Name: a high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by automated phenotypic profiling of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-14T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Die Autoren danken CGC für Bitte senden den C. Elegans. Diese Arbeit wurde von National Key Research und Development Program of China (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705) unterstützt. National Natural Science Foundation of China Grant (#31401025, #81273108, #81641184), die Kapital Gesundheitsforschung und Entwicklung von speziellen Projekt in Peking (#2011-1013-03), die Öffnung-Fonds von der Beijing Key Laboratory der Umwelttoxikologie (# 2015HJDL03), und die naturwissenschaftlichen Grundlage der Provinz Shandong, China (ZR2017BF041).

Das Protokoll folgt den Tierbetreuung Richtlinien der Tier-Ethik-Kommission des Peking-Zentrums für die Prävention und die Kontrolle in China.
1. chemische Aufbereitung
<ol><li>Chemikalien (Tabelle 1 und Tabelle of Materials) erhalten.</li>
	<li>Bestimmen Sie die höchste und die niedrigste Dosierung der einzelnen Chemikalien für eine minimale Konzentration von 100 % Letalität (LC100, 24 h) und eine maximale Konzentration von 100 % Nonlethality (LC0, 24 ...

<ol>
	<li>Anderson, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+behavioral+toxicity+with+Caenorhabditis+elegans.">Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+assessing+chemical+toxicity+using+a+Caenorhabditis+elegans+reproduction+assay.">A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).</li><li>Boyd, W. A., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+sensitivity+of+three+nematode+species+to+copper+and+their+utility+in+aquatic+and+soil+toxicity+tests.">Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).</li><li>Dengg, M., van Meel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+model+system+for+rapid+toxicity+assessment+of+pharmaceutical+compounds.">Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).</li><li>Schouest, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+assessment+of+chemicals+using+Caenorhabditis+elegans+and+optical+oxygen+respirometry.">Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).</li><li>Sprando, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+rank+order+water+soluble+compounds+according+to+their+toxicity+using+Caenorhabditis+elegans,+a+Complex+Object+Parametric+Analyzer+and+Sorter,+and+axenic+liquid+media.">A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media.</a> Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).</li><li>Wang, D., Xing, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+locomotion+behavioral+defects+induced+by+acute+toxicity+from+heavy+metal+exposure+in+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology.</a> Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+chemical+acute+toxicity+between+the+nematode+and+the+rodent.">Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent.</a> Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+genetic+mutations+and+chemical+exposures+on+Caenorhabditis+elegans+feeding:+evaluation+of+a+novel,+high-throughput+screening+assay.">Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay.</a> PLoS One. 2 (12), 1259 (2007).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+and+prediction+of+toxicity+of+chemicals+using+an+automated+phenotypic+profiling+of+Caenorhabditis+elegans.">Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18 (2018).</li><li>Moyson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+effects+of+copper,+cadmium,+and+zinc+on+mortality+and+behavior+of+Caenorhabditis+elegans.">Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+DMSO+is+dependent+on+sir-2.1+and+daf-16.">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Effect+of+the+ToxCast+Phase+I+and+Phase+II+Chemicals+in+Caenorhabditis+elegans+and+Corresponding+Responses+in+Zebrafish,+Rats,+and+Rabbits.">Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits.</a> Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).</li></ol>

Die Vorteile von C. Elegans führten zu seiner zunehmenden Verwendung in Toxikologie9, sowohl für mechanistische Studien und Hochdurchsatz-Screening Ansätze. Eine stärkere Rolle für C. Elegans in Ergänzung zu anderen Modellsysteme in der toxikologischen Forschung hat in den letzten Jahren, vor allem für die schnelle Toxizität Bewertung neuer Chemikalien beachtlich. Dieser Artikel enthält eine neue quantitative Hochdurchsatz-Screening von Wurm-Assay Phänotypen in einem 38...

Zusammen mit der rasanten Entwicklung von chemischen Verbindungen, die auf industrielle Produktion und Menschen das tägliche Leben angewendet ist es wichtig, die Toxizitätstests Modelle für die Chemie zu studieren. In vielen Fällen ist das Nagetiere Tiermodell eingesetzt, um die mögliche Toxizität von Chemikalien auf die Gesundheit zu bewerten. Im Allgemeinen dient die Bestimmung der tödliche Konzentrationen (d. h., die vermutlich 50 % tödliche Dosis [LD50] verschiedener chemischer Stoffe) als traditionelle Parameter in einem in-vivo, Nager (Ratte/Maus) Modell ist aufwendig und sehr teuer. Darüber hinaus durch die Reduzierung zu verfeinern Sie, oder ersetzen Sie (3R) Prinzip, das den Tierschutz und Ethik im Mittelpunkt steht, neue Methoden, mit denen für der Ersatz von höheren Tieren sind wertvolle wissenschaftliche Forschung1,2,3 . C. Elegans ist eine freilebende Nematoden, die aus dem Boden isoliert wurde. Es wurde weithin als Organismus Forschung im Labor aufgrund seiner vorteilhaften Eigenschaften, wie eine kurze Lebensdauer, einfache Kultivierung und effiziente Reproduktion verwendet. Darüber hinaus sind viele grundlegende biologischer Signalwege, darunter grundlegende physiologische Prozesse und Stressreaktionen in C. Elegans in höheren Säugetiere4,5,6,7 konserviert. , 8. in ein paar Vergleiche wir und andere haben, gibt es eine gute Übereinstimmung zwischen C. Elegans Toxizität und Toxizität bei Nagetieren9beobachtet. All dies macht C. Elegans ein gutes Modell, die Auswirkungen der chemischen Toxizität in vivo zu testen.
Vor kurzem, einige Studien quantifiziert die phänotypische Merkmale von C. Elegans. Die Funktionen können verwendet werden, um die Toxizität von Chemikalien2,3,10 und die Alterung der Würmer11zu analysieren. Wir entwickelten auch eine Methode, die kombiniert einen flüssigen Wurm Kultivierung System und eine Bild-Analyse-System, in dem die Würmer in einem 384-Well-Platte unter verschiedenen chemischen Behandlungen12kultiviert sind. Dieses quantitative Verfahren wurde entwickelt, um die 33 Parameter von C. Elegans automatisch nach 12-24 h chemische Behandlung in einem 384-Well-Platte mit flüssigen Medium zu analysieren. Eine automatisierte Mikroskoptisch dient zur experimentellen Videoerfassung. Die Videos werden von einem maßgeschneiderten Programm verarbeitet, und 33 Funktionen im Zusammenhang mit den Würmern beweglichen Verhalten quantifiziert. Die Methode wird verwendet, um den Wurm Phänotypen unter der Behandlung von 10 Verbindungen zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigen, dass unterschiedliche Toxizitäten der Phänotypen von C. Elegansverändern können. Diese quantifizierten Phänotypen können verwendet werden, zu identifizieren und vorherzusagen, die akute Toxizität von verschiedenen chemischen Verbindungen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Beobachtung und phänotypischen Quantifizierung von Experimenten mit C. Elegans in einer flüssigen Kultur zu erleichtern. Diese Methode eignet sich für den Einsatz von C. Elegans in chemische Toxizität Auswertungen und Phänotyp Quantifizierungen, die helfen, vorherzusagen, die akute Toxizität von verschiedenen chemischen Verbindungen und etablieren eine Prioritätenliste für weitere traditionelle chemische Toxizität Assessment-Tests in einem Nagetier-Modell. Darüber hinaus kann diese Methode auf die Toxizität screening und Erprobung von neuen Chemikalien oder die Verbindung als Lebensmittel Zusatzstoff Agent Verschmutzung, Pharmacautical Verbindungen, ökologische exogene Substanz und So weiter angewendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">59300</td>
			<td style="width:407px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384-well plates</td>
			<td style="width:171px;">Throme</td>
			<td style="width:175px;">142761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Bacto</td>
			<td style="width:175px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Atropine sulfate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">PHL80892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Bleach buffer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">21074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CCD camera</td>
			<td style="width:171px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">AxioCam HRm</td>
			<td style="width:407px;">Zeiss microscopy GmbH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">24105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Glycerol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">K-Medium</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">LB Broth&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">10&#160;g/L&#160;Tryptone,&#160;5&#160;g/L&#160;Yeast&#160;Extract,&#160;5&#160;g/L&#160;NaCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:207px;">NGM Plate</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td>Bacto</td>
			<td style="width:175px;">211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">795496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">795488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">PPB buffer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">shaker</td>
			<td style="width:171px;">ZHICHENG</td>
			<td style="width:175px;">ZWY-200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">71382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium fluoride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">s7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">239305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">The link of program</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Zeiss automatic microscope&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">AXIO Observer.Z1</td>
			<td style="width:407px;">Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by automated phenotypic profiling of caenorhabditis elegans

Toxizitätstests von Chemikalien in der höheren Ordnung Organismen, wie Mäusen oder Ratten, die Anwendung ist zeitaufwändig und teuer, wegen ihrer langen Lebensdauer und Wartungsprobleme. Im Gegenteil, der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) hat Vorteile machen es ideal für Toxizitätstests: eine kurze Lebensdauer, einfache Kultivierung und effiziente Reproduktion. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die automatische phänotypischen Profilierung von C. Elegans in einem 384-Well-Platte. Die Fadenwürmer sind kultiviert in einem 384-Well-Platte mit flüssigen Mittel und chemische Behandlung und Videos stammen von jedem Bohrloch zur Quantifizierung des chemischen Einfluss auf 33 Wurm-Funktionen. Experimentelle Ergebnisse zeigen, dass die quantifizierten Phänotyp-Features können klassifizieren und, die akute Toxizität für verschiedene chemische Verbindungen Vorhersagen und eine Prioritätenliste für weitere traditionelle chemische Toxizität Assessment-Tests in einem Nagetier Modell zu etablieren.

Wir haben die Phänotypen von Würmern ausgesetzt, unterschiedliche Konzentrationen von mehr als 10 Chemikalien12getestet. Im Test waren 33 besondere Merkmale für jede chemische Verbindung zu drei Zeitpunkten (0 h, 12 h und 24 h) quantifiziert. Zuvor erfolgte ein Vergleich zwischen einer manuellen und einer automatischen Analyse eines Lebensdauer Assays11,12. In diesem Test fanden wir, dass Chemikalien und...

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A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Eine quantitative Methode wurde entwickelt, um zu identifizieren und die akute Toxizität von Chemikalien durch die automatisch analysieren die phänotypische Profilierung von Caenorhabditis ElegansVorhersagen. Dieses Protokoll beschreibt die Würmer mit Chemikalien zu behandeln, in einem 384-Well-Platte, Videos aufzunehmen und toxikologischen Verwandte Phänotypen zu quantifizieren.

Ein High-Throughput-Assay für die Vorhersage der chemischen Toxizität durch automatisierte phänotypischen Profilierung von Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

C.elegans toxikologische Assay ist wertvoll. Dieses Protokoll beschreibt, wie C.elegans mit Chemikalien in einer 384-Well-Platte behandelt, Videos erfasst und toxikologische Phänotypen quantifiziert werden. Diese Methode könnte helfen, die potenzielle akute Toxizität einer Chemikalie zu identifizieren und vorherzusagen.Diese quantitative Technik wurde entwickelt, um die 33 Parameter von C.elegans nach 12 bis 24 Stunden chemischer Behandlung in einer 384-Well-Platte mit flüssigem Medium automatisch zu analysieren. C.elegans ist als gutes Modell für die schnelle Toxizitätsbewertung neuer Chemikalien wertvoll. Als Mäuse, Es kann auf die Toxizität Screening und Prüfung von neuen Chemikalien angewendet werden, oder die Verbindung als Lebensmittelzusatzstoff Agent Verschmutzung, pharmazeutische Verbindung, Umwelt exogene Verbindung, und so weiter.Lesen Sie das Protokoll sorgfältig und immer folgen Sie mit Schritt für Schritt, dann werden Sie der gute sein. Die visuelle Demonstration ist für den Benutzer einfacher, den Vorgang der einzelnen Schritte und das Ergebnis des Vorgangs anzuzeigen. Die Demonstration des Verfahrens wird Wenjing Zhang und Gaochao Han sein.Sie sind Doktoranden aus meinem Labor. Um zu beginnen, führen Sie einen vorläufigen Wurm-Letalitätstest für eine neue Chemikalie, um die höchste Dosierung zu bestimmen, und die niedrigste Dosierung, die die minimale Konzentration von 100% Letalität sind, und die maximale Konzentration von 100%nicht-tödlich. Für dieses Experiment sieben Gradientenkonzentrationen von Cadmiumchlorid vorbereiten.Um das Zweifache der höchsten konzentrierten wässrigen Lösung herzustellen, lösen Sie 92,8 Milligramm Cadmiumchlorid-Festpulver in einem Zentrifugenrohr auf, das mit acht Millilitern K-Medium gefüllt ist. Wirbel zu mischen. Nachdem das Pulver vollständig gelöst ist, verwenden Sie eine Pipette, um bis zu 10 Milliliter zu füllen.Bereiten Sie die anderen Konzentrationen durch Verdünnung mit K Medium vor. In einer super sauberen Bank, verwenden Sie eine sterile Spitze, um eine einzelne Kolonie von E.coli OP50 aus der Streifenplatte zu pflücken, und legen Sie es in den Kolben mit 100 MilliliterLB-Brühe, um die Kolonie zu impfen. Wachsen Sie es über Nacht bei 37 Grad Celsius im Inkubator-Shaker.NGM in eine 90 Milliliter Kunststoff-Petriplatte gießen. Samen jede Platte mit 300 Mikroliter E.coli OP50 Lösung. N2-Würmer auf den NGM-Platten mit OP50 bei 20 Grad Celsius für etwa 2 bis 3 Tage inkubieren, bis die meisten Würmer das Erwachsenenstadium erreicht haben.Mit sterilem Wasser gravid Würmer in ein 15 Milliliter steriles konisches Zentrifugenrohr abwaschen, um sie zu ernten. Lassen Sie die Würmer für mindestens 2 Minuten absetzen. Das Wasser ansaugen und fünf Milliliter Bleichpuffer hinzufügen.Wirbeln Sie das Rohr für fünf Minuten, und legen Sie dann das Rohr in einer Zentrifuge, um mit einer relativen Zentrifugalkraft von 1300 für 30 Sekunden zu drehen, um die Eier zu pellet. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu aspirieren. Fügen Sie fünf Milliliter sterilisiertes Wasser in die Röhre, um die Eier zu waschen, und wirbeln Sie die Röhre für fünf Sekunden.Zentrifugieren Sie das Rohr für 30 Sekunden, bei einer relativen Fliehkraft von 1300. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie fünf Milliliter sterilisiertes Wasser wieder zu waschen. Die Eier auf eine neue NGM-Platte mit OP50 pfeifen.Bebrüte sie über Nacht bei 20 Grad Celsius. Am nächsten Morgen erreichen die geschlüpften Würmer die L1-Stufe. Nach ca. 40 Stunden erreichen die Würmer die L4-Stufe.Mit K Medium die L4-Bühnenwürmer von den Petriplatten in ein 50 Milliliter steriles Konusrohr waschen. Pipette 50 Mikroliter der Wurmflüssigkeit aus dem Rohr zu einem Glasschlitten. Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop eine Pipette, um die Konzentration von Würmern auf etwa 40 Tiere pro 100 Mikroliter K-Medium einzustellen.50 Mikroliter des vorbereiteten Mediums in jeden Brunnen der 384-Well-Platte geben. Diese synchronisierten L4-Bühnenwürmer sind bereit für die weitere Behandlung durch Chemikalien. Bevor Sie die Chemikalien hinzufügen, legen Sie die 384-Well-Platte mit den synchronisierten Würmern auf die automatische Bühne und richten Sie eine Videokamera mit dem programmierten Erfassungsverfahren ein.In der 384-Well-Platte werden Würmer mit sechs bis sieben Dosierungen jeder einzelnen Chemikalie behandelt, mit acht parallelen Brunnen, die 50 Mikroliter der zweifachen chemischen Lösung für jede Dosierung enthalten. Bereiten Sie mindestens drei Gruppen von acht parallelen Brunnen des K-Mediums als Steuerung vor. Fügen Sie 50 Mikroliter der zweifachen chemischen Lösung für jeden Brunnen hinzu.Legen Sie die Zeit als Null-Stunden-Punkt fest. Dann legen Sie die 384-Well-Platte in den Inkubator-Shaker gesetzt bei 20 Grad Celsius, und 80 Umdrehungen pro Minute. Nach einer gewünschten Zeit die Platte aus dem Inkubator entfernen und auf die automatische Stufe übertragen.Nehmen Sie Videos von jedem Brunnen der Platte, bei 12 Stunden, und bei 24 Stunden, um die Phänotypen der Würmer zu überprüfen. Um mit der Verarbeitung des experimentellen Videos zu beginnen, übertragen Sie die Videodateien auf den Computer. Klicken Sie über die grafische Benutzeroberfläche auf die Schaltfläche Auswählen, um das Quellbildverzeichnis auszuwählen.Fügen Sie das mittlere Ergebnisverzeichnis hinzu. Die mittleren Ergebnisse umfassen die segmentierten Bilder, die für die visuelle Beobachtung der verarbeiteten Bilder nützlich sind. Fügen Sie das endgültige Ergebnisverzeichnis in der Schnittstelle hinzu.Legen Sie den Parameter für die durchschnittliche Wurmgröße im Textfeld Wurmgröße in der Schnittstelle auf 2 000 fest. Legen Sie den Schwellenwert für das bewegte Verhältnis in der Schnittstelle auf 0,93 fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analysieren, um die Bildverarbeitung zu starten.Das entwickelte Programm kann Würmer erkennen und Phänotypen automatisch quantifizieren. In diesem Experiment wurden 33 verschiedene Merkmale für die Cadmiumchloridbehandlung zu drei Zeitpunkten, Null-Stunden, 12 Stunden und 24 Stunden quantifiziert. Experimentelle Bilder zeigen, dass die Würmer schneller starben, als die chemische Konzentration zunahm.Am Anfang gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen der Kontrolle und chemischen Behandlungen. Nach 12 Stunden Behandlung wurden die mit hoher Konzentration behandelten Würmer gerader und weniger gekrümmt als bei niedrigeren Konzentrationen oder in Kontrollgruppen. Die Hauptachsenlänge des wurmkörperbedeckten Bereichs nahm mit zunehmender Zeit zu.Es gibt auch einen Gradiententrend von niedrigeren zu höheren chemischen Konzentrationen sowohl in der Hauptachse als auch in der kleineren Achslänge. Die Würmer-Motilität, basierend auf der Fläche und dem Verhältnis, zeigte ähnliche Muster. Am Anfang wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet.Im Laufe der Zeit zeigten die Würmer in der Kontrollgruppe eine stabile Abnahme der Beweglichkeit. Nach 12 und 24 Stunden zeigten die mit Cadmiumchlorid behandelten Würmer signifikante Unterschiede in der Beweglichkeit im Vergleich zu Kontrollgruppen. Darüber hinaus zeigten die Würmer unter höherkonzentrationsstärkeren Behandlungen eine schwächere Beweglichkeit im Vergleich zu den Würmern unter Behandlungen mit niedrigerer Konzentration.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Technik einen Weg zur schnellen Toxizitätsbewertung in mehreren Bereichen ebnet. Forscher, die das Verfahren auf die Notfallanalyse der Toxizität bei lebensmittelbedingter Toxikose, die Sicherheitsbewertung pharmazeutischer Verbindungen sowie das Screening akuter Toxizität und den Nachweis neuer Chemikalien und der umwelt-exogenen Verbindungen anwenden könnten. Das Cadmiumchlorid ist eine niedrig giftige Substanz.Bitte tragen Sie während der Handhabung Handschuhe und eine Maske und befolgen Sie die Bedienungsanleitung.

Research

JoVE Journal

Environment

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Bestimmung mikrobieller extrazelluläre Enzymaktivität in Wasser, Böden und Sedimente mit hohem Durchsatz Mikrotiterplatten-Assays

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Forschung

Umwelt

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Hochdurchsatz-Fluorometric Messung der Boden Mögliche Extrazelluläre Enzymaktivitäten

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimierte negative Färbung: ein Hochdurchsatz-Protokoll für die Prüfung kleiner und asymmetrische Proteinstruktur durch Elektronenmikroskopie

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Physical, Chemical and Biological Characterization of Six Biochars Produced for the Remediation of Contaminated Sites

Physikalische, chemische und biologische Charakterisierung von Six Biokohlen Produziert für die Sanierung von Altlasten

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Hochdurchsatz-Screening von Widerspenstigkeit Variationen in Lignocellulose-reicher Biomasse: Gesamt Lignin, Lignin-Monomeren und enzymatische Zuckerfreisetzung

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Hochdurchsatz-Microscale Protokoll für die Analyse der Verarbeitungsparameter und ernährungsphysiologischen Eigenschaften in Mais (Zea Mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Eine 3-dimensionale (3D)-gedruckte Vorlage für hohen Durchsatz Zebrafish Embryos anordnen

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderophore Hochdurchsatz-Screening von Umweltproben: Pflanzen, Gewebe, lose Böden und Rhizosphäre Böden

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Verwendung von Caenorhabditis elegans zur Untersuchung der trans- und mehrgenerationenlichen Wirkungen von Toxischen Stoffen

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Standardisierte Methoden zur Messung der Induktion der Hitzeschockreaktion bei Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...