Name: assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord
Uploaded: 2019-02-26T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord at JoVE.com

Forfatterne takke kolleger af det animalsk facilitet på det medicinske fakultet, Ruhr-Universität Bochum, for deres støtte og dyrs pleje.

Alle procedurer på animalsk emner er blevet godkendt af de institutionelle Dyreetik udvalg af de føderale stater i Hamburg og Nordrhein-Westfalen, Tyskland.  Brug sterile instrumenter, beskyttelseshandsker og aseptisk frakker i hele hele den kirurgiske procedure.
1. i Utero transduktion
<ol><li>Forberede adeno-associeret virustype 1 (AAV1), der koder for den ønskede mål (4 x 1011 virale partikler/µL af AAV1) i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) pH-værdi på 7,4. Tilføje ...

<ol>
	<li>Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+axo-dendritic+synapses+in+the+hippocampal+cortex:+electron+and+light+microscopic+studies+on+the+layer+of+mossy+fibers.">Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers.</a> Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).</li><li>Hamlyn, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+the+mossy+fibre+endings+in+the+hippocampus+of+the+rabbit.">The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit.</a> Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).</li><li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).</li><li>Rollenhagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+transmission+at+large+hippocampal+mossy+fiber+synapses.">Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses.</a> Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+basic+protein+cleaves+cell+adhesion+molecule+L1+and+promotes+neuritogenesis+and+cell+survival.">Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Basic+Protein+Cleaves+Cell+Adhesion+Molecule+L1+and+Improves+Regeneration+After+Injury.">Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury.</a> Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).</li><li>Kraus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fragment+of+Adhesion+Molecule+L1+Binds+to+Nuclear+Receptors+to+Regulate+Synaptic+Plasticity+and+Motor+Coordination.">A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination.</a> Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferenzph&#228;nomene+am+osmierten+Pr&#228;parat+f&#252;r+die+systematische+elektronenmikroskopische+Untersuchung.">Interferenzph&#228;nomene am osmierten Pr&#228;parat f&#252;r die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung.</a> Mikroskopie. 30, 139 (1974).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+phenomenon+on+somium+tetroxide-fixed+specimens+for+systematic+electron+microscopy.">Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy.</a> Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Methods+for+Characterization+of+Brain+Regions.">General Methods for Characterization of Brain Regions.</a> Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).</li><li>Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+neural+tissues+or+electron+microscopy+by+perfusion+with+solutions+of+osmium+tetroxide.">Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide.</a> Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).</li><li>Webster, H. F., Collins, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+osmium+tetroxide+and+glutaraldehyde+perfusion+fixation+for+the+electron+microscopic+study+on+the+normal+rat+peripheral+nervous+system.">Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).</li><li>Andres, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zur+Methodik+der+Perfusionsfixierung+des+Zentralnervensystems+von+S&#228;ugern.">Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von S&#228;ugern.</a> Mikroskopie. 21, 169 (1967).</li><li>Forssmann, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+par+perfusion+pour+la+microscopie+&#233;lectronique.+Essai.+De+g&#233;n&#233;ralisation.">Fixation par perfusion pour la microscopie &#233;lectronique. Essai. De g&#233;n&#233;ralisation.</a> Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).</li><li>Descarries, L., Schr&#246;der, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+du+tissue+nerveux+par+perfusion+&#224;+grand+debit.">Fixation du tissue nerveux par perfusion &#224; grand debit.</a> Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).</li><li>Langford, L. A., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+potassium+ferricyanide+in+neural+fixation.">The use of potassium ferricyanide in neural fixation.</a> Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calretinin-positive+L5a+pyramidal+neurons+in+the+development+of+the+paralemniscal+pathway+in+the+barrel+cortex.">Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex.</a> Molecular Brain. 7, 84 (2014).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilins+regulate+synaptic+plasticity+and+mitochondrial+calcium+homeostasis+in+the+hippocampal+mossy+fiber+pathway.">Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway.</a> Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li><li>Nishiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+and+regulated+gene+expression+in+murine+Purkinje+cells+by+in+utero+electroporation.">Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation.</a> European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).</li><li>Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORalpha+regulates+multiple+aspects+of+dendrite+development+in+cerebellar+purkinje+cells+in+vivo.">RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).</li></ol>

Et afgørende skridt for in utero transduktion er proceduren injektion. Den præcise injektion i hjernens ventrikler eller i et andet område af interesse kræver erfaring og praktiske færdigheder. Jo tyndere microcapillary spids, de mindre vævsskade kan forekomme; Dette er dog på bekostning af stigende indsprøjtning pres. I modsætning til i livmoderen elektroporation19,20,21,22, overlevel...

Ingen foton kan trænge en ultratynde væv modellen i dybde grade af en elektron. Dette tilskriver uvurderlige fordele til TEM erobre nanometer opløsning billeder i fine strukturer i forhold til lysmikroskopi teknikker. For eksempel, TEM giver mulighed for visualisering af intracellulære organeller som mitokondrier, melanosomer og forskellige typer af sekretorisk granulat, mikrotubuli, microfilaments, cilia, microvilli og intercellulære vejkryds (cellens overflade specialer), navnlig synapser i nervesystemet1,2,3,4. Det overordnede mål med de nuværende metodiske undersøgelse er ultrastrukturelle anerkendelse af ændringer i neural plasticitet under udvikling ved prænatal interferens ved at kombinere de state-of-the-art teknikker i livmoderen transduktion og TEM. Viralt kodede proteiner af interesse har været transduced i livmoderen i det centrale nervesystem5,6,7, herunder rygmarven6. For eksempel, er i livmoderen transduktion i kombination med TEM blevet brugt til at studere effekten af celle vedhæftning molekyle L1 på motordrevne læring plasticitet i L1-mangelfuld mus, navnlig med hensyn til samspillet mellem L1 og nukleare receptorproteiner i cerebellare neuroner7.
Analyse af neuroplasticitet parametre kræver præcise oplysninger om lokaliseringen af de mindste områder inden for nervesystemet. Derfor er det passende at beskrive ultrastrukturelle detaljer og deres nøjagtige topografiske orientering med hensyn til andre strukturer. I den foreliggende undersøgelse præsenteres en forberedende metode med henblik på en detaljeret undersøgelse af særskilte morfologiske områder baseret på både lys og elektronmikroskopi. Denne metode kombinerer flere teknikker til væv manipulation, begyndende med i livmoderen transduktion af musen hjernen og rygmarven og efterfulgt af perfusion fiksering, skimmel-indlejring, og behandling af væv til TEM. Et væsentligt skridt mellem integrering og behandling af væv til TEM er dokumentation af væv, ved hjælp af interferens lysrefleksion teknik, der giver mulighed for præcis microphotographic og lav forstørrelse dokumentationen af væv prøver8,9,10. Indarbejdet i den nuværende fremgangsmåde, denne teknik gør det muligt for forskere at undersøge topografiske og strukturelle detaljer af nervevæv overflader og modellen skive profiler inden deres forberedelse til TEM.
En særlig ramme for skæring hele hjerner svarer til stereotaxisk koordinater. Denne ramme fordele morfologiske tredimensionale (3D) genopbygning af områder i nervevæv og kan bruges til morfometrisk analyse. Macrographs af sektionerne visualiseret tildeles topografiske koordinater, og de seriefremstillede nummererede afsnit bygge kort i et væv atlas.
Efter harpiks behandling, den indlejrede væv er opdelt i ultratynde sektioner (< 70 nm) der indeholder udvalgte områder, ifølge maps af ovennævnte væv atlas. De ultratynde afsnit udsættes for TEM at opnå høj opløsning billeder af plasticitet parametre (f.eks. tværsnit profil områder af synaptic boutons eller cytoskeletale fibre) af deres indhold og kontakter til nærliggende strukturer inden for komplekset neuropil.
Med den metode beskrevet heri, tillader overgangen fra visualiseret macrostructures til mikro- og nanostrukturer sammenlignende grundige undersøgelser af morfologiske neuronal plasticitet efter i utero transduktion af udviklingslandene nervøs system.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="968">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol</td>
			<td style="width:167px;">Serva</td>
			<td style="width:123px;">36975</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">26Gx 1&#39;&#39; needle</td>
			<td style="width:167px;">Henke-Sass, Wolf GmbH</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td>410 Anaesthesia Unit for air pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8323102</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="414">
			<td>Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)</td>
			<td>UKE (Viral Core Facility)</td>
			<td>-</td>
			<td>For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A9414</td>
			<td style="width:423px;">low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Air Pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">Eheim 100</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Araldite</td>
			<td style="width:167px;">CIBA-GEIGY</td>
			<td style="width:123px;">23857.9</td>
			<td style="width:423px;">resin for embedding of tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">aspirator tune assemblies</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:167px;">Temgesic</td>
			<td style="width:123px;">ampules</td>
			<td style="width:423px;">painkiller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">capillaries</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">GB100TF-10</td>
			<td style="width:423px;">with fillament</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">44160</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">11203-23</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">electric shaver</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)</td>
			<td style="width:167px;">Ethicon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">polyamide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:167px;">Bepanthene</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:257px;">Fast Green</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7252</td>
			<td style="width:423px;">for visualization of injected liquids</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:257px;">Gas Routing Switch 4/2 connectors</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8433020</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="132">
			<td height="132" style="height:132px;width:257px;">halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13011-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:257px;">Heparin-Natrium</td>
			<td style="width:167px;">Ratiopharm</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">25 000 I.E./5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Induction box for mice 
			with horizontally moving lid. 
			Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. 
			Wall thickness: 6 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris forceps (10cm, curved, serrated)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14007-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14501-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm 
			Outer dimensions: 257x110x18 mm. 
			Heating area: 190x90 mm 
			The removal of the isoflurane escaping 
			the breathing mask is downwards in compliance with the 
			regulations</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">isoflurane (Attane)</td>
			<td style="width:167px;">JD medical</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">inhalation anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">LED RGB lights</td>
			<td style="width:167px;">Cameo</td>
			<td style="width:123px;">CLQS15RGBW</td>
			<td style="width:423px;">LEDs 2 x 15 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Light microscope Basic DM E</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">4x (N.A. 0.1 &#8734;/-), 10x (N.A. 0.22 &#8734;/0.17), 40x (N.A. 0.65 &#8734;/0.17), 100x (N.A. 1.25 &#8734;/0.17) objectives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">micropipette puller</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">P-97</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13010-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Nickel grids, 200 mesh</td>
			<td style="width:167px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">1GC200</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Osmium (VIII)-oxid</td>
			<td style="width:167px;">Degussa</td>
			<td style="width:123px;">73219</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Propylene oxide</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">82320</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">razor blades</td>
			<td style="width:167px;">Schick</td>
			<td style="width:123px;">87-10489</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Sodium pentobarbital (Narcoren)</td>
			<td style="width:167px;">Merial GmbH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Technovit 4004 two components glue</td>
			<td style="width:167px;">Kulzer</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">Telemacrodevice</td>
			<td style="width:167px;">Canon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Thermopuller P-97</td>
			<td style="width:167px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">thin vibrating razor blade device</td>
			<td style="width:167px;">Krup</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">with Szabo thin blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">toluidine blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">89640</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Transmission electron microscope C20</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">up to 200 kV</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:257px;">Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts 
			Outer diameter: 6mm 
			Inner diameter: 4mm 
			Wa 
			ll thickness: 1mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ultracut E</td>
			<td style="width:167px;">Reichert-Jung</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Univentor Scavenger</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8338001</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Vannas scissors (8 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">15009-08</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord

Den nuværende undersøgelse kombinerer i livmoderen transduktion med transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) sigter mod en præcis morphometrical analyse af ultrastrukturelle parametre i entydigt identificeret topografiske strukturer, ramt af en protein af interesse der er indført i organismen via viral overførsel. Dette kombinerede tiltag giver mulighed for en glidende overgang fra macrostructural til ultrastrukturelle identifikation af følgende topografiske navigationskort i et væv atlas. Høj opløsning elektronmikroskopi af i-utero-transduced væv afslører den fine ultrastruktur af neuropil og dets plasticitet parametre, såsom cross-sectioned synaptic bouton områder, antallet af synaptiske vesikler og mitokondrier inden for en Bouton profil, længden af synaptic kontakter, cross-sectioned cytoskeletale områder, tykkelsen af myelin skeder, antallet af myelin lamellae, og cross-sectioned områder af mitokondrier profiler. En analyse af disse parametre afslører afgørende indsigt i ændringer af ultrastrukturelle plasticitet i de områder af nervesystemet, der er berørt af den virale overførsel af den genetiske konstruktion. Denne kombinerede metode kan ikke kun bruges til at studere den direkte virkning af gensplejsede biomolekyler og/eller narkotika på neuronal plasticitet, men også åbner mulighed for at studere i livmoderen redning af neuronal plasticitet (f.eks. i forbindelse med neurodegenerative sygdomme).

Talrige sikkerhedsparametre ansås for pålidelig og hurtig anæstesi af mus, og en optimeret arbejdsområde af anæstesi enhed viste sig for at være tilstrækkelig (fig. 1A). Enheden er designet til at styre blandingen af flydende isofluran og luften med en præcision, der er nødvendige for vellykket kirurgi på små dyr som mus og rotter. Luft og isofluran blandes i vaporizer ifølge de ønskede indstillinger og leveres i en kasse eller g...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord at JoVE.com

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Vurdering af ultrastrukturelle neuroplasticitet parametre efter i Utero transduktion af udvikle mus hjernen og rygmarven

Kombinationen af transmissions elektronmikroskopi og i livmoderen transduktion er en kraftfuld tilgang til at studere morfologiske ændringer i den fine ultrastruktur af nervesystemet under udvikling. Denne kombinerede metode giver dyb indsigt i ændringer i strukturelle detaljer underliggende neuroplasticitet med hensyn til deres topografiske repræsentation.

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Vores kombinerede tilgang hjælper med at besvare, hvordan ultrastrukturelle neuroplasticitetsparametre ændrer sig efter tidlige udviklingsmæssige indgreb i det spirende nervesystem i livmoderen. Den største fordel ved vores metode er erhvervelsen af billeder i høj opløsning af makro-meso-mikro- og nanostrukturer i det foruddefinerede koordinatsystem i et vævsatlas. Konsekvensen af vores metode er dens translationelle terapeutiske potentiale for medfødte neurodegenerative sygdomme.For eksempel, behandling og redning på embryonale stadier ved hjælp af denne in utero transduktion teknik. Vores metode kan anvendes på enhver anden model. For eksempel kan musearterne ændres, samt det område af interesse.Forskere forsøger vores metode for første gang har brug for dyb kirurgisk uddannelse, samt viden om, hvordan man forbereder vævet til elektron mikroskopisk billeddannelse. Begynd med at indlæse en tilpasset kapillær spids, der indeholder fire gange 10 til de 11 virale partikler af adeno-associeret virus type 1 belægning til det ønskede mål, og mærket med Fast Green farvestof på en aspirator rør. Der tilsættes 15 mikroliter af de mærkede adeno-associerede viruspartikler i kapillæren.Dernæst bekræfte en manglende reaktion på tå knivspids i en bedøvet embryonale dag 14,5 gravid mus, og desinficere huden. Brug buede savtaserede irissekretler og lige wolframcarbid saks til at gøre en hud snit langs linea mediana. Brug lige Dumont pincet til greb bugvæggen, fortsætte langs linea alba med lige Vannas saks og placere et stykke fenestrated paraffin film over abdominal åbning og bruge en ske-lignende enhed til at afsløre livmoderen horn uden at beskadige embryoner inde i hornene.Efter påføring af et par dråber 37-graders-Celsius PBS på uterushornene, skal embryonerne inspiceres for skader eller misdannelser inde i livmodersækken. Drej embryonerne forsigtigt i sækkene, indtil den ønskede position for hver injektion er opnået. Når embryonerne er på plads, injiceres en til to mikroliter af den hurtige grønne viruspartikelopløsning i hvert foster.Efter alle embryoner er blevet injiceret, placere livmoderen horn tilbage i bughulen, og tilsæt et par dråber 37-graders-Celsius PBS i maven. Brug derefter polyamid 6-0 mellemstore suturer til at lukke bughinden væg og polyamid 3-0 mellemstore suturer og Halsted's Mosquito hæmostatiske kraftbærende for at lukke huden. At integrere isolerede væv af interesse for tele-makro fotografering, placere vævprøven i en særlig ramme med reproducerbare sektionsvinkel, og dokumentere koordinaterne.Fyld rammen med 30-graders-Celsius 3% agarose, indtil vævet er dækket, og dække rammen med en plast låg, indtil agarose er hærdet. Mens agarose er hærdning, skal du bruge tele-makro grafisk enhed til at billedet det indlejrede væv og dets koordinater inden for rammen. Når agarose er størknet, overføres det agarose-indlejrede væv ind i rammen med skærehuller svarende til koordinaterne for den første ramme.Brug en enhed med et tyndt og vibrerende barberblad til at skære det indlejrede væv i dele af en passende eksperimentel tykkelse. Derefter billede hver væv sektion i PBS, og indsamle billederne i en mappe. Vævssektionerne skal forberedes til transmissionselektromonekroskopi i et biosikkerhedsskab med to 30-minutters vask i PBS efterfulgt af to timers inkubation i 2% vandig osmiumtroxidopløsning ved stuetemperatur.Ved inkubationens afslutning vaskes de osmicerede sektioner to gange mere i PBS i 30 minutter pr. vask, og sektionerne dehydreres i sekventielle 10-til 15-minutters ethanolnedsænkning som angivet. Efter 70% ethanol nedsænkning, placere hver prøve i en sort skål på en kedelig sort baggrund og billede prøverne i 70% ethanol under LED RGB lys anvendes på prøverne fra venstre og højre side i 45-graders vinkler. Opret et atlas over sektionsbillederne med koordinater ved at indsamle billeder af prøverne i serie i en mappe.Prøverne behandles med to 30-minutters 100%ethanol inkubationer efterfulgt af to 30-minutters 100%propylenoxid inkubationer, begge ved stuetemperatur. Mens prøverne inkuberes, blandes frisklavet harpiks med propylenoxid med et-til-en- og en-til-to-forhold, og der tilsættes 3% accelerator til begge opløsninger. Efter den anden propylenoxidinkubation overføres prøverne til en-til-to-harpikspropylenoxidoplejringsmedopløsningen i to timer ved stuetemperatur efterfulgt af to timers inkubation i en-til-en-harpikspropylenoxidindlejringsmedopløsningen ved stuetemperatur.Ved udgangen af den anden inkubation, overføre væv i flade polypropylen retter, og helbrede den indlejrede væv med frisk harpiks indeholdende 3% accelerator for 12 til 24 timer ved 65 til 85 grader Celsius. Derefter afkøles vævet til stuetemperatur, og fjern harpiks-indlejrede prøver fra polypropylen retter. Hvis du vil tilknytte et interesseområde, skal du vælge et billede, der indeholder det interesseområde, der er fra det tidligere forberedte billedatlas.Tegn grænserne for det område af interesse på det sektionsopdeme billede, optisk overlejre disse grænser på den indlejrede prøve under mikroskopet, og bruge en one-inch 26 gauge nål til at ridse disse region grænser på harpiksen prøven. Derefter opvarmes prøverne til 95 grader Celsius for at blødgøre harpiksen. Dernæst tage de varme harpiks prøver fra ovnen, og bruge et barberblad til punktafgifter de områder af interesse.Lim prøverne på akrylglas med stænger af passende kaliber, og trim de monterede prøver til semi- og ultratynd skæring. Brug en ultramåtom til at erhverve halvtynd 0,7-mikrometer og ultra-tynde 70-nanometer sektioner, indsamle semi-tynde sektioner på glas luftfartsselskaber, og de ultra-tynde sektioner på nikkel gitre. Pletten de halvtynde sektioner med 1%Toluidin blå i PBS i fire minutter, efterfulgt af flere vasker i deioniseret vand, før du undersøger sektionerne ved lys mikroskopi.De ultratynde sektioner kan derefter vurderes direkte ved transmissionselektronmikroskopi ved 180 kilovolt uden yderligere modifikation. Efter sektion, er vævsudsnit afbildet af tele-makro fotografering som netop vist. Efter osmication og ethanol nedsænkning, er sektionerne afbildet igen af interferens lys tele-macrografi, afslører en specielt farvet mønster for hver væv overflade.Efter yderligere dehydrering og harpiks indlejring, er de områder af interesse udvalgt og yderligere behandlet for transmission elektron mikroskopi. I hippocampus og lillehjernen, mossy fiber synapser er kendt for at udstille unikke ultrastrukturelle egenskaber i forhold til andre synapser, herunder store præsynaptiske anfald. I deres tværsnit profiler, indeholder boutons et stort antal vesikler og mitokondrier, og meget ofte omslutte flere dendritiske pigge.I rygmarven, indeholder dorsale funiculus mange axonale fibre, der er myelinated af oligodendroglia. På tværgående sektioner, kan dorsale funiculus findes mellem begge bageste horn i rygmarven. På transmission elektron mikroskopi billeder, tværsnit myelinerede axoner vises rundt, og myelin kapper omkring axoner er organiseret i lamellae.Det forberedte atlas og de mikrografiske transmissionselektromikografibilleder af de ultrastrukturelle parametre er ikke kun nyttige til sammenligning af de morfologiske neuroplasticiteter i forskellige sektioner under forskellige behandlingsbetingelser, men også til sammenligninger mellem parametre inden for samme område. Husk at grundigt planlægge og forberede før du starter in utero transduction, og for at være sikker på at have backup af materialer og instrumenter i tilfælde af komplikationer. Efter vores metode, kan andre teknikker tilsættes såsom immunguld mærkning forud for elektronmikroskopi til ultrastrukturel sporing af et defineret molekyle af interesse.Begyndende med en holistisk opfattelse af hele organismen og zoome ind mod den molekylære topografi, er vi i stand til at studere og manipulere forholdet mellem vævsfunktion og morfologi. Osmium tetroxid er farligt. Sørg for altid at arbejde under kølerhjelmen, og at bære beskyttelsesbriller og håndhandsker, når du arbejder med dette reagens.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Elektroporering og organotypisk Slice kultur Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolering af neurale stam- / progenitorceller fra Periventricular Region Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Vurdering af endotelcellemigration Efter eksponering for giftige kemikalier

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Podning af perler i at udvikle Chicken Embryo lemmer at identificere signaltransduktionsveje påvirker Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Vurdering af Maternal Vascular Remodeling under graviditet i Mus livmoderen

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknik Target Mikroinjektion til udviklingslandene<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Dissektion og koronale skive forberedelse for at udvikle mus hypofysen

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenøs og Intra-fostervand In Utero Transplantation i Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunhistokemisk påvisning af 5-Methylcytosine og 5-Hydroxymethylcytosine i at udvikle og Postmitotic mus nethinden

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering af Tangential celle Migration i den udviklende Chick optiske Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...