Name: a high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by automated phenotypic profiling of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-14T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

המחברים מודים CGC על מתבקשים לשלוח את C. elegans. עבודה זו נתמכה על ידי מפתח הלאומית למחקר פיתוח תוכנית של סין (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); קרן מדעי הטבע הלאומית של סין גרנט (#31401025, #81273108 #81641184), בריאות ההון מחקר ופיתוח של פרויקט מיוחד בבייג'ינג (#2011-1013-03), הקרן הפתיחה של בייג'ינג המעבדה מפתח של טוקסיקולוגיה סביבתית (# 2015HJDL03), בסיס מדעי הטבע מחוז שאנדונג, סין (ZR2017BF041).

הפרוטוקול מנחים את טיפול בבעלי חיים של ועדת האתיקה חיה במרכז בייג'ינג למניעת מחלות ובקרה בסין.
1. הכנה כימי
<ol><li>להשיג כימיקלים (טבלה 1 ו לטבלה של חומרים).</li>
	<li>לקבוע את המינון הגבוהים והנמוכים ביותר של כימיקלים בודדים ריכוז מינימלי של 100% הקטלניות (LC100, 24 שעו...

<ol>
	<li>Anderson, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+behavioral+toxicity+with+Caenorhabditis+elegans.">Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+assessing+chemical+toxicity+using+a+Caenorhabditis+elegans+reproduction+assay.">A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).</li><li>Boyd, W. A., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+sensitivity+of+three+nematode+species+to+copper+and+their+utility+in+aquatic+and+soil+toxicity+tests.">Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).</li><li>Dengg, M., van Meel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+model+system+for+rapid+toxicity+assessment+of+pharmaceutical+compounds.">Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).</li><li>Schouest, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+assessment+of+chemicals+using+Caenorhabditis+elegans+and+optical+oxygen+respirometry.">Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).</li><li>Sprando, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+rank+order+water+soluble+compounds+according+to+their+toxicity+using+Caenorhabditis+elegans,+a+Complex+Object+Parametric+Analyzer+and+Sorter,+and+axenic+liquid+media.">A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media.</a> Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).</li><li>Wang, D., Xing, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+locomotion+behavioral+defects+induced+by+acute+toxicity+from+heavy+metal+exposure+in+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology.</a> Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+chemical+acute+toxicity+between+the+nematode+and+the+rodent.">Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent.</a> Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+genetic+mutations+and+chemical+exposures+on+Caenorhabditis+elegans+feeding:+evaluation+of+a+novel,+high-throughput+screening+assay.">Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay.</a> PLoS One. 2 (12), 1259 (2007).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+and+prediction+of+toxicity+of+chemicals+using+an+automated+phenotypic+profiling+of+Caenorhabditis+elegans.">Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18 (2018).</li><li>Moyson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+effects+of+copper,+cadmium,+and+zinc+on+mortality+and+behavior+of+Caenorhabditis+elegans.">Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+DMSO+is+dependent+on+sir-2.1+and+daf-16.">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Effect+of+the+ToxCast+Phase+I+and+Phase+II+Chemicals+in+Caenorhabditis+elegans+and+Corresponding+Responses+in+Zebrafish,+Rats,+and+Rabbits.">Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits.</a> Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).</li></ol>

היתרונות של C. elegans הובילו השימוש הגובר הרעלים9, הן עבור מחקרים מכניסטית וגישות ההקרנה תפוקה גבוהה. תפקיד מוגבר עבור C. elegans משלימים למערכות אחרות דגם במחקר רעילות הינו יוצא דופן בשנים האחרונות, במיוחד להערכה מהירה רעילות של כימיקלים חדשים. מאמר זה מספק וזמינותו החדש ש?...

עם התפתחות מהירה של תרכובות כימיות שהוחלה על הייצור התעשייתי ועל חיי היומיום של אנשים, חשוב ללמוד רעילות בדיקת מודלים כימיקלים. במקרים רבים, המודל החייתי מכרסמים הוא מועסק כדי להעריך את פוטנציאל רעילות של כימיקלים שונים על הבריאות. באופן כללי, הקביעה של ריכוזים קטלני (קרי, assayed 50% מנה קטלנית [LD50] של כימיקלים שונים) משמש כפרמטר מסורתי במודל מכרסם (עכברוש/עכבר) אין ויוו, וזה זמן רב ויקר מאוד. בנוסף, בשל הקטן, לחדד, או להחליף את העיקרון (3R) היא מרכזית בעלי חיים רווחה, אתיקה מקצועית, שיטות חדשות המאפשרות עבור ההחלפה של בעלי חיים גבוהים יותר הם בעלי ערך מחקר מדעי-1,-2,-3 . C. elegans הוא תולעים נימיות אל-אווירני עצמאי אשר היה מבודד מן הקרקע. זה כבר בשימוש נרחב כאורגניזם מחקר במעבדה בשל מאפייניו מועילים, כגון אורך קצר, טיפוח קל, יעיל רבייה. בנוסף, הרבה מסלולים ביולוגיים בסיסיים, כולל תהליכים פיזיולוגיים בסיסיים ותגובות הלחץ ב- C. elegans, נשמרים ב-6,5,4,יונקים גבוהה יותר7 , 8. כמה השוואות אנחנו ואחרים עשו, יש הקונקורדנציה טוב בין C. elegans רעילות רעילות שנצפתה מכרסמים9. כל זה הופך את C. elegans מודל טוב כדי לבדוק את השפעות רעילות כימית ויוו.
לאחרונה, מחקרים לכמת את התכונות פנוטיפי של C. elegans. התכונות ניתן לנתח את רעילות של כימיקלים2,3,10 , הזדקנות תולעים11. גם פיתחנו שיטה המשלבת תולעת נוזלי culturing מערכת, מערכת ניתוח התמונה, שבה התולעים הם בתרבית בצלחת 384-ובכן תחת טיפולים כימיים שונים12. טכניקה זו כמותיים פותחה לנתח באופן אוטומטי את הפרמטרים 33 של C. elegans לאחר 12-24 שעות של טיפול כימי בצלחת 384-ובכן עם המדיום הנוזלי. שלב במיקרוסקופ אוטומטי משמש עבור רכישת וידאו ניסיוני. קטעי וידאו מעובדות על-ידי תוכנית אישית מעוצבת, 33 תכונות הקשורות להתנהגות נע של התולעים הם לכמת. השיטה משמשת כדי לכמת את התולעת פנוטיפים תחת הטיפול של תרכובות 10. התוצאות מציגות כי רעילות שונים יכולים לשנות על הפנוטיפים של C. elegans. אלה פנוטיפים כימות יכול לשמש כדי לזהות ולחזות רעילות חריפה של תרכובות כימיות שונות. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להקל על תצפיות ועל כימות פנוטיפי של ניסויים עם C. elegans בתרבות נוזלי. שיטה זו שימושית עבור היישום של C. elegans הערכות רעילות כימית, פנוטיפ quantifications, אשר מסייעים לחזות רעילות חריפה של תרכובות כימיות שונות וליצור רשימת סדר העדיפויות עבור עוד יותר מסורתי בדיקות הערכת כמות רעילה במודל של מכרסמים. בנוסף, שיטה זו ניתן ליישם רעילות הקרנת ובדיקות של כימיקלים חדשים או המתחם ' זיהום הסוכן כתוסף מזון, תרכובות pharmacautical, סביבה אקסוגניים המתחם, וכן הלאה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">59300</td>
			<td style="width:407px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384-well plates</td>
			<td style="width:171px;">Throme</td>
			<td style="width:175px;">142761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Bacto</td>
			<td style="width:175px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Atropine sulfate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">PHL80892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Bleach buffer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">21074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CCD camera</td>
			<td style="width:171px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">AxioCam HRm</td>
			<td style="width:407px;">Zeiss microscopy GmbH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">24105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Glycerol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">K-Medium</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">LB Broth&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">10&#160;g/L&#160;Tryptone,&#160;5&#160;g/L&#160;Yeast&#160;Extract,&#160;5&#160;g/L&#160;NaCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:207px;">NGM Plate</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td>Bacto</td>
			<td style="width:175px;">211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">795496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">795488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">PPB buffer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">shaker</td>
			<td style="width:171px;">ZHICHENG</td>
			<td style="width:175px;">ZWY-200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">71382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium fluoride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">s7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">239305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">The link of program</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Zeiss automatic microscope&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">AXIO Observer.Z1</td>
			<td style="width:407px;">Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by automated phenotypic profiling of caenorhabditis elegans

החלת בדיקות רעילות של כימיקלים עילאיים הסדר, כגון עכברים או חולדות, היא גוזלת זמן יקר, בשל תוחלת החיים הארוכה שלהם בעיות תחזוקה. להיפך, תולעים נימיות Caenorhabditis elegans (C. elegans) יש יתרונות כדי שזה הבחירה האידיאלית לבדיקת רעילות: אורך קצר, טיפוח קל, יעיל רבייה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור אוטומטית פנוטיפי בניית פרופיל של C. elegans בצלחת 384-. טוב. תולעים נמטודות בתרבית בצלחת 384-טוב עם טיפול כימי ובינוניות נוזלי, קטעי וידאו נלקחים כל הבאר כדי לכמת את ההשפעה הכימית על תכונות תולעת 33. תוצאות ניסויית מדגימים כי התכונות פנוטיפ כימות ניתן לסווג לחזות רעילות חריפה על תרכובות כימיות שונות, ליצור רשימה עדיפות לבדיקות רעילות כימית מסורתי הערכת במודל של מכרסמים.

בדקנו על הפנוטיפים של תולעים נחשפים ריכוזים שונים של כימיקלים יותר מ- 1012. במבחן, 33 תכונות שונות היו לכמת עבור כל תרכובת שלוש נקודות זמן (או 12 שעות, 24 שעות ביממה). בעבר, נעשתה השוואה בין מדריך ניתוח אוטומטי של assay תוחלת החיים11,12. זה ...

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

שיטה כמותית פותחה כדי לזהות ולחזות את רעילות חריפה של כימיקלים על-ידי ניתוח באופן אוטומטי את פרופיל פנוטיפי של Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה מתאר כיצד להתייחס תולעים עם כימיקלים בצלחת 384-ובכן, לכידת וידאו, לכמת פנוטיפים קשורים רעילות.

וזמינותו תפוקה גבוהה עבור חיזוי של רעילות כימית על ידי אוטומטית פרופילים פנוטיפי של Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

ההתמדה הטוקסיקולוגית של C.elegans היא בעלת ערך. פרוטוקול זה מתאר כיצד לטפל C.elegans עם כימיקלים בצלחת 384 באר, ללכוד קטעי וידאו, ולכימת פנוטיפים הקשורים טוקסיקולוגיה. שיטה זו יכולה לעזור לזהות ולחזות רעילות חריפה פוטנציאלית של כימיקל.טכניקה כמותית זו פותחה כדי לנתח באופן אוטומטי את 33 הפרמטרים של C.elegans לאחר 12 עד 24 שעות של טיפול כימי בצלחת 384 באר עם מדיום נוזלי. C.elegans הוא בעל ערך כמודל טוב של הערכת רעילות מהירה עבור כימיקלים חדשים. כמו עכברים, זה יכול להיות מיושם על הקרנה רעילות ובדיקה של כימיקלים חדשים, או המתחם כמו זיהום סוכן תוסף מזון, תרכובת התרופות, תרכובת אקסוגניים הסביבה, וכן הלאה.קרא את הפרוטוקול בעיון ותמיד בצע את צעד אחר צעד, אז אתה תהיה אחד טוב. להדגמה חזותית קל יותר למשתמש לראות את הפעולה של כל שלב ואת תוצאת הפעולה. הדגמת ההליך תהיה ואנג'ינג ג'אנג וגאוצ'או האן.הם סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, לבצע בדיקת קטלניות תולעת ראשונית עבור כימיקל חדש, כדי לקבוע את המינון הגבוה ביותר, ואת המינון הנמוך ביותר, שהם הריכוז המינימלי של 100% קטלניות, ואת הריכוז המרבי של 100% לא קטלני. לניסוי זה, הכינו שבעה ריכוזים הדרגתיים של קדמיום כלורי.כדי להכין פי שניים מהתמיסה המקווית המרוכזת הגבוהה ביותר, יש להמיס 92.8 מיליגרם של אבקת קדמיום כלוריד מוצקה בצינור צנטריפוגה מלא בשמונה מיליליטר של K medium. וורטקס לערבב. לאחר האבקה מומסת במלואה, להשתמש פיפטה כדי למלא עד 10 מיליליטר.מכינים את רמות הריכוז האחרות על ידי דילול עם K בינוני. בספסל סופר נקי, השתמש בקצה סטרילי כדי לבחור מושבה אחת של E.coli OP50 מצלחת הפסים, והצב אותו בבקבוקון עם 100 מיליליטר של מרק LB כדי לחסן את המושבה. לגדל אותו לילה ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר החממה.יוצקים NGM לתוך צלחת פטרי פלסטיק 90 מיליליטר. זרע כל צלחת עם 300 מיקרוליטרים של פתרון E.coli OP50. דגירה תולעי N2 על לוחות NGM עם OP50 ב 20 מעלות צלזיוס במשך כ 2 עד 3 ימים, עד שרוב התולעים הגיעו לשלב הבוגר.עם מים סטריליים, לשטוף תולעים gravid לתוך צינור צנטריפוגה חרוט סטרילי 15 מיליליטר לקצור. תן לתולעים להתיישב לפחות 2 דקות. שאפו את המים והוסיפו חמישה מיליליטר של חיץ אקונומיקה.Vortex הצינור במשך חמש דקות, ולאחר מכן לשים את הצינור בצנטריפוגה להסתובב בכוח צנטריפוגלי יחסית של 1300 במשך 30 שניות כדי גלולה הביצים. השתמש בפיפטה כדי לשאפת את העל-טבעי. מוסיפים חמישה מיליליטר של מים מעוכלים לתוך הצינור כדי לשטוף את הביצים, ומערבולת הצינור במשך חמש שניות.צנטריפוגה הצינור במשך 30 שניות, בכוח צנטריפוגלי יחסית של 1300. מוציאים את העל-טבעי ומוסיפים חמישה מיליליטר של מים מעוכלים כדי לשטוף שוב. פיפטה הביצים על צלחת NGM חדשה עם OP50.דגירה אותם ב 20 מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, התולעים הבקעות מגיעות לשלב L1. לאחר כ-40 שעות, התולעים מגיעות לשלב L4.עם K בינוני, לשטוף את תולעי הבמה L4 את צלחות פטרי לתוך צינור חרוט סטרילי 50 מיליליטר. פיפטה 50 מיקרוליטרים של נוזל התולעת מהצינור למגלשת זכוכית. תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש בפיגט כדי להתאים את ריכוז התולעים לכ-40 בעלי חיים לכל 100 מיקרוליטרים של K מדיום.מוסיפים 50 מיקרוליטרים של המדיום המוכן לכל באר של צלחת 384 באר. תולעי שלב L4 מסונכרנות אלה מוכנות לטיפול הבא על ידי כימיקלים. לפני הוספת הכימיקלים, מניחים את לוחית 384 הבאר, עם התולעים המסונכרנות על הבמה האוטומטית, והגדירו מצלמת וידאו עם הליך הרכישה מתוכנת.בצלחת 384 באר, תולעים מטופלים עם שישה עד שבעה מינונים של כל כימיקל בודדים, עם שמונה בארות מקבילות המכילות 50 microliters של פתרון כימי פעמיים עבור כל מינון. הכן לפחות שלוש קבוצות של שמונה בארות מקבילות של K medium כפקד. הוסף 50 microliters של פתרון כימי פעמיים עבור כל באר.הגדר את השעה כנקודת האפס-שעה. לאחר מכן, שים את הצלחת 384 היטב בשייקר החממה להגדיר ב 20 מעלות צלזיוס, ו 80 מהפכות לדקה. לאחר הזמן הרצוי, מוציאים את הצלחת מהחמה ומעבירים לשלב האוטומטי.קח קטעי וידאו של כל באר של הצלחת, ב 12 שעות, וב 24 שעות כדי לבדוק את פנוטיפים של התולעים. כדי להתחיל לעבד את הווידאו הניסיוני, העבר את קבצי הווידאו למחשב. באמצעות ממשק המשתמש הגרפי, לחץ על לחצן בחר, כדי לבחור את ספריית תמונות המקור.הוסף את ספריית התוצאות האמצעית. התוצאות האמצעיות כוללות את התמונות המיכללות, השימושיות להתבוננות החזותית בתמונות המעובדות. הוסף את ספריית התוצאות הסופית בממשק.הגדר את פרמטר גודל התולעת הממוצע כ- 2, 000, בתיבת הטקסט גודל תולעת בממשק. הגדר את סף היחס שהועבר ב- 0.93 בממשק. לחץ על לחצן נתח כדי להתחיל את עיבוד התמונה.התוכנית שפותחה יכולה לזהות תולעים ולכרות פנוטיפים באופן אוטומטי. בניסוי זה, 33 תכונות שונות כומתו לטיפול קדמיום כלורי בשלוש נקודות זמן, אפס שעות, 12 שעות, ו 24 שעות. תמונות ניסיוניות מראות שהתולעים מתו מהר יותר ככל שהריכוז הכימי גדל.בהתחלה לא היה הבדל משמעותי בין הבקרה לטיפולים כימיים. לאחר 12 שעות של טיפול, התולעים שטופלו בריכוז גבוה הפכו ישרות יותר ומעוקלת פחות מאשר בריכוזים נמוכים יותר או בקבוצות ביקורת. אורך הציר הראשי של אזור מכוסה גוף התולעת גדל ככל שהזמן גדל.יש גם מגמה הדרגתית מריכוזים כימיים נמוכים עד גבוהים יותר הן בציר הראשי והן באורך הציר המשני. תנועתיות התולעים, המבוססת על האזור ועל היחס, הראתה דפוסים דומים. לא נצפה הבדל משמעותי בהתחלה.ככל שהזמן עבר, התולעים בקבוצת הביקורת הראו ירידה יציבה במניע. לאחר 12 ו -24 שעות, התולעים שטופלו בקרמיום כלוריד הראו הבדלים משמעותיים בהנעה, בהשוואה לקבוצות ביקורת. בנוסף, התולעים תחת טיפולים בריכוז גבוה יותר הראו תנועתיות חלשה יותר, בהשוואה לתולעים תחת טיפולי ריכוז נמוכים יותר.לסיכום, טכניקה זו סוללת דרך להערכת רעילות מהירה בתחומים מרובים. חוקרים שיכולים ליישם את השיטה לניתוח חירום של רעילות במזון המועבר רעילות, הערכת הבטיחות של תרכובות התרופות, כמו גם הקרנת רעילות חריפה, וזיהוי של כימיקלים חדשים, ואת תרכובות אקסוגני הסביבה. קדמיום כלוריד הוא חומר רעיל נמוך.אנא לבשו כפפות ומסכה במהלך הטיפול, ופעלו בהתאם להוראות ההפעלה.

Research

JoVE Journal

Environment

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

קביעת מיקרוביאלית התאית אנזים הפעילות במים, קרקעות, ומשקעים באמצעות מבחני Microplate תפוקה גבוהה

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

תפוקה גבוהה fluorometric מדידה של קרקע פוטנציאלית פעילויות אנזים תאיות

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

מכתים שלילי אופטימלי: פרוטוקול תפוקה גבוהה לבחינת מבנה חלבון קטן וסימטרי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Physical, Chemical and Biological Characterization of Six Biochars Produced for the Remediation of Contaminated Sites

פיזי, כימי וביולוגי אפיון Biochars שש הופק עבור התיקון של אתרים מזוהמים

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

הקרנת תפוקה גבוהה של וריאציות סרבנות בlignocellulosic יומסה: סה&quot;כ ליגנין, מונומרים ליגנין, ואנזימתי שחרור סוכר

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

תפוקה גבוהה, פרוטוקול Microscale על ניתוח של עיבוד פרמטרים ועל איכויות תזונתיות ב תירס (זיה מייז ל')

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

תלת-ממדי (3D)-להדפיס תבנית עבור תפוקה גבוהה דג זברה העובר סידור במערך

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

תפוקה גבוהה Siderophore הקרנה מדגימות סביבתי: צמח רקמות תפזורת קרקעות, Rhizosphere קרקעות

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

השימוש באלמרנים לחקר התופעות הטראנס-והרב של מזדורי הרעילות

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

שיטות מתוקננת למדידת אינדוקציה של תגובת הלם חום באלבורבדיוטיס

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...