Name: a high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by automated phenotypic profiling of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-14T14:45:00
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Los autores agradecen la CGC amablemente envío de C. elegans. Este trabajo fue apoyado por nacional clave de investigación y programa de desarrollo de China (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705) Fundación Nacional de Ciencias naturales de China Grant (#31401025, #81273108, #81641184), el Capital salud investigación y desarrollo de proyectos especiales en Pekín (#2011-1013-03), el fondo de la abertura del Beijing clave laboratorio de Toxicología Ambiental (# 2015HJDL03) y la Fundación de Ciencias naturales de la provincia de Shandong, China (ZR2017BF041).

El protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales del Comité de ética Animal del centro de Beijing para la prevención de enfermedades y el Control en China.
1. química preparación
<ol><li>Obtener productos químicos (tabla 1 y Tabla de materiales).</li>
	<li>Determinar la dosis más alta y más baja de los productos químicos individuales para una concentración mínima del 100% de mortalidad (LC100, 24 h) y una concentración máxima de 100% non...

<ol>
	<li>Anderson, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+behavioral+toxicity+with+Caenorhabditis+elegans.">Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+assessing+chemical+toxicity+using+a+Caenorhabditis+elegans+reproduction+assay.">A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).</li><li>Boyd, W. A., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+sensitivity+of+three+nematode+species+to+copper+and+their+utility+in+aquatic+and+soil+toxicity+tests.">Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).</li><li>Dengg, M., van Meel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+model+system+for+rapid+toxicity+assessment+of+pharmaceutical+compounds.">Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).</li><li>Schouest, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+assessment+of+chemicals+using+Caenorhabditis+elegans+and+optical+oxygen+respirometry.">Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).</li><li>Sprando, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+rank+order+water+soluble+compounds+according+to+their+toxicity+using+Caenorhabditis+elegans,+a+Complex+Object+Parametric+Analyzer+and+Sorter,+and+axenic+liquid+media.">A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media.</a> Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).</li><li>Wang, D., Xing, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+locomotion+behavioral+defects+induced+by+acute+toxicity+from+heavy+metal+exposure+in+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology.</a> Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+chemical+acute+toxicity+between+the+nematode+and+the+rodent.">Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent.</a> Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+genetic+mutations+and+chemical+exposures+on+Caenorhabditis+elegans+feeding:+evaluation+of+a+novel,+high-throughput+screening+assay.">Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay.</a> PLoS One. 2 (12), 1259 (2007).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+and+prediction+of+toxicity+of+chemicals+using+an+automated+phenotypic+profiling+of+Caenorhabditis+elegans.">Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18 (2018).</li><li>Moyson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+effects+of+copper,+cadmium,+and+zinc+on+mortality+and+behavior+of+Caenorhabditis+elegans.">Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+DMSO+is+dependent+on+sir-2.1+and+daf-16.">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).</li><li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Effect+of+the+ToxCast+Phase+I+and+Phase+II+Chemicals+in+Caenorhabditis+elegans+and+Corresponding+Responses+in+Zebrafish,+Rats,+and+Rabbits.">Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits.</a> Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).</li></ol>

Las ventajas de la C. elegans han conducido a su creciente uso en toxicología9, para el estudio de mecanismos y métodos de cribado de alto rendimiento. Un papel creciente para C. elegans en complementar otros sistemas modelo en la investigación toxicológica ha sido notable en los últimos años, especialmente para la evaluación rápida de la toxicidad de nuevos productos químicos. Este artículo proporciona un nuevo ensayo de cribado de alto rendimiento, cuantitativa del gu...

Junto con el rápido desarrollo de compuestos químicos aplicados a la producción industrial y la vida cotidiana de las personas, es importante estudiar la toxicidad pruebas modelos de los productos químicos. En muchos casos, el modelo animal de roedor se emplea para evaluar la potencial toxicidad de diferentes productos químicos sobre la salud. En general, la determinación de concentraciones letales (es decir, el ensayo 50% dosis letal [DL50] de diferentes productos químicos) se utiliza como parámetro tradicional en un modelo de roedor (rata/ratón) en vivo, que es muy costoso y desperdiciador de tiempo. Además, debido a reducir, afinar, o sustituir (3R) principio fundamental con la ética y el bienestar de los animales, nuevos métodos que permiten la sustitución de los animales superiores son valiosos para la investigación científica1,2,3 . C. elegans es un nematodo de vida libre que se ha aislado del suelo. Ha sido ampliamente utilizado como un organismo de investigación en el laboratorio debido a sus características beneficiosas, tales como una vida útil corta, fácil cultivo y reproducción eficiente. Además, muchos caminos biológicos fundamentales, incluyendo los procesos fisiológicos básicos y las respuestas de estrés en C. elegans, se conservan en el más alto mamíferos4,5,6,7 , 8. en un par de comparaciones entre nosotros y otros hemos hecho, hay una buena concordancia entre la toxicidad de C. elegans y toxicidad en roedores9. Todo esto hace que C. elegans un buen modelo para probar los efectos de toxicidad química en vivo.
Recientemente, algunos estudios cuantifican las características fenotípicas de C. elegans. Las características se pueden utilizar para analizar la toxicidad de productos químicos2,3,10 y la crianza de gusanos11. También se desarrolló un método que combina un líquido gusano cultivo sistema y un sistema de análisis de imagen, en la que los gusanos se cultivan en una placa de 384 pozos bajo diferentes tratamientos químicos12. Esta técnica cuantitativa ha sido desarrollada para analizar automáticamente los 33 parámetros de C. elegans después de 12-24h de tratamiento químico en una placa de 384 pozos con medio líquido. Una platina del microscopio automatizado se utiliza para la adquisición de video experimental. Los videos son procesados por un programa de diseño personalizado, y se cuantifican 33 características relacionadas con el comportamiento de movimiento de los gusanos. El método se utiliza para cuantificar los fenotipos gusano bajo el tratamiento de 10 compuestos. Los resultados muestran que la toxicidad diferente puede alterar los fenotipos de C. elegans. Estos fenotipos cuantificables pueden utilizarse para identificar y predecir la toxicidad aguda de compuestos químicos diferentes. El objetivo general de este método es facilitar la observación y cuantificación fenotípica de experimentos con C. elegans en un cultivo líquido. Este método es útil para el uso de C. elegans en evaluaciones de la toxicidad química y cuantificaciones de fenotipo, que ayudan a predecir la toxicidad aguda de compuestos químicos diferentes y establecer una lista de prioridad para el más tradicional pruebas de evaluación de la toxicidad química en un modelo roedor. Además, este método puede aplicarse a la toxicidad, evaluación y análisis de nuevos productos químicos o el compuesto como la contaminación del agente aditivo de alimentos, farmacéutico compuestos, compuestos exógenos ambientales y así sucesivamente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">59300</td>
			<td style="width:407px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384-well plates</td>
			<td style="width:171px;">Throme</td>
			<td style="width:175px;">142761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Bacto</td>
			<td style="width:175px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Atropine sulfate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">PHL80892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Bleach buffer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td>0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cadmium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">202908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">21074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CCD camera</td>
			<td style="width:171px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">AxioCam HRm</td>
			<td style="width:407px;">Zeiss microscopy GmbH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">451657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">24105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Glycerol</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">K-Medium</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">LB Broth&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">10&#160;g/L&#160;Tryptone,&#160;5&#160;g/L&#160;Yeast&#160;Extract,&#160;5&#160;g/L&#160;NaCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:207px;">NGM Plate</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td>Bacto</td>
			<td style="width:175px;">211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">795496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">795488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">PPB buffer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">shaker</td>
			<td style="width:171px;">ZHICHENG</td>
			<td style="width:175px;">ZWY-200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">71382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium fluoride</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">s7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">239305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">The link of program</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:407px;">https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">T7293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Zeiss automatic microscope&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;">AXIO Observer.Z1</td>
			<td style="width:407px;">Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by automated phenotypic profiling of caenorhabditis elegans

Aplicación de ensayos de toxicidad de químicos en los organismos superiores de la orden, tales como ratones o ratas, es lento y costoso, debido a su larga vida útil y problemas de mantenimiento. Por el contrario, el nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) tiene ventajas que lo hacen una opción ideal para las pruebas de toxicidad: una vida corta, fácil cultivo y reproducción eficiente. Aquí, describimos un protocolo para la automática perfiles fenotípicos de C. elegans en una placa de 384 pozos. Los gusanos nematodos son cultivados en una placa de 384 pozos con líquido medio tratamiento físico-químico, y videos se toman de cada pozo para cuantificar la influencia química de 33 características de gusano. Resultados experimentales demuestran que las características de fenotipo cuantificada pueden clasificar y predecir la toxicidad aguda de compuestos químicos diferentes y establecer una lista de prioridades para más pruebas de la evaluación de la toxicidad química tradicional en un modelo roedor.

Hemos probado los fenotipos de gusanos expuestos a diferentes concentraciones de más de 10 productos químicos12. En la prueba, se cuantificaron 33 características distintas para cada producto químico compuesto en tres puntos del tiempo (0 h, 12 h y 24 h). Anteriormente, una comparación entre un manual y un análisis automático de un ensayo de vida útil se realizó11,12. En este ensayo, se encontró q...

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A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Se ha desarrollado un método cuantitativo para identificar y predecir la toxicidad de productos químicos, analizando automáticamente los perfiles fenotípicos de Caenorhabditis elegans. Este protocolo describe cómo tratar gusanos con productos químicos en una placa de 384 pozos, capturar videos y cuantificar fenotipos relacionados toxicológicos.

Un análisis de alto rendimiento para la predicción de toxicidad química por perfiles fenotípicos automatizado de Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

El ensayo toxicológico de C.elegans es valioso. Este protocolo describe cómo tratar a C.elegans con productos químicos en una placa de 384 pozos, capturar videos y cuantificar fenotipos relacionados con toxicológicos. Este método podría ayudar a identificar y predecir la toxicidad aguda potencial de un producto químico.Esta técnica cuantitativa ha sido desarrollada para analizar automáticamente los 33 parámetros de C.elegans después de 12 a 24 horas de tratamiento químico en una placa de 384 pozos con medio líquido. C.elegans es valioso como un buen modelo de evaluación rápida de la toxicidad para nuevos productos químicos. Como ratones, se puede aplicar a la toxicidad detección y pruebas de nuevos productos químicos, o el compuesto como la contaminación del agente aditivo alimentario, compuesto farmacéutico, medio ambiente compuesto exógeno, y así sucesivamente.Lea el protocolo cuidadosamente y siempre siga el paso a paso, entonces usted será el bueno. La demostración visual es más fácil para el usuario ver el funcionamiento de cada paso y el resultado de la operación. Demostrando el procedimiento estarán Wenjing Zhang y Gaochao Han.Son estudiantes graduados de mi laboratorio. Para empezar, realizar una prueba preliminar de letalidad del gusano para un nuevo producto químico, para determinar la dosis más alta, y la dosis más baja, que son la concentración mínima de 100% letalidad, y la concentración máxima de 100%no letalidad. Para este experimento, prepare siete concentraciones de gradiente de cloruro de cadmio.Para preparar dos veces la solución acuosa concentrada más alta, disolver 92,8 miligramos de polvo sólido de cloruro de cadmio en un tubo centrífugo lleno de ocho mililitros de K medio. Vórtice para mezclar. Después de que el polvo se disuelva por completo, utilice una pipeta para llenar hasta 10 mililitros.Preparar los otros niveles de concentración por dilución con medio K. En un banco súper limpio, usa una punta estéril para elegir una sola colonia de E.coli OP50 de la placa de rayas, y colócalo en el matraz con 100 mililitros de caldo LB para inocular la colonia. Cultivarlo durante la noche a 37 grados centígrados en la coctelera incubadora.Vierta NGM en una placa Petri de plástico de 90 mililitros. Semilla cada placa con 300 microlitros de solución E.coli OP50. Incubar gusanos N2 en las placas NGM con OP50 a 20 grados Celsius durante unos 2 a 3 días, hasta que la mayoría de los gusanos hayan alcanzado la etapa adulta.Con agua estéril, lave los gusanos gravídicos en un tubo de centrífuga cónica estéril de 15 mililitros para cosechar. Deje que los gusanos se calmen durante al menos 2 minutos. Aspirar el agua y añadir cinco mililitros de tampón de lejía.Vórtice el tubo durante cinco minutos, y luego poner el tubo en una centrífuga para girar a una fuerza centrífuga relativa de 1300 durante 30 segundos para peletizar los huevos. Utilice una pipeta para aspirar el sobrenadante. Agregue cinco mililitros de agua esterilizada en el tubo para lavar los huevos, y vórtice el tubo durante cinco segundos.Centrifugar el tubo durante 30 segundos, a una fuerza centrífuga relativa de 1300. Retire el sobrenadante y agregue cinco mililitros de agua esterilizada para lavar de nuevo. Pipetear los huevos en una nueva placa NGM con OP50.Incubarlos a 20 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, los gusanos eclosionados llegan a la etapa L1. Después de aproximadamente 40 horas, los gusanos llegan a la etapa L4.Con el medio K, lave los gusanos de la etapa L4 de las placas Petri en un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Pipetear 50 microlitros del líquido de gusano desde el tubo hasta un portaobjetos de vidrio. Bajo un microscopio estéreo, utilice una pipeta para ajustar la concentración de gusanos a aproximadamente 40 animales por cada 100 microlitros de medio K.Agregue 50 microlitros del medio preparado en cada pozo de la placa de 384 pozos. Estos gusanos de etapa L4 sincronizados están listos para seguir el tratamiento por productos químicos. Antes de añadir los productos químicos, coloque la placa de 384 pozos, con los gusanos sincronizados en el escenario automático, y configure la cámara de vídeo con el procedimiento de adquisición programado.En la placa de 384 pozos, los gusanos se tratan con seis a siete dosis de cada producto químico individual, con ocho pozos paralelos que contienen 50 microlitros de la solución química de dos veces para cada dosis. Preparar al menos tres grupos de ocho pozos paralelos del medio K como control. Añadir 50 microlitros de la solución química dos veces para cada pozo.Establezca la hora como punto de hora cero. A continuación, coloque la placa de 384 pozos en la coctelera de incubadora en 20 grados centígrados y 80 revoluciones por minuto. Después del tiempo deseado, retire la placa de la incubadora y transfiétela a la etapa automática.Tome videos de cada pozo de la placa, a las 12 horas, y a las 24 horas para comprobar los fenotipos de los gusanos. Para empezar a procesar el vídeo experimental, transfiera los archivos de vídeo al ordenador. A través de la interfaz gráfica de usuario, haga clic en el botón Seleccionar para elegir el directorio de imágenes de origen.Agregue el directorio de resultados intermedios. Los resultados medios incluyen las imágenes segmentadas, que son útiles para la observación visual de las imágenes procesadas. Agregue el directorio de resultados final en la interfaz.Establezca el parámetro de tamaño de gusano promedio en 2.000, en el cuadro de texto Tamaño de gusano de la interfaz. Establezca el umbral de la relación movida en 0,93 en la interfaz. Haga clic en el botón Analizar para iniciar el procesamiento de imágenes.El programa desarrollado puede reconocer gusanos y cuantificar fenotipos automáticamente. En este experimento, se cuantificaron 33 características distintas para el tratamiento con cloruro de cadmio en tres puntos de tiempo, hora cero, 12 horas y 24 horas. Las imágenes experimentales muestran que los gusanos murieron más rápidamente a medida que aumentaba la concentración química.Al principio, no había diferencia significativa entre el control y los tratamientos químicos. Después de 12 horas de tratamiento, los gusanos tratados con una alta concentración se volvieron más rectos y menos curvados que en concentraciones más bajas o en grupos de control. La longitud del eje principal de la región cubierta del cuerpo del gusano aumentó a medida que aumentaba el tiempo.También hay una tendencia de gradiente de concentraciones químicas más bajas a más altas tanto en el eje principal como en la longitud del eje menor. La motilidad de los gusanos, basada en el área y la relación, mostró patrones similares. No se observó ninguna diferencia significativa al principio.Con el paso del tiempo, los gusanos del grupo de control mostraron una disminución estable de la motilidad. Después de 12 y 24 horas, los gusanos que fueron tratados con cloruro de cadmio mostraron diferencias significativas en la motilidad, en comparación con los grupos de control. Además, los gusanos bajo tratamientos de mayor concentración mostraron una motilidad más débil, en comparación con los gusanos bajo tratamientos de menor concentración.En resumen, esta técnica allana una forma de evaluación rápida de la toxicidad en múltiples áreas. Investigadores que podrían aplicar el método al análisis de emergencia de toxicidad en la toxicosis transmitida por los alimentos, la evaluación de la seguridad de los compuestos farmacéuticos, así como el cribado de toxicidad aguda, y la detección de nuevos productos químicos, y los compuestos exógenos ambientales. El cloruro de cadmio es una sustancia tóxica baja.Por favor, use guantes y una máscara durante su manejo, y siga las instrucciones de funcionamiento.

Research

JoVE Journal

Environment

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Investigación

Medio ambiente

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

De Alto Rendimiento Fluorometric Medición de Potencial del Suelo extracelulares enzimáticos Actividades

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimizado tinción negativa: un protocolo de alto rendimiento para el examen de Estructura Pequeña y asimétrica de proteínas por Microscopía Electrónica

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Physical, Chemical and Biological Characterization of Six Biochars Produced for the Remediation of Contaminated Sites

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Selección de alto rendimiento de las Variaciones obstinación en lignocelulósica Biomasa: Total lignina, lignina Monómeros y enzimática Azúcar de lanzamiento

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

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The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...