclos atteignent le stade de L1. Après environ 40 heures, les vers atteignent le stade L4.Avec k moyen, laver les vers de scène L4 des plaques Petri dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Pipette 50 microlitres du liquide ver du tube à une lame de verre. Au microscope stéréo, utiliser une pipette pour ajuster la concentration de vers à environ 40 animaux pour 100 microlitres de milieu K.Ajouter 50 microlitres du milieu préparé dans chaque puits de la plaque de 384 puits. Ces vers synchronisés de stade L4 sont prêts à suivre le traitement par des produits chimiques. Avant d’ajouter les produits chimiques, placez la plaque de 384 puits, avec les vers synchronisés sur le stade automatique, et installez la caméra vidéo avec la procédure d’acquisition programmée.Dans la plaque de 384 puits, les vers sont traités avec six à sept doses de chaque produit chimique individuel, avec huit puits parallèles contenant 50 microlitres de la solution deux fois chimique pour chaque dosage. Préparer au moins trois groupes de huit puits parallèles de milieu K comme un contrôle. Ajouter 50 microlitres de la solution chimique deux fois pour chaque puits.Définissez l’heure comme point zéro heure. Ensuite, mettez la plaque de 384 puits dans le shaker incubateur fixé à 20 degrés Celsius, et 80 révolutions par minute. Après un temps désiré, retirez la plaque de l’incubateur et transférez-la à l’étape automatique.Prenez des vidéos de chaque puits de la plaque, à 12 heures, et à 24 heures pour vérifier les phénotypes des vers. Pour commencer à traiter la vidéo expérimentale, transférez les fichiers vidéo à l’ordinateur. Via l’interface utilisateur graphique, cliquez sur le bouton Sélectionner, pour choisir l’annuaire des images source.Ajouter l’annuaire des résultats intermédiaires. Les résultats intermédiaires incluent les images segmentées, qui sont utiles pour l’observation visuelle des images traitées. Ajouter l’annuaire des résultats fin derniers dans l’interface.Définissez le paramètre moyen de taille du ver à 2000 dans la boîte de texte Worm Size dans l’interface. Définissez le seuil du ratio déplacé à 0,93 dans l’interface. Cliquez sur le bouton Analyser pour démarrer le traitement d’image.Le programme développé peut reconnaître les vers et quantifier automatiquement les phénotypes. Dans cette expérience, 33 dispositifs distincts ont été quantifiés pour le traitement de chlorure de cadmium à trois points de temps, zéro heure, 12 heures, et 24 heures. Des images expérimentales montrent que les vers sont morts plus rapidement à mesure que la concentration chimique augmentait.Au début, il n’y avait pas de différence significative entre le contrôle et les traitements chimiques. Après 12 heures de traitement, les vers traités avec une forte concentration sont devenus plus droits et moins courbés qu’à des concentrations inférieures ou dans des groupes de contrôle. La longueur principale de l’axe de la région couverte par le corps du ver a augmenté à mesure que le temps augmentait.Il y a également une tendance de gradient des concentrations chimiques inférieures à plus élevées dans l’axe principal et dans la longueur mineure d’axe. La motilité des vers, basée sur la région et le rapport, a montré des modèles similaires. Aucune différence significative n’a été observée au début.Au fil du temps, les vers du groupe témoin ont montré une diminution stable de la motilité. Après 12 et 24 heures, les vers qui ont été traités avec le chlorure de cadmium ont montré des différences significatives dans la motilité, comparées aux groupes de contrôle. En outre, les vers soumis à des traitements à concentration plus élevée ont montré une motilité plus faible, par rapport aux vers sous des traitements à faible concentration.En résumé, cette technique ouvre la voie à une évaluation rapide de la toxicité dans plusieurs domaines. Les chercheurs qui pourraient appliquer la méthode à l’analyse d’urgence de la toxicité dans la toxicose d’origine alimentaire, l’évaluation de l’innocuité des composés pharmaceutiques, ainsi que le dépistage de la toxicité aiguë, et la détection de nouveaux produits chimiques, et les composés exogènes environnementaux. Le chlorure de cadmium est une substance faiblement toxique.S’il vous plaît porter des gants et un masque pendant votre manipulation, et suivez les instructions de fonctionnement.

Research

JoVE Journal

Environment

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

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Détermination de l&#39;activité enzymatique microbienne extracellulaire dans les eaux, les sols et les sédiments de haut débit microplaques dosages

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Recherche

Environnement

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