Name: a high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by automated phenotypic profiling of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-14T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Os autores agradecer CGC gentilmente enviar o c. elegans. Este trabalho foi apoiado pela nacional chave de pesquisa e desenvolvimento programa de China (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); Fundação Nacional de ciências naturais da China Grant (#31401025, #81273108, #81641184), a Capital de saúde pesquisa e desenvolvimento de projeto especial em Pequim (#2011-1013-03), o fundo da abertura do Beijing chave laboratório de toxicologia ambiental (# 2015HJDL03) e a Fundação de ciências naturais da província de Shandong, China (ZR2017BF041).

O protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais do Comitê de ética Animal, do centro de Pequim para prevenção de doenças e controle na China.
1. química preparação
<ol><li>Obter produtos químicos (tabela 1 e Tabela de materiais).</li>
	<li>Determine a maior e menor dosagem dos produtos químicos individuais para uma concentração mínima de letalidade de 100% (LC100, 24 h) e uma concentração máxima de 100% nonlethality (LC0, 24 h) para v...

<ol>
	<li>Anderson, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+behavioral+toxicity+with+Caenorhabditis+elegans.">Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+assessing+chemical+toxicity+using+a+Caenorhabditis+elegans+reproduction+assay.">A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).</li><li>Boyd, W. A., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+sensitivity+of+three+nematode+species+to+copper+and+their+utility+in+aquatic+and+soil+toxicity+tests.">Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).</li><li>Dengg, M., van Meel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+model+system+for+rapid+toxicity+assessment+of+pharmaceutical+compounds.">Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).</li><li>Schouest, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+assessment+of+chemicals+using+Caenorhabditis+elegans+and+optical+oxygen+respirometry.">Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).</li><li>Sprando, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+rank+order+water+soluble+compounds+according+to+their+toxicity+using+Caenorhabditis+elegans,+a+Complex+Object+Parametric+Analyzer+and+Sorter,+and+axenic+liquid+media.">A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media.</a> Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).</li><li>Wang, D., Xing, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+locomotion+behavioral+defects+induced+by+acute+toxicity+from+heavy+metal+exposure+in+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology.</a> Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+chemical+acute+toxicity+between+the+nematode+and+the+rodent.">Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent.</a> Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+genetic+mutations+and+chemical+exposures+on+Caenorhabditis+elegans+feeding:+evaluation+of+a+novel,+high-throughput+screening+assay.">Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay.</a> PLoS One. 2 (12), 1259 (2007).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+and+prediction+of+toxicity+of+chemicals+using+an+automated+phenotypic+profiling+of+Caenorhabditis+elegans.">Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18 (2018).</li><li>Moyson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+effects+of+copper,+cadmium,+and+zinc+on+mortality+and+behavior+of+Caenorhabditis+elegans.">Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+DMSO+is+dependent+on+sir-2.1+and+daf-16.">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Effect+of+the+ToxCast+Phase+I+and+Phase+II+Chemicals+in+Caenorhabditis+elegans+and+Corresponding+Responses+in+Zebrafish,+Rats,+and+Rabbits.">Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits.</a> Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).</li></ol>

As vantagens de c. elegans levaram-se a sua crescente utilização em toxicologia9, tanto para estudos mecanicistas e abordagens de seleção da elevado-produção. Um papel acrescido para c. elegans em complementando outros sistemas modelo na pesquisa toxicológica tem sido notável nos últimos anos, especialmente para a avaliação da toxicidade rápida de novas substâncias químicas. Este artigo fornece um novo ensaio de triagem elevado-throughput, quantitativo de worm fenó...

Juntamente com o rápido desenvolvimento de compostos químicos aplicados à produção industrial e o cotidiano das pessoas, é importante estudar a toxicidade testando modelos para os produtos químicos. Em muitos casos, o modelo animal roedor é empregado para avaliar a toxicidade potencial de diferentes substâncias químicas na saúde. Em geral, a determinação da concentração letal (i.e., a analisado 50% dose letal [LD50] de produtos químicos diferentes) é usada como o parâmetro tradicional em um modelo de roedores (rato/mouse) in vivo que é muito caro e demorado. Além disso, devido a reduzir, refinar, ou substituir o princípio (3R) que é central à ética e ao bem-estar dos animal, novos métodos que permitem a substituição de animais superiores são valiosos para a pesquisa científica1,2,3 . C. elegans é um nemátodo de vida livre que foi isolado do solo. Ele foi amplamente utilizado como um organismo de investigação no laboratório por causa de suas características benéficas, tais como um tempo de vida curto, fácil cultivo e reprodução eficiente. Além disso, muitos caminhos biológicos fundamentais, incluindo os processos fisiológicos básicos e respostas de estresse em c. elegans, são conservados no maior mamíferos4,5,6,7 , 8. em algumas comparações que nós e os outros fizeram, há uma boa concordância entre a toxicidade de c. elegans e a toxicidade observada em roedores9. Tudo isso faz c. elegans , um bom modelo para testar os efeitos da toxicidade química in vivo.
Recentemente, alguns estudos quantificar as características fenotípicas de c. elegans. Os recursos podem ser usados para analisar a toxicidade dos produtos químicos,2,3,10 e o envelhecimento dos vermes11. Também desenvolvemos um método que combina um verme líquido cultivo sistema e um sistema de análise de imagem, na qual os vermes são cultivados em uma placa de 384 sob diferentes tratamentos químicos12. Esta técnica quantitativa foi desenvolvida para analisar automaticamente os 33 parâmetros de c. elegans após 12-24h de tratamento químico em uma placa com meio líquido de 384. Numa fase de microscópio automatizado é usada para aquisição de vídeo experimental. Os vídeos são processados por um programa de design personalizado, e 33 características relacionadas ao comportamento em movimento dos vermes são quantificadas. O método é usado para quantificar os fenótipos de worm sob o tratamento de 10 compostos. Os resultados mostram que a toxicidades diferentes podem alterar os fenótipos de c. elegans. Estes fenótipos quantificados podem ser usados para identificar e prever a toxicidade aguda de diferentes compostos químicos. O objectivo geral deste método é para facilitar a observação e quantificação fenotípica de experimentos com c. elegans em uma cultura líquida. Este método é útil para a aplicação do c. elegans em avaliações de toxicidade química e quantificações de fenótipo, que ajudam a prever a toxicidade aguda de diferentes compostos químicos e estabelecer uma lista de prioridade para mais tradicional testes de avaliação da toxicidade química em um modelo de roedor. Além disso, esse método pode ser aplicado à toxicidade de triagem e testes de novos produtos químicos ou o composto, como a poluição de agente aditivo de alimento pharmacautical compostos, compostos exógenos ambiental e assim por diante.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">59300</td>
			<td style="width:407px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384-well plates</td>
			<td style="width:171px;">Throme</td>
			<td style="width:175px;">142761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Bacto</td>
			<td style="width:175px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Atropine sulfate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">PHL80892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Bleach buffer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">21074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CCD camera</td>
			<td style="width:171px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">AxioCam HRm</td>
			<td style="width:407px;">Zeiss microscopy GmbH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">24105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Glycerol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">K-Medium</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">LB Broth&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">10&#160;g/L&#160;Tryptone,&#160;5&#160;g/L&#160;Yeast&#160;Extract,&#160;5&#160;g/L&#160;NaCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:207px;">NGM Plate</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td>Bacto</td>
			<td style="width:175px;">211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">795496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">795488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">PPB buffer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">shaker</td>
			<td style="width:171px;">ZHICHENG</td>
			<td style="width:175px;">ZWY-200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">71382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium fluoride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">s7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">239305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">The link of program</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Zeiss automatic microscope&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">AXIO Observer.Z1</td>
			<td style="width:407px;">Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by automated phenotypic profiling of caenorhabditis elegans

Aplicação de testes de toxicidade de produtos químicos em organismos superiores de ordem, tais como ratos ou ratos, é demorado e caro, devido a sua longa vida útil e problemas de manutenção. Pelo contrário, o nematódeo Caenorhabditis elegans (c. elegans) tem vantagens para torná-lo uma escolha ideal para o teste de toxicidade: uma vida curta, fácil cultivo e reprodução eficiente. Aqui, descrevemos um protocolo para a perfilação fenotípica automática de c. elegans em uma placa de 384. Os vermes nematoides são cultivados em uma placa de 384 com tratamento líquido médio e química, e vídeos são tomados de cada poço para quantificar a influência química em 33 características de worm. Resultados experimentais demonstram que as características do fenótipo quantificados podem classificar e prever a toxicidade aguda por compostos químicos e estabelecer uma lista de prioridade para mais testes de avaliação de toxicidade química tradicional em um modelo de roedor.

Nós testamos os fenótipos de vermes expostos a diferentes concentrações de mais de 10 produtos químicos12. No teste, 33 características distintas foram quantificadas para cada produto químico composto em três pontos de tempo (0 h, 12 h e 24 h). Uma comparação entre um manual e uma análise automática de um ensaio de vida útil foi feita previamente,11,12. Neste ensaio, encontramos que os produtos...

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A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Um método quantitativo foi desenvolvido para identificar e prever a toxicidade aguda de substâncias químicas, analisando automaticamente a caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans. Este protocolo descreve como tratar vermes com produtos químicos em uma placa de 384, capturar vídeos e quantificar toxicológicos fenótipos relacionados.

Um ensaio de alta produtividade para a predição da toxicidade química por Automated Caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

O ensaio toxicológico de C.elegans é valioso. Este protocolo descreve como tratar C.elegans com produtos químicos em uma placa de 384 poços, capturar vídeos e quantificar fenótipos tóxicos relacionados. Este método poderia ajudar a identificar e prever a potencial toxicidade aguda de um produto químico.Esta técnica quantitativa foi desenvolvida para analisar automaticamente os 33 parâmetros de C.elegans após 12 a 24 horas de tratamento químico em uma placa de 384 poços com meio líquido. C.elegans é valioso como um bom modelo de avaliação rápida de toxicidade para novos produtos químicos. Como camundongos, pode ser aplicado à toxicidade de triagem e testes de novos produtos químicos, ou ao composto como a poluição do agente aditivo alimentar, composto farmacêutico, composto exógeno ambiental, e assim por diante.Leia o protocolo com atenção e siga sempre o passo a passo, então você será o bom. A demonstração visual é mais fácil para o usuário ver o funcionamento de cada etapa e o resultado da operação. Demonstrando o procedimento estarão Wenjing Zhang e Gaochao Han.São estudantes de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, realize um teste preliminar de letalidade de vermes para um novo produto químico, para determinar a maior dosagem, e a menor dosagem, que são a concentração mínima de 100% de letalidade, e a concentração máxima de 100% não letalidade. Para este experimento, prepare sete concentrações gradientes de cloreto de cádmio.Para preparar duas vezes a solução aquosa mais concentrada, dissolva 92,8 miligramas de pó sólido de cloreto de cádmio em um tubo de centrífuga cheio com oito mililitros de meio K. Vórtice para misturar. Depois que o pó estiver totalmente dissolvido, use uma pipeta para encher até 10 mililitros.Prepare os outros níveis de concentração por diluição com o meio K. Em um banco super limpo, use uma ponta estéril para escolher uma única colônia de E.coli OP50 da placa de raia, e colocá-lo no frasco com 100 mililitros de caldo LB para inocular a colônia. Cresça durante a noite a 37 graus Celsius no shaker da incubadora.Despeje NGM em uma placa de Petri de plástico de 90 mililitros. Semente cada placa com 300 microliters de solução E.coli OP50. Incubar vermes N2 nas placas de NGM com OP50 a 20 graus Celsius por cerca de 2 a 3 dias, até que a maioria dos vermes tenha chegado ao estágio adulto.Com água estéril, lave vermes gravid em um tubo de centrífuga cônica estéril de 15 mililitros para colher. Deixe os vermes se acalmarem por pelo menos 2 minutos. Aspire a água e adicione cinco mililitros de tampão de alvejante.Vórtice do tubo por cinco minutos, e depois coloque o tubo em uma centrífuga para girar em uma força centrífuga relativa de 1300 por 30 segundos para pelotar os ovos. Use uma pipeta para aspirar o supernaspe. Adicione cinco mililitros de água esterilizada no tubo para lavar os ovos, e vórtice do tubo por cinco segundos.Centrifugar o tubo por 30 segundos, a uma força centrífuga relativa de 1300. Remova o sobrenatário e adicione cinco mililitros de água esterilizada para lavar novamente. Pipeta os ovos em uma nova placa NGM com OP50.Incubar-os a 20 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, os vermes eclodidos chegam ao estágio L1. Após aproximadamente 40 horas, os vermes chegam ao estágio L4.Com o meio K, lave os vermes do estágio L4 das placas de Petri em um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Pipeta 50 microliters do líquido worm do tubo para um deslizamento de vidro. Sob um microscópio estéreo, use uma pipeta para ajustar a concentração de vermes para aproximadamente 40 animais por 100 microlitros de meio K.Adicione 50 microliters do meio preparado em cada poço da placa de 384 poços. Estes vermes sincronizados do estágio L4 estão prontos para seguir o tratamento por produtos químicos. Antes de adicionar os produtos químicos, coloque a placa de 384 poços, com os worms sincronizados no palco automático, e configure a câmera de vídeo com o procedimento de aquisição programado.Na placa de 384 poços, os vermes são tratados com seis a sete doses de cada produto químico individual, com oito poços paralelos contendo 50 microlitadores da solução química de duas vezes para cada dosagem. Prepare pelo menos três grupos de oito poços paralelos de meio K como controle. Adicione 50 microliters da solução química duas vezes para cada poço.Defina a hora como o ponto zero-hora. Em seguida, coloque a placa de 384 poços no shaker da incubadora a 20 graus Celsius, e 80 revoluções por minuto. Após o tempo desejado, retire a placa da incubadora e transfira-a para o estágio automático.Faça vídeos de cada poço da placa, às 12 horas, e às 24 horas para verificar os fenótipos dos vermes. Para começar a processar o vídeo experimental, transfira os arquivos de vídeo para o computador. Através da interface gráfica do usuário, clique no botão Selecionar, para escolher o diretório de imagens de origem.Adicione o diretório de resultados do meio. Os resultados do meio incluem as imagens segmentadas, que são úteis para a observação visual das imagens processadas. Adicione o diretório de resultados finais na interface.Defina o parâmetro médio de tamanho do worm em 2.000, na caixa de texto Worm Size na interface. Defina o limiar da relação de movimento em 0,93 na interface. Clique no botão Analisar para iniciar o processamento da imagem.O programa desenvolvido pode reconhecer vermes e quantificar fenótipos automaticamente. Neste experimento, 33 características distintas foram quantificadas para tratamento de cloreto de cádmio em três pontos de tempo, zero hora, 12 horas e 24 horas. Imagens experimentais mostram que os vermes morreram mais rapidamente à medida que a concentração química aumentava.No início, não houve diferença significativa entre o controle e os tratamentos químicos. Após 12 horas de tratamento, os vermes tratados com alta concentração tornaram-se mais retos e menos curvados do que em concentrações mais baixas ou em grupos de controle. O maior comprimento do eixo da região coberta pelo corpo de vermes aumentou à medida que o tempo aumentava.Há também uma tendência gradiente de concentrações químicas mais baixas para mais altas tanto no eixo principal quanto no comprimento do eixo menor. A motilidade dos vermes, baseada na área e na razão, mostrou padrões semelhantes. Não foi observada diferença significativa no início.Com o passar do tempo, os vermes do grupo controle apresentaram uma diminuição estável da motilidade. Após 12 e 24 horas, os vermes tratados com cloreto de cádmio apresentaram diferenças significativas na motilidade, em comparação com os grupos de controle. Além disso, os vermes sob tratamentos de maior concentração mostraram uma motilidade mais fraca, em comparação com os vermes sob tratamentos de menor concentração.Em resumo, essa técnica abre uma forma de rápida avaliação da toxicidade em múltiplas áreas. Pesquisadores que poderiam aplicar o método à análise emergencial da toxicidade na toxicose transmitida por alimentos, a avaliação de segurança de compostos farmacêuticos, bem como o rastreamento de toxicidade aguda, e a detecção de novos produtos químicos, e os compostos exógenos ambientais. O cloreto de cádmio é uma substância tóxica baixa.Por favor, use luvas e uma máscara durante o manuseio, e siga as instruções de operação.

Research

JoVE Journal

Environment

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Determinação da Microbial Extracelular Enzyme actividade nas águas, solos e sedimentos, utilizando alta taxa de transferência de microplaca Ensaios

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Ambiente

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

De alta capacidade Fluorometric Medição do Potencial dos Solos extracelulares atividades enzimáticas

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimizado coloração negativa: um protocolo de alta capacidade para Examinando pequeno e assimétrico Estrutura de proteínas por microscopia eletrônica

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Physical, Chemical and Biological Characterization of Six Biochars Produced for the Remediation of Contaminated Sites

Física, química e biológica dos Seis biochars produzido para a remediação de áreas contaminadas

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Rastreio de alto rendimento de Variações recalcitrância da biomassa lignocelulósica em: Total lignina, a lignina monómeros, e enzimática Sugar lançamento

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Elevado-throughput, microescala protocolo para a análise de parâmetros de processamento e qualidades nutricionais em milho (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Um 3-dimensional (3D)-impresso modelo alto Throughput Zebrafish embrião põr

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Sideróforo elevado-throughput Screening de amostras ambientais: tecidos, Bulk solos e solos de rizosfera de plantas

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Usando Caenorhabditis elegans para estudar trans-e multi-Generational efeitos de toxicants

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Métodos padronizados para medir a indução da resposta de choque térmico em elegans caenorhabditis

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...