Name: a high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by automated phenotypic profiling of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-14T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Gli autori ringraziano CGC per gentilmente inviare il c. elegans. Questo lavoro è stato supportato da nazionali chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina Grant (#31401025, #81273108, #81641184), capitale salute ricerca e sviluppo di un progetto speciale a Pechino (#2011-1013-03), il fondo di apertura del laboratorio di tossicologia ambientale (# chiave Beijing 2015HJDL03) e la Fondazione di scienze naturali della provincia di Shandong, Cina (ZR2017BF041).

Il protocollo segue le indicazioni di cura degli animali del Comitato di etica animale del centro di Pechino per la prevenzione e il controllo in Cina.
1. preparazione chimica
<ol><li>Ottenere prodotti chimici (tabella 1 e Tabella materiali).</li>
	<li>Determinare il dosaggio più alto e più basso dei singoli prodotti chimici per una concentrazione minima di 100% letalità (LC100, 24 h) e una concentrazione massima del 100% nonlethality (LC0, 24 h) alle vit...

<ol>
	<li>Anderson, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+behavioral+toxicity+with+Caenorhabditis+elegans.">Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+assessing+chemical+toxicity+using+a+Caenorhabditis+elegans+reproduction+assay.">A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).</li><li>Boyd, W. A., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+sensitivity+of+three+nematode+species+to+copper+and+their+utility+in+aquatic+and+soil+toxicity+tests.">Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).</li><li>Dengg, M., van Meel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+model+system+for+rapid+toxicity+assessment+of+pharmaceutical+compounds.">Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).</li><li>Schouest, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+assessment+of+chemicals+using+Caenorhabditis+elegans+and+optical+oxygen+respirometry.">Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).</li><li>Sprando, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+rank+order+water+soluble+compounds+according+to+their+toxicity+using+Caenorhabditis+elegans,+a+Complex+Object+Parametric+Analyzer+and+Sorter,+and+axenic+liquid+media.">A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media.</a> Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).</li><li>Wang, D., Xing, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+locomotion+behavioral+defects+induced+by+acute+toxicity+from+heavy+metal+exposure+in+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology.</a> Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+chemical+acute+toxicity+between+the+nematode+and+the+rodent.">Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent.</a> Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+genetic+mutations+and+chemical+exposures+on+Caenorhabditis+elegans+feeding:+evaluation+of+a+novel,+high-throughput+screening+assay.">Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay.</a> PLoS One. 2 (12), 1259 (2007).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+and+prediction+of+toxicity+of+chemicals+using+an+automated+phenotypic+profiling+of+Caenorhabditis+elegans.">Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18 (2018).</li><li>Moyson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+effects+of+copper,+cadmium,+and+zinc+on+mortality+and+behavior+of+Caenorhabditis+elegans.">Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+DMSO+is+dependent+on+sir-2.1+and+daf-16.">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Effect+of+the+ToxCast+Phase+I+and+Phase+II+Chemicals+in+Caenorhabditis+elegans+and+Corresponding+Responses+in+Zebrafish,+Rats,+and+Rabbits.">Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits.</a> Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).</li></ol>

I vantaggi di c. elegans hanno portato al suo utilizzo crescente in tossicologia9, sia per studi meccanicistici e approcci di screening ad alta resa. Un ruolo maggiore per c. elegans nell'integrare altri sistemi di modello nella ricerca tossicologica è stato notevole negli ultimi anni, soprattutto per la valutazione della tossicità rapida di nuove sostanze chimiche. Questo articolo fornisce una nuova analisi di screening ad alta resa, quantitativa del worm fenotipi in una piast...

Con il rapido sviluppo di composti chimici applicato alla produzione industriale e la vita quotidiana delle persone, è importante studiare la tossicità test di modelli per le sostanze chimiche. In molti casi, il modello animale roditore è impiegato per valutare la potenziale tossicità di diverse sostanze chimiche sulla salute. In generale, la determinazione delle concentrazioni letali (cioè, la dosati 50% dose letale [LD50] di diverse sostanze chimiche) è utilizzata come parametro tradizionale in un modello di roditore (ratto/topo) in vivo, che è molto costoso e richiede tempo. Inoltre, a causa della riduzione, affinare, o sostituire il principio di (3R) che è centrale per etica e sul benessere degli animali, nuovi metodi che consentono per la sostituzione degli animali superiori sono preziose per la ricerca scientifica1,2,3 . C. elegans è un nematode dissipato che è stato isolato dal suolo. È stato ampiamente utilizzato come un organismo di ricerca in laboratorio per le sue caratteristiche benefiche, come una vita relativamente breve, facile coltivazione e riproduzione efficiente. Inoltre, molte vie biologiche fondamentali, tra cui processi fisiologici di base e le risposte di sforzo in c. elegans, sono conservate nei più alti mammiferi4,5,6,7 , 8. in un paio di confronti noi ed altri abbiamo fatto, c'è una buona concordanza tra tossicità di c. elegans e tossicità osservati in roditori9. Tutto ciò fa di c. elegans un buon modello per testare gli effetti di tossicità chimica in vivo.
Recentemente, alcuni studi quantificato le caratteristiche fenotipiche di c. elegans. Le caratteristiche possono essere utilizzate per analizzare la tossicità dei prodotti chimici2,3,10 e l'invecchiamento dei vermi11. Abbiamo anche sviluppato un metodo che combina un verme liquido coltura sistema e un sistema di analisi di immagine, in cui i vermi sono coltivati in una piastra 384 pozzetti in diversi trattamenti chimici12. Questa tecnica quantitativa è stata sviluppata per analizzare automaticamente i 33 parametri di c. elegans dopo 12-24h di trattamento chimico in una piastra 384 pozzetti con mezzo liquido. Una fase di microscopio automatizzato viene utilizzata per l'acquisizione dei video sperimentali. I video vengono elaborati da un programma di misura, e sono quantificati 33 caratteristiche relazionati al comportamento commovente ai vermi. Il metodo viene utilizzato per quantificare i fenotipi di vite senza fine nell'ambito del trattamento di 10 composti. I risultati mostrano che le diverse tossicità possono alterare i fenotipi di c. elegans. Questi fenotipi quantificati possono essere utilizzati per identificare e prevedere la tossicità acuta di diversi composti chimici. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di facilitare l'osservazione e la quantificazione fenotipica degli esperimenti con c. elegans in una coltura liquida. Questo metodo è utile per l'applicazione di c. elegans in valutazioni di tossicità chimica e quantificazioni di fenotipo, che aiutano a prevedere la tossicità acuta di diversi composti chimici e stabilire una lista di priorità per ulteriori tradizionale test di valutazione di tossicità chimica in un modello del roditore. Inoltre, questo metodo può essere applicato alla tossicità di screening e test di nuove sostanze chimiche o il composto come l'inquinamento agente additivo alimentare, composti farmaceutici, composti esogeni ambientali e così via.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">59300</td>
			<td style="width:407px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384-well plates</td>
			<td style="width:171px;">Throme</td>
			<td style="width:175px;">142761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Bacto</td>
			<td style="width:175px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Atropine sulfate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">PHL80892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Bleach buffer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">21074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CCD camera</td>
			<td style="width:171px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">AxioCam HRm</td>
			<td style="width:407px;">Zeiss microscopy GmbH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">24105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Glycerol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">K-Medium</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">LB Broth&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">10&#160;g/L&#160;Tryptone,&#160;5&#160;g/L&#160;Yeast&#160;Extract,&#160;5&#160;g/L&#160;NaCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:207px;">NGM Plate</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td>Bacto</td>
			<td style="width:175px;">211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">795496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">795488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">PPB buffer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">shaker</td>
			<td style="width:171px;">ZHICHENG</td>
			<td style="width:175px;">ZWY-200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">71382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium fluoride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">s7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">239305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">The link of program</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Zeiss automatic microscope&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">AXIO Observer.Z1</td>
			<td style="width:407px;">Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by automated phenotypic profiling of caenorhabditis elegans

L'applicazione di test di tossicità delle sostanze chimiche negli organismi superiori di ordine, come topi o ratti, è lungo e costoso, grazie alla loro lunga durata di vita e problemi di manutenzione. Al contrario, il nematode Caenorhabditis elegans (c. elegans) presenta vantaggi per renderlo la scelta ideale per i test di tossicità: una vita relativamente breve, facile coltivazione e riproduzione efficiente. Qui, descriviamo un protocollo per la profilazione fenotipica automatica di c. elegans in una piastra 384 pozzetti. I vermi del nematode sono coltivati in una piastra 384 pozzetti con trattamento medio e chimico liquidi e video è presi di ciascun pozzetto per quantificare l'influenza chimica su 33 caratteristiche di verme. Risultati sperimentali dimostrano che le caratteristiche di fenotipo quantificati possono classificare e prevedere la tossicità acuta di diversi composti chimici e stilare un elenco di priorità per ulteriori prove di valutazione di tossicità chimica tradizionale in un modello del roditore.

Abbiamo testato i fenotipi di vermi esposti a diverse concentrazioni di più di 10 prodotti chimici12. Nel test, 33 caratteristiche distinte sono state quantificate per ogni composto a tre intervalli di tempo (h 0, 12h e 24h) chimico. In precedenza, un confronto tra un manuale e un'analisi automatica di un test di durata della vita è stato fatto11,12. In questa analisi, abbiamo trovato che prodotti chimici...

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A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Un metodo quantitativo è stato sviluppato per identificare e prevedere la tossicità acuta dei prodotti chimici analizzando automaticamente l'analisi fenotipica dei Caenorhabditis elegans. Questo protocollo descrive come trattare vermi con prodotti chimici in una piastra 384 pozzetti, catturare video e quantificare tossicologici fenotipi correlati.

Un saggio di High-throughput per la previsione di tossicità chimica di Automated fenotipica profilatura di Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Il saggio tossicologico C.elegans è prezioso. Questo protocollo descrive come trattare i C.elegans con sostanze chimiche in una piastra da 384 po ', catturare video e quantificare fenotipi correlati alla tossicologia. Questo metodo potrebbe aiutare a identificare e prevedere la potenziale tossicità acuta di una sostanza chimica.Questa tecnica quantitativa è stata sviluppata per analizzare automaticamente i 33 parametri di C.elegans dopo 12-24 ore di trattamento chimico in una piastra da 384 po 'con mezzo liquido. C.elegans è prezioso come buon modello di valutazione rapida della tossicità per le nuove sostanze chimiche. Come topi, può essere applicato allo screening tossico e al test di nuove sostanze chimiche, o al composto come inquinamento da agenti additivi alimentari, composto farmaceutico, composto esogeno dell'ambiente e così via.Leggi attentamente il protocollo e segui sempre il con passo dopo passo, quindi sarai quello buono. La dimostrazione visiva è più semplice per l'utente vedere il funzionamento di ogni passaggio e il risultato dell'operazione. A dimostrare la procedura saranno Wenjing Zhang e Gaochao Han.Sono studenti laureati del mio laboratorio. Per iniziare, condurre un test preliminare di letalità del verme per una nuova sostanza chimica, per determinare il dosaggio più alto e il dosaggio più basso, che sono la concentrazione minima del 100% di letalità e la concentrazione massima del 100% di non letalità. Per questo esperimento, preparare sette concentrazioni di gradiente di cloruro di cadmio.Per preparare due volte la soluzione acquosa concentrata più alta, sciogliere 92,8 milligrammi di polvere solida di cloruro di cadmio in un tubo di centrifuga riempito con otto millilitri di mezzo K. Vortice da mescolare. Dopo che la polvere è stata completamente sciolta, utilizzare una pipetta per riempire fino a 10 millilitri.Preparare gli altri livelli di concentrazione per diluizione con mezzo K. In una panca super pulita, utilizzare una punta sterile per raccogliere una singola colonia di E.coli OP50 dalla piastra di striscia e posizionarla nel pallone con 100 millilitri di brodo LB per inoculare la colonia. Coltivalo durante la notte a 37 gradi Celsius nello shaker dell'incubatore.Versare NGM in una piastra di Petri di plastica da 90 millilitri. Seme ogni piastra con 300 microlitri di soluzione E.coli OP50. Incubare i vermi N2 sulle piastre NGM con OP50 a 20 gradi Celsius per circa 2-3 giorni, fino a quando la maggior parte dei vermi ha raggiunto lo stadio adulto.Con acqua sterile, lavare i vermi gravidi in un tubo di centrifuga conico sterile da 15 millilitri per raccogliere. Lascia che i vermi si sistemino per almeno 2 minuti. Aspirare l'acqua e aggiungere cinque millilitri di tampone di candeggina.Vortice il tubo per cinque minuti, quindi mettere il tubo in una centrifuga per girare a una forza centrifuga relativa di 1300 per 30 secondi per pellettare le uova. Utilizzare una pipetta per aspirare il supernatante. Aggiungere cinque millilitri di acqua sterilizzata nel tubo per lavare le uova e vortice il tubo per cinque secondi.Centrifugare il tubo per 30 secondi, con una forza centrifuga relativa di 1300. Rimuovere il supernatante e aggiungere cinque millilitri di acqua sterilizzata per lavare di nuovo. Pipettare le uova su un nuovo piatto NGM con OP50.Incubarli a 20 gradi Celsius durante la notte. La mattina dopo, i vermi nati raggiungono lo stadio L1. Dopo circa 40 ore, i vermi raggiungono lo stadio L4.Con K medium, lavare i vermi stadio L4 dalle piastre di Petri in un tubo conico sterile da 50 millilitri. Pipetta 50 microlitri del liquido del verme dal tubo a uno scivolo di vetro. Al microscopio stereo, utilizzare una pipetta per regolare la concentrazione di vermi su circa 40 animali per 100 microlitri di mezzo K.Aggiungere 50 microlitri del mezzo preparato in ogni pozzo della piastra da 384 pozza. Questi vermi sincronizzati a stadio L4 sono pronti per il trattamento da parte di sostanze chimiche. Prima di aggiungere le sostanze chimiche, posizionare la piastra a 384 pozzi, con i vermi sincronizzati sul palco automatico, e impostare la videocamera con la procedura di acquisizione programmata.Nella piastra da 384 pozzi, i vermi vengono trattati con da sei a sette dosaggi di ogni singola sostanza chimica, con otto pozzi paralleli contenenti 50 microlitri della soluzione due volte chimica per ogni dosaggio. Preparare almeno tre gruppi di otto pozzi paralleli di mezzo K come controllo. Aggiungere 50 microlitri della soluzione due volte chimica per ogni pozzo.Impostare l'ora come punto dell'ora zero. Quindi, metti la piastra da 384 po 'nello shaker dell'incubatore impostata a 20 gradi Celsius e 80 giri al minuto. Dopo un tempo desiderato, rimuovere la piastra dall'incubatore e trasferirla allo stadio automatico.Scatta video di ogni pozzo del piatto, a 12 ore e a 24 ore per controllare i fenotipi dei vermi. Per iniziare a elaborare il video sperimentale, trasferire i file video sul computer. Tramite l'interfaccia utente grafica, fare clic sul pulsante Seleziona, per scegliere la directory delle immagini di origine.Aggiungere la directory dei risultati centrale. I risultati intermedi includono le immagini segmentate, che sono utili per l'osservazione visiva delle immagini elaborate. Aggiungere la directory dei risultati finali nell'interfaccia.Impostare il parametro di dimensione media del worm su 2.000 nella casella di testo Dimensioni worm nell'interfaccia. Impostare la soglia del rapporto spostato su 0,93 nell'interfaccia. Fare clic sul pulsante Analizza per avviare l'elaborazione dell'immagine.Il programma sviluppato può riconoscere i worm e quantificare automaticamente i fenotipi. In questo esperimento, 33 caratteristiche distinte sono state quantificate per il trattamento con cloruro di cadmio in tre punti di tempo, zero ore, 12 ore e 24 ore. Immagini sperimentali mostrano che i vermi sono morti più rapidamente con l'aumentare della concentrazione chimica.All'inizio, non c'era alcuna differenza significativa tra il controllo e i trattamenti chimici. Dopo 12 ore di trattamento, i vermi trattati con un'alta concentrazione sono diventati più dritti e meno curvi rispetto a concentrazioni più basse o in gruppi di controllo. La maggiore lunghezza dell'asse della regione coperta dal corpo del verme è aumentata con l'aumentare del tempo.C'è anche una tendenza al gradiente da concentrazioni chimiche più basse a concentrazioni più elevate sia nell'asse principale che nella lunghezza dell'asse minore. La motilità dei vermi, basata sull'area e sul rapporto, mostrava schemi simili. All'inizio non è stata osservata alcuna differenza significativa.Con il passare del tempo, i vermi nel gruppo di controllo mostravano una diminuzione stabile della motilità. Dopo 12 e 24 ore, i vermi trattati con cloruro di cadmio hanno mostrato differenze significative nella motilità, rispetto ai gruppi di controllo. Inoltre, i vermi sotto trattamenti a concentrazione più elevata hanno mostrato una motilità più debole, rispetto ai vermi sotto trattamenti a bassa concentrazione.In sintesi, questa tecnica apre una via di rapida valutazione della tossicità in più aree. Ricercatori che potrebbero applicare il metodo all'analisi di emergenza della tossicità nella tossicosi di origine alimentare, alla valutazione della sicurezza dei composti farmaceutici, nonché allo screening della tossicità acuta e all'individuazione di nuove sostanze chimiche e ai composti esogeni ambientali. Il cloruro di cadmio è una sostanza a bassa tossicità.Si prega di indossare guanti e una maschera durante la manipolazione e seguire le istruzioni per l'uso.

Research

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