Name: assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord
Uploaded: 2019-02-26T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord at JoVE.com

يشكر المؤلفون الزملاء مرفق الحيوان في "كلية الطب"، جامعة روهر بوخوم، تقديم الرعاية لهم الدعم والحيوان.

كافة الإجراءات على الموضوعات الحيوان أقرتها لجان أخلاقيات الحيوان المؤسسية للدول الاتحادية في هامبورغ ونوردراين-فيستفالن، ألمانيا.  استخدام أدوات معقمة وقفازات واقية ومعاطف العقيم طوال الإجراءات الجراحية بأكملها.
1-في توصيل الرحم
<ol><li>تعد الفيروسات المرتبطة بالغدة من ?...

<ol>
	<li>Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+axo-dendritic+synapses+in+the+hippocampal+cortex:+electron+and+light+microscopic+studies+on+the+layer+of+mossy+fibers.">Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers.</a> Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).</li><li>Hamlyn, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+the+mossy+fibre+endings+in+the+hippocampus+of+the+rabbit.">The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit.</a> Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).</li><li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).</li><li>Rollenhagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+transmission+at+large+hippocampal+mossy+fiber+synapses.">Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses.</a> Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+basic+protein+cleaves+cell+adhesion+molecule+L1+and+promotes+neuritogenesis+and+cell+survival.">Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Basic+Protein+Cleaves+Cell+Adhesion+Molecule+L1+and+Improves+Regeneration+After+Injury.">Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury.</a> Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).</li><li>Kraus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fragment+of+Adhesion+Molecule+L1+Binds+to+Nuclear+Receptors+to+Regulate+Synaptic+Plasticity+and+Motor+Coordination.">A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination.</a> Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferenzph&#228;nomene+am+osmierten+Pr&#228;parat+f&#252;r+die+systematische+elektronenmikroskopische+Untersuchung.">Interferenzph&#228;nomene am osmierten Pr&#228;parat f&#252;r die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung.</a> Mikroskopie. 30, 139 (1974).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+phenomenon+on+somium+tetroxide-fixed+specimens+for+systematic+electron+microscopy.">Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy.</a> Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Methods+for+Characterization+of+Brain+Regions.">General Methods for Characterization of Brain Regions.</a> Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).</li><li>Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+neural+tissues+or+electron+microscopy+by+perfusion+with+solutions+of+osmium+tetroxide.">Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide.</a> Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).</li><li>Webster, H. F., Collins, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+osmium+tetroxide+and+glutaraldehyde+perfusion+fixation+for+the+electron+microscopic+study+on+the+normal+rat+peripheral+nervous+system.">Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).</li><li>Andres, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zur+Methodik+der+Perfusionsfixierung+des+Zentralnervensystems+von+S&#228;ugern.">Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von S&#228;ugern.</a> Mikroskopie. 21, 169 (1967).</li><li>Forssmann, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+par+perfusion+pour+la+microscopie+&#233;lectronique.+Essai.+De+g&#233;n&#233;ralisation.">Fixation par perfusion pour la microscopie &#233;lectronique. Essai. De g&#233;n&#233;ralisation.</a> Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).</li><li>Descarries, L., Schr&#246;der, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+du+tissue+nerveux+par+perfusion+&#224;+grand+debit.">Fixation du tissue nerveux par perfusion &#224; grand debit.</a> Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).</li><li>Langford, L. A., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+potassium+ferricyanide+in+neural+fixation.">The use of potassium ferricyanide in neural fixation.</a> Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calretinin-positive+L5a+pyramidal+neurons+in+the+development+of+the+paralemniscal+pathway+in+the+barrel+cortex.">Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex.</a> Molecular Brain. 7, 84 (2014).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilins+regulate+synaptic+plasticity+and+mitochondrial+calcium+homeostasis+in+the+hippocampal+mossy+fiber+pathway.">Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway.</a> Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li><li>Nishiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+and+regulated+gene+expression+in+murine+Purkinje+cells+by+in+utero+electroporation.">Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation.</a> European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).</li><li>Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORalpha+regulates+multiple+aspects+of+dendrite+development+in+cerebellar+purkinje+cells+in+vivo.">RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).</li></ol>

خطوة حاسمة لتوصيل في الرحم هو إجراء الحقن. يتطلب حقن دقيقة في البطينين الدماغ أو في مجال آخر ذي أهمية الخبرة والتدريب العملي على المهارات. أرق تلميح ميكروكابيلاري، قد يحدث الضرر الأنسجة أقل؛ ومع ذلك، وهذا على حساب زيادة ضغط الحقن. على النقيض من انهانسر في الرحم19،<sup class="xr...

يمكن اختراق لا فوتون عينة أنسجة سامسونج في درجة عمق إلكترون. وهذا سمات مزايا لا تقدر بثمن إلى تيم في التقاط الصور القرار نانومتر من الهياكل الدقيقة عند مقارنة بتقنيات الفحص المجهري الخفيفة. على سبيل المثال، يسمح تيم لتصور العضيات داخل الخلية مثل الميتوكوندريا والأجسام الصباغية، وأنواع مختلفة من حبيبات افرازية، ميكروتوبوليس، ميكروفيلامينتس، أهداب، زغيبات، والوصلات بين الخلايا (سطح الخلية التخصصات)، وبخاصة سينابسيس في الجهاز العصبي1،2،،من34. والهدف العام لهذه الدراسة المنهجية هو ultrastructural الاعتراف بالتغيرات في اللدونة العصبية أثناء التطوير على التدخل قبل الولادة عن طريق الجمع بين الدولة من أحدث تقنيات توصيل في الرحم وال. تم ترانسدوسيد البروتينات المرمزة فيروسي للفائدة في الرحم إلى أن الجهاز العصبي المركزي5،،من67، بما في ذلك الحبل الشوكي6. على سبيل المثال، توصيل في الرحم في تركيبة مع تيم قد استخدمت لدراسة تأثير جزيء التصاق الخلايا L1 على موتور التعلم اللدونة في الفئران تفتقر إلى المستوى 1، لا سيما فيما يتعلق بالتفاعل بين L1 والبروتينات مستقبلات النووية في7من الخلايا العصبية في الدماغ.
ويتطلب تحليل معلمات أعصاب معلومات دقيقة حول التعريب أصغر المناطق داخل الجهاز العصبي. ولذلك، فمن الملائم لوصف تفاصيل ultrastructural وميولهم الطوبوغرافية الدقيقة فيما يتعلق بالهياكل الأخرى. ويرد في هذه الدراسة، أسلوب تحضيرية محددة تهدف إلى تحقيق مفصل لمجالات المورفولوجية متميزة على أساس كل من الضوء والمجهر الإلكتروني. يجمع هذا النهج بين عدة تقنيات للتلاعب الأنسجة، بدءاً في الرحم وتوصيل الماوس المخ والحبل الشوكي، وتليها نضح التثبيت، تضمين العفن، وتجهيز الأنسجة لل. هو خطوة أساسية شملت بين التضمين وتجهيز الأنسجة لل الوثائق المتعلقة الأنسجة، واستخدام تقنية انعكاس الضوء التدخل الذي يسمح للوثائق ميكروفوتوجرافيك وتضخم منخفضة الدقة من الأنسجة العينات8،،من910. إدماج النهج الحالي، يتيح هذا الأسلوب الباحثين لدراسة التفاصيل الطوبوغرافية والهيكلية للسطوح النسيج العصبي والتشكيلات الجانبية لشريحة العينة قبل إعدادها لل.
إطار خاص لتقطيع العقول كله يناظر الإحداثيات ستيريوتاكسيك. فوائد تعمير المناطق في النسيج العصبي (3D) ثلاثي الأبعاد المورفولوجية هذا الإطار ويمكن أن تستخدم لتحليل شكلي. ماكروجرافس المقاطع تصور يتم تعيين الإحداثيات الطبوغرافية، وبناء الأقسام مرقمة تسلسلياً الخرائط في أطلس أنسجة.
بعد راتنج التجهيز، هو مقطوع الأنسجة المضمنة إلى أقسام سامسونج (< 70 نانومتر) التي تحتوي على مناطق مختارة، وفقا لخرائط الأطلس الأنسجة المذكورة أعلاه. المقاطع سامسونج يتعرضون لل للحصول على صور عالية الاستبانة للمعلمات اللدونة (مثلاً، عينة الشخصية المناطق boutons متشابك أو ألياف محواري) من محتوياتها واتصالاتها لهياكل المجاورة داخل المجمع نيوروبيل.
بالطريقة المبينة في هذا التقرير، يسمح الانتقال السلس من ماكروستروكتوريس تصور للمشاريع المتناهية الصغر والنانو دراسات متعمقة مقارنة اللدونة العصبية المورفولوجية بعد في الرحم توصيل النامية العصبي النظام.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="968">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol</td>
			<td style="width:167px;">Serva</td>
			<td style="width:123px;">36975</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">26Gx 1&#39;&#39; needle</td>
			<td style="width:167px;">Henke-Sass, Wolf GmbH</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td>410 Anaesthesia Unit for air pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8323102</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="414">
			<td>Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)</td>
			<td>UKE (Viral Core Facility)</td>
			<td>-</td>
			<td>For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A9414</td>
			<td style="width:423px;">low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Air Pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">Eheim 100</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Araldite</td>
			<td style="width:167px;">CIBA-GEIGY</td>
			<td style="width:123px;">23857.9</td>
			<td style="width:423px;">resin for embedding of tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">aspirator tune assemblies</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:167px;">Temgesic</td>
			<td style="width:123px;">ampules</td>
			<td style="width:423px;">painkiller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">capillaries</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">GB100TF-10</td>
			<td style="width:423px;">with fillament</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">44160</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">11203-23</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">electric shaver</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)</td>
			<td style="width:167px;">Ethicon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">polyamide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:167px;">Bepanthene</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:257px;">Fast Green</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7252</td>
			<td style="width:423px;">for visualization of injected liquids</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:257px;">Gas Routing Switch 4/2 connectors</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8433020</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="132">
			<td height="132" style="height:132px;width:257px;">halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13011-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:257px;">Heparin-Natrium</td>
			<td style="width:167px;">Ratiopharm</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">25 000 I.E./5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Induction box for mice 
			with horizontally moving lid. 
			Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. 
			Wall thickness: 6 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris forceps (10cm, curved, serrated)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14007-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14501-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm 
			Outer dimensions: 257x110x18 mm. 
			Heating area: 190x90 mm 
			The removal of the isoflurane escaping 
			the breathing mask is downwards in compliance with the 
			regulations</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">isoflurane (Attane)</td>
			<td style="width:167px;">JD medical</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">inhalation anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">LED RGB lights</td>
			<td style="width:167px;">Cameo</td>
			<td style="width:123px;">CLQS15RGBW</td>
			<td style="width:423px;">LEDs 2 x 15 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Light microscope Basic DM E</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">4x (N.A. 0.1 &#8734;/-), 10x (N.A. 0.22 &#8734;/0.17), 40x (N.A. 0.65 &#8734;/0.17), 100x (N.A. 1.25 &#8734;/0.17) objectives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">micropipette puller</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">P-97</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13010-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Nickel grids, 200 mesh</td>
			<td style="width:167px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">1GC200</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Osmium (VIII)-oxid</td>
			<td style="width:167px;">Degussa</td>
			<td style="width:123px;">73219</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Propylene oxide</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">82320</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">razor blades</td>
			<td style="width:167px;">Schick</td>
			<td style="width:123px;">87-10489</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Sodium pentobarbital (Narcoren)</td>
			<td style="width:167px;">Merial GmbH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Technovit 4004 two components glue</td>
			<td style="width:167px;">Kulzer</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">Telemacrodevice</td>
			<td style="width:167px;">Canon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Thermopuller P-97</td>
			<td style="width:167px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">thin vibrating razor blade device</td>
			<td style="width:167px;">Krup</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">with Szabo thin blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">toluidine blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">89640</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Transmission electron microscope C20</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">up to 200 kV</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:257px;">Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts 
			Outer diameter: 6mm 
			Inner diameter: 4mm 
			Wa 
			ll thickness: 1mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ultracut E</td>
			<td style="width:167px;">Reichert-Jung</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Univentor Scavenger</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8338001</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Vannas scissors (8 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">15009-08</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord

هذه الدراسة يجمع بين توصيل في الرحم مجهر إلكتروني (TEM) تهدف إلى إجراء تحليل دقيق مورفوميتريكال المعلمات ultrastructural في هياكل الطوبوغرافية التي تم تحديدها على نحو لا لبس فيه، المتأثرين بروتين للفائدة أن يتم إدخال في الكائن الحي عن طريق نقل الفيروس. يسمح هذا النهج الموحد لانتقال سلس من ماكروستروكتورال لتحديد هوية ultrastructural بالتالي خرائط الملاحة الطوبوغرافية في أطلس أنسجة. يكشف المجهر الإلكتروني عالية الاستبانة للأنسجة في-الرحم-ترانسدوسيد أولتراستروكتوري غرامة نيوروبيل ومعلماتها اللدونة، مثل المناطق كروسسيكتيونيد بوتون متشابك، والعدد من الحويصلات متشابك والميتوكوندريا داخل بوتون الشخصية، طول اتصالات متشابك، ومناطق محواري كروسسيكتيونيد، سمك اﻷغماد المايلين، وعدد lamellae المايلين، ومناطق كروسسيكتيونيد الميتوكوندريا التشكيلات الجانبية. ويكشف تحليل هذه المعلمات الأساسية ثاقبة التغييرات من اللدونة ultrastructural في مجالات النظام العصبي التي تتأثر بنقل بنية الوراثية الفيروسية. هذا الأسلوب مجتمعة لا يمكن أن تستخدم فقط لدراسة التأثير المباشر للمهندسة وراثيا من الجزيئات الحيوية و/أو المخدرات على اللدونة العصبية ولكن أيضا يفتح إمكانية دراسة عملية الإنقاذ في الرحم من اللدونة العصبية (مثلاً، في سياق أمراض الأعصاب).

للتخدير سريعة وموثوقة للفئران، واعتبرت العديد من معلمات الأمان، ومساحة أمثل لوحدة التخدير أثبتت أن تكون كافية (الشكل 1أ). تم تصميم الوحدة للتحكم في الخليط من إيسوفلوراني السائل والهواء المحيط بدقة المطلوبة لعملية جراحية ناجحة في الحيوانات الصغ?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord at JoVE.com

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

تقييم البارامترات أعصاب Ultrastructural بعد في توصيل الرحم النامي الماوس المخ والحبل الشوكي

المزيج من مجهر إلكتروني وتوصيل في الرحم ونهج قوية لدراسة التغييرات الشكلية في أولتراستروكتوري جيد للجهاز العصبي أثناء التطوير. يسمح هذا الأسلوب الجمع بين الأفكار العميقة إلى تغييرات في التفاصيل الهيكلية الكامنة وراء أعصاب فيما يتعلق بتمثيلها الطوبوغرافية.

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

يساعد نهجنا المشترك في الإجابة على كيفية تغير معلمات المرونة العصبية فائقة البنية بعد التدخلات التنموية المبكرة للجهاز العصبي الوليد في الرحم. الميزة الرئيسية لطريقتنا هي الحصول على صور عالية الدقة من الهياكل الصغرى والصغرى في نظام الإحداثيات المحددة مسبقاً داخل أطلس الأنسجة. ويعني هذا الأسلوب أن قدرتها العلاجية الترجمية للأمراض العصبية الخلقية.على سبيل المثال، العلاج والإنقاذ في مراحل الجنين باستخدام هذا في تقنية نقل الرحم. ويمكن تطبيق أسلوبنا على أي نموذج آخر. على سبيل المثال، يمكن تغيير أنواع الماوس، وكذلك منطقة الاهتمام.يحتاج الباحثون الذين يحاولون طريقتنا لأول مرة إلى تدريب جراحي عميق، بالإضافة إلى معرفة كيفية إعداد الأنسجة للتصوير المجهري الإلكتروني. تبدأ عن طريق تحميل تلميح شعري مخصص تحتوي على أربع مرات 10 إلى 11 جزيئات الفيروسية من الفيروس المرتبط أدينو نوع 1 طلاء للهدف المطلوب، ووصفت مع صبغة خضراء سريعة على أنبوب الpirator. أضف 15 ميكرولترات من جزيئات الفيروس المرتبطة بـ adeno المسماة في الشعيرات الدموية.بعد ذلك، تأكد من عدم الاستجابة لقرصة إصبع القار في يوم جنيني مُغدَّد 14.5 فأرة حامل، وطهر الجلد. استخدام ملقط قزحية مسننة منحنية ومقص كربيد التنغستن مستقيم لجعل شق الجلد على طول linea mediana. باستخدام ملاقط دومون المستقيمة لقبضة الجدار البريتوني ، استمر على طول ألبا linea مع مقص Vannas المستقيم ووضع قطعة من فيلم البارافين المقننة فوق فتحة البطن واستخدام جهاز يشبه الملعقة لفضح قرون الرحم دون إتلاف الأجنة داخل القرون.بعد تطبيق بضع قطرات من برنامج تلفزيوني 37 درجة مئوية على قرون الرحم، وفحص الأجنة للأضرار أو التشوهات داخل كيس الرحم. بدوره الأجنة بعناية داخل الحويصلات الخاصة بهم حتى يتم تحقيق الموقف المطلوب لكل حقن. عندما تكون الأجنة في مكانها، تحقن من واحد إلى اثنين من ميكرولترات من محلول جسيمات الفيروس المسمى "Fast Green" في كل جنين.بعد أن تم حقن جميع الأجنة ، ضع قرون الرحم مرة أخرى في تجويف البطن ، وأضف بضع قطرات من PBS 37 درجة مئوية في البطن. ثم استخدام البولي أميد 6-0 خياطة الحجم لإغلاق الجدار البريتوني والبولي أميد 3-0 خياطة الحجم وهالستيد البعوض المحفّزة لإغلاق الجلد. لتضمين الأنسجة المعزولة ذات الأهمية للتصوير عن بعد الكلي، ضع عينة الأنسجة في إطار خاص مع زاوية المقطع القابلة للتكرار، ووثيقة الإحداثيات.املأ الإطار بـ 30 درجة مئوية بنسبة 3٪ agarose حتى يتم تغطية الأنسجة، وغطي الإطار بغطاء بلاستيكي حتى تصلب الأاروز. في حين أن agarose هو تصلب، واستخدام جهاز الرسم عن بعد الماكرو لصورة الأنسجة المدمجة وإحداثياتها داخل الإطار. عندما ترسّك الأاغروز، قم بنقل الأنسجة المضمّنة من أغاروز إلى الإطار مع قطع الثغرات المقابلة لإحداثيات الإطار الأول.استخدم جهازًا بشفرة حلاقة رقيقة ومهتزة لقطع الأنسجة المضمنة إلى أجزاء من سمك تجريبي مناسب. ثم صورة كل قسم الأنسجة في برنامج تلفزيوني، وجمع الصور في مجلد. لإعداد عينات الأنسجة للمجهر الإلكترون انتقال، في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، وغسل أقسام الأنسجة مع اثنين من غسل 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني، تليها حضانة لمدة ساعتين في 2٪ ae ae أوسميوم التيروكسيل حل في درجة حرارة الغرفة.في نهاية الحضانة، وغسل أقسام osmicated مرتين أكثر في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة لكل غسل وتجفيف المقاطع في غمر الإيثانول متتابعة 10-15 دقيقة كما هو مبين. بعد غمر الإيثانول 70٪، ضع كل عينة في طبق أسود على خلفية سوداء باهتة وصورة العينات في 70٪ الإيثانول تحت ضوء RGB LED المطبقة على العينات من الجانبين الأيسر والأينى في زوايا 45 درجة. إنشاء أطلس من الصور المقطع مع الإحداثيات عن طريق جمع صور من العينات في سلسلة في مجلد.علاج العينات مع اثنين من 30 دقيقة 100٪ إيثانول الحضانة، تليها اثنين من 30 دقيقة 100٪ 100٪ حضانات أكسيد البروبيلين، وكلاهما في درجة حرارة الغرفة. في حين أن العينات هي احتضان، مزيج الراتنج الطازجة مع أكسيد البروبيلين في واحد إلى واحد ونسب واحد إلى اثنين، وإضافة 3٪ مسرع لكلا الحلين. بعد حضانة أكسيد البروبيلين الثاني، نقل العينات إلى واحد إلى اثنين أكسيد البروبيلين الراتنج تضمين حل متوسط لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، تليها حضانة لمدة ساعتين في واحد إلى واحد أكسيد البروبيلين تضمين محلول متوسط في درجة حرارة الغرفة.في نهاية الحضانة الثانية، نقل الأنسجة إلى أطباق البولي بروبلين شقة، وعلاج الأنسجة جزءا لا يتجزأ من الراتنج الطازجة التي تحتوي على 3٪ مسرع لمدة 12 إلى 24 ساعة في 65 إلى 85 درجة مئوية. ثم تبريد الأنسجة إلى درجة حرارة الغرفة، وإزالة العينات الراتنج جزءا لا يتجزأ من أطباق البولي بروبلين. لتعيين منطقة ذات أهمية، حدد صورة تحتوي على منطقة الاهتمام من أطلس الصور المعد مسبقًا.رسم حدود المنطقة ذات الأهمية على الصورة المقسمة ، فرض هذه الحدود بصريا على عينة جزءا لا يتجزأ تحت المجهر ، واستخدام واحد بوصة 26 قياس الإبرة لخدش هذه الحدود المنطقة على عينة الراتنج. ثم، تسخين العينات إلى 95 درجة مئوية من أجل تليين الراتنج. بعد ذلك، أخرج عينات الراتنج الدافئ من الفرن، واستخدم شفرة حلاقة لاستخراج المناطق ذات الاهتمام.الغراء العينات على الزجاج الاكريليك عقد القضبان من العيار المناسب، وتقليم العينات التي شنت لالقطع شبه ورفيق جدا. استخدام ultramicrotome للحصول على شبه رقيقة 0.7 ميكرومتر و فائقة رقيقة 70 نانومتر أقسام، وجمع أقسام شبه رقيقة على ناقلات الزجاج، والأقسام رقيقة جدا على شبكات النيكل. وصمة عار المقاطع شبه رقيقة مع 1٪ Toluidine الأزرق في برنامج تلفزيوني لمدة أربع دقائق، تليها عدة يغسل في الماء الأيون، قبل فحص المقاطع عن طريق المجهر الخفيفة.ويمكن بعد ذلك تقييم الأجزاء الرقيقة للغاية مباشرة عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال عند 180 كيلوفولت دون مزيد من التعديل. بعد قسم، يتم تصوير شرائح الأنسجة عن طريق التصوير عن بعد الماكرو كما أظهرت للتو. بعد التخبط والإيثانول الغمر، يتم تصوير المقاطع مرة أخرى عن طريق التشويش عن بعد، وكشف عن نمط الملونة خصيصا لكل سطح الأنسجة.بعد الجفاف إضافية والراتنج تضمين، يتم اختيار المناطق ذات الاهتمام ومعالجتها كذلك لنقل المجهر الإلكتروني. في قرن آمون والمخيخ، ومن المعروف أن نقاط الاشتباك العصبي الألياف الطحلبية أن يحمل خصائص ultrastructural فريدة بالمقارنة مع نقاط الاشتباك العصبي الأخرى، بما في ذلك bouة كبيرة. في ملفات التعريف المقطعية الخاصة بهم، تحتوي التاونونات على عدد كبير من الفُيصلات والميتوكوندريا، وغالباً ما تُرفق العديد من الأشواك المتجرّدة.في الحبل الشوكي، يحتوي الـ"ثيرول" على العديد من الألياف المحورية التي تحتوي على النخاعي من قبل oligodendroglia. في المقاطع العرضية ، يمكن العثور على السطح الجانبي الظهري بين كلا القرون الخلفية للحبل الشوكي. على نقل صور المجهر الإلكترون، المحاور النخاعية المقطعة تظهر الجولة، ويتم تنظيم اغلاد المايلين المحيطة محاور في لميلاي.الأطلس المعد وصور التصوير المجهري للإلكترونات المُعدة للبارامترات الفائقة البنية ليست مفيدة فقط للمقارنة بين المرونة العصبية المورفولوجية لمختلف الأقسام في ظل ظروف العلاج المختلفة، ولكن أيضاً للمقارنة بين المعلمات داخل نفس المنطقة. تذكر أن تخطط بدقة والاستعداد قبل البدء في تحويل الرحم، والتأكد من أن يكون النسخ الاحتياطي للمواد والأدوات في حالة حدوث مضاعفات. بعد طريقتنا، يمكن إضافة تقنيات أخرى مثل وضع العلامات المناعية قبل المجهر الإلكتروني لتتبع ultrastructural من جزيء محدد من الفائدة.بدءا من نظرة شاملة للكائن الحي بأكمله والتكبير نحو التضاريس الجزيئية، ونحن قادرون على دراسة والتلاعب في العلاقة بين وظيفة الأنسجة والمورفولوجيا. أوزميوم تتراوكسيد خطر. تأكد من العمل دائمًا تحت غطاء محرك السيارة، وارتداء نظارات واقية وقفازات يدوية عند العمل مع هذا الكاشف.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

السابق الرحم Electroporation للوعضوي النمط من الثقافة شريحة ماوس الحصين الأنسجة

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

عزل الخلايا الجذعية العصبية / السلف من المنطقة المحيطة بالبطين في الجرذان الكبار والحبل الشوكي البشري

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

تقييم البطانية هجرة الخلايا بعد التعرض للمواد الكيميائية السامة

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

مسمار الخرز في تطوير الدجاج أطراف الجنين لتحديد مسارات نقل الإشارة التي تؤثر على التعبير الجيني

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

تقييم الأم الأوعية الدموية إعادة عرض أثناء الحمل في الرحم ماوس

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

تقنية لاستهداف حقن مكروي إلى البلدان النامية<em&gt; القيطم</em&gt; الكلى

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

تشريح وإعداد شريحة الاكليلية وضع الغدة النخامية الماوس

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

عن طريق الحقن الوريدي وداخل السلي في الرحم زرع في نموذج مورين

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

الكشف المناعي 5-ميثيلسيتوسيني وهيدروكسيميثيلسيتوسيني 5 في تطوير والشبكية الماوس بوستميتوتيك

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

التصور للهجرة الخلية عرضية في تيكتوم الألياف الضوئية النامية في الفرخ

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...