Name: assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord
Uploaded: 2019-02-26T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord at JoVE.com

Die Autoren danken die Kollegen aus der Tierhaltung an der medizinischen Fakultät, Ruhr-Universität Bochum, für ihre Unterstützung und Tier Pflege.

Alle Vorgänge an tierische Themen wurden von den institutionellen Tier Ethik-Kommissionen der Bundesländer Hamburg und Nordrhein-Westfalen, Deutschland genehmigt.  Sterile Instrumente, Schutzhandschuhe und aseptische Mäntel während des gesamten chirurgischen Verfahrens zu verwenden.
1. in Utero Transduktion
<ol><li>Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7.4 bereiten Sie Adeno-assoziierten Virustyp 1 (AAV1) Codierung für das gewünschte Ziel (4 x 1011 virale Partik...

<ol>
	<li>Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+axo-dendritic+synapses+in+the+hippocampal+cortex:+electron+and+light+microscopic+studies+on+the+layer+of+mossy+fibers.">Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers.</a> Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).</li><li>Hamlyn, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+the+mossy+fibre+endings+in+the+hippocampus+of+the+rabbit.">The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit.</a> Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).</li><li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).</li><li>Rollenhagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+transmission+at+large+hippocampal+mossy+fiber+synapses.">Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses.</a> Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+basic+protein+cleaves+cell+adhesion+molecule+L1+and+promotes+neuritogenesis+and+cell+survival.">Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Basic+Protein+Cleaves+Cell+Adhesion+Molecule+L1+and+Improves+Regeneration+After+Injury.">Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury.</a> Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).</li><li>Kraus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fragment+of+Adhesion+Molecule+L1+Binds+to+Nuclear+Receptors+to+Regulate+Synaptic+Plasticity+and+Motor+Coordination.">A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination.</a> Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferenzph&#228;nomene+am+osmierten+Pr&#228;parat+f&#252;r+die+systematische+elektronenmikroskopische+Untersuchung.">Interferenzph&#228;nomene am osmierten Pr&#228;parat f&#252;r die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung.</a> Mikroskopie. 30, 139 (1974).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+phenomenon+on+somium+tetroxide-fixed+specimens+for+systematic+electron+microscopy.">Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy.</a> Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Methods+for+Characterization+of+Brain+Regions.">General Methods for Characterization of Brain Regions.</a> Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).</li><li>Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+neural+tissues+or+electron+microscopy+by+perfusion+with+solutions+of+osmium+tetroxide.">Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide.</a> Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).</li><li>Webster, H. F., Collins, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+osmium+tetroxide+and+glutaraldehyde+perfusion+fixation+for+the+electron+microscopic+study+on+the+normal+rat+peripheral+nervous+system.">Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).</li><li>Andres, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zur+Methodik+der+Perfusionsfixierung+des+Zentralnervensystems+von+S&#228;ugern.">Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von S&#228;ugern.</a> Mikroskopie. 21, 169 (1967).</li><li>Forssmann, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+par+perfusion+pour+la+microscopie+&#233;lectronique.+Essai.+De+g&#233;n&#233;ralisation.">Fixation par perfusion pour la microscopie &#233;lectronique. Essai. De g&#233;n&#233;ralisation.</a> Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).</li><li>Descarries, L., Schr&#246;der, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+du+tissue+nerveux+par+perfusion+&#224;+grand+debit.">Fixation du tissue nerveux par perfusion &#224; grand debit.</a> Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).</li><li>Langford, L. A., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+potassium+ferricyanide+in+neural+fixation.">The use of potassium ferricyanide in neural fixation.</a> Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calretinin-positive+L5a+pyramidal+neurons+in+the+development+of+the+paralemniscal+pathway+in+the+barrel+cortex.">Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex.</a> Molecular Brain. 7, 84 (2014).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilins+regulate+synaptic+plasticity+and+mitochondrial+calcium+homeostasis+in+the+hippocampal+mossy+fiber+pathway.">Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway.</a> Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li><li>Nishiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+and+regulated+gene+expression+in+murine+Purkinje+cells+by+in+utero+electroporation.">Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation.</a> European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).</li><li>Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORalpha+regulates+multiple+aspects+of+dendrite+development+in+cerebellar+purkinje+cells+in+vivo.">RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).</li></ol>

Ein entscheidender Schritt in der Gebärmutter Transduktion ist das Injektionsverfahren. Die präzise Injektion in die Hirnkammern oder in einen anderen Bereich des Interesses erfordert Erfahrung und praktische Fähigkeiten. Je dünner der Microcapillary Spitze, kann weniger Gewebeschäden auftreten; Dies ist jedoch auf Kosten der Einspritzdruck erhöht. Im Gegensatz zu den in der Gebärmutter Elektroporation19,20,21,...

Kein Photon kann eine ultradünne Gewebeprobe in die Tiefe Note eines Elektrons eindringen. TEM schreibt das unschätzbare Vorteile bei der Erfassung von Nanometer Auflösung feiner Strukturen im Vergleich zu lichtmikroskopische Techniken. Beispielsweise kann TEM für die Visualisierung von intrazellulären Organellen wie Mitochondrien, Melanosomen und verschiedene Arten von sekretorischen Granulat, Mikrotubuli, Microfili, Cilien, Mikrovilli und interzellulären Verzweigungen (Zelloberfläche Spezialisierungen), insbesondere die Synapsen im Nervensystem1,2,3,4. Das übergeordnete Ziel der vorliegenden Studie methodische ist die Ultrastrukturforschung Anerkennung der Änderungen in neuronale Plastizität während der Entwicklung auf pränatale Störungen durch die Kombination der State-of-the-Art-Techniken in der Gebärmutter Transduktion und TEM. Viral kodierten Proteine des Interesses haben in der Gebärmutter in das zentrale Nervensystem5,6,7, einschließlich Rückenmark6ausgestrahlt wurde. Zum Beispiel wurde in der Gebärmutter Transduktion in Kombination mit TEM verwendet für die Untersuchung der Wirkung von der Zelle Adhäsionsmolekül L1 auf motorischen Lernens Plastizität bei L1-defizienten Mäusen, insbesondere im Hinblick auf das Zusammenspiel zwischen L1 und nukleare Rezeptorproteine zerebelläre Neuronen7.
Die Analyse der Neuroplastizität Parameter erfordert genaue Informationen über die Lokalisation der kleinste Bereiche innerhalb des Nervensystems. Daher ist es angemessen, Ultrastrukturforschung Details und die genaue topographische Orientierung in Bezug auf andere Strukturen zu beschreiben. In der vorliegenden Studie wird eine bestimmte vorbereitende Methode mit dem Ziel der detaillierten Untersuchung von unterschiedlichen morphologischen Bereichen basierend auf Licht- und Elektronenmikroskopie vorgestellt. Dieser Ansatz kombiniert mehrere Techniken der Gewebe Manipulation, beginnend mit der Mausgehirn und Rückenmark im Mutterleib Transduktion und gefolgt von Perfusion Fixierung, Schimmel-einbetten und die Verarbeitung des Gewebes für TEM. Ein wesentlicher Schritt zwischen die Einbettung und die Verarbeitung des Gewebes für TEM ist die Dokumentation des Gewebes, mit Hilfe der Interferenz Lichtreflexion Technik, die für die präzise lichtmikroskopischen und niedrig-Vergrößerung Dokumentation erlaubt Gewebe Proben8,9,10. Das derzeitige Konzept integriert, ermöglicht diese Technik Forscher um topografische und strukturelle Details von Nervengewebe Oberflächen und der Probe Slice Profile vor ihrer Zubereitung für TEM zu untersuchen.
Ein spezieller Rahmen für die ganze Gehirne-Schnitt entspricht stereotaktischen Koordinaten. Dieser Rahmen profitiert die morphologische dreidimensionale (3D) Rekonstruktion der Bereiche im Nervengewebe und morphometrische Analyse einsetzbar. Die Aufnahmen der visualisierten Abschnitte topographische Koordinaten zugewiesen sind, und die seriell nummerierte Abschnitte bauen Karten in einem Gewebe-Atlas.
Nach Harz verarbeitet, wird das eingebettete Gewebe in ultradünnen Abschnitte geschnitten (< 70 nm) mit ausgewählten Bereichen nach den Karten des Atlas genannten Gewebe. Die ultradünnen Abschnitte unterliegen TEM, hochauflösende Bilder der Plastizität Parameter (z. B. Querschnitt Profilbereiche der synaptischen Boutons oder axonalen Fasern) ihres Inhalts und der Kontakte zu benachbarten Strukturen innerhalb des Komplexes zu erhalten Neuropil.
Mit der hier beschriebenen Methode ermöglicht der reibungslose Übergang vom visualisierten Performance, Mikro- und Nanostrukturen detaillierte Vergleichsstudien der morphologischen neuronale Plastizität nach in Utero Transduktion des sich entwickelnden nervös System.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="968">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol</td>
			<td style="width:167px;">Serva</td>
			<td style="width:123px;">36975</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">26Gx 1&#39;&#39; needle</td>
			<td style="width:167px;">Henke-Sass, Wolf GmbH</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td>410 Anaesthesia Unit for air pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8323102</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="414">
			<td>Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)</td>
			<td>UKE (Viral Core Facility)</td>
			<td>-</td>
			<td>For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A9414</td>
			<td style="width:423px;">low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Air Pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">Eheim 100</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Araldite</td>
			<td style="width:167px;">CIBA-GEIGY</td>
			<td style="width:123px;">23857.9</td>
			<td style="width:423px;">resin for embedding of tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">aspirator tune assemblies</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:167px;">Temgesic</td>
			<td style="width:123px;">ampules</td>
			<td style="width:423px;">painkiller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">capillaries</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">GB100TF-10</td>
			<td style="width:423px;">with fillament</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">44160</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">11203-23</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">electric shaver</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)</td>
			<td style="width:167px;">Ethicon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">polyamide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:167px;">Bepanthene</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:257px;">Fast Green</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7252</td>
			<td style="width:423px;">for visualization of injected liquids</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:257px;">Gas Routing Switch 4/2 connectors</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8433020</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="132">
			<td height="132" style="height:132px;width:257px;">halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13011-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:257px;">Heparin-Natrium</td>
			<td style="width:167px;">Ratiopharm</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">25 000 I.E./5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Induction box for mice 
			with horizontally moving lid. 
			Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. 
			Wall thickness: 6 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris forceps (10cm, curved, serrated)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14007-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14501-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm 
			Outer dimensions: 257x110x18 mm. 
			Heating area: 190x90 mm 
			The removal of the isoflurane escaping 
			the breathing mask is downwards in compliance with the 
			regulations</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">isoflurane (Attane)</td>
			<td style="width:167px;">JD medical</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">inhalation anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">LED RGB lights</td>
			<td style="width:167px;">Cameo</td>
			<td style="width:123px;">CLQS15RGBW</td>
			<td style="width:423px;">LEDs 2 x 15 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Light microscope Basic DM E</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">4x (N.A. 0.1 &#8734;/-), 10x (N.A. 0.22 &#8734;/0.17), 40x (N.A. 0.65 &#8734;/0.17), 100x (N.A. 1.25 &#8734;/0.17) objectives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">micropipette puller</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">P-97</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13010-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Nickel grids, 200 mesh</td>
			<td style="width:167px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">1GC200</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Osmium (VIII)-oxid</td>
			<td style="width:167px;">Degussa</td>
			<td style="width:123px;">73219</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Propylene oxide</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">82320</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">razor blades</td>
			<td style="width:167px;">Schick</td>
			<td style="width:123px;">87-10489</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Sodium pentobarbital (Narcoren)</td>
			<td style="width:167px;">Merial GmbH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Technovit 4004 two components glue</td>
			<td style="width:167px;">Kulzer</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">Telemacrodevice</td>
			<td style="width:167px;">Canon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Thermopuller P-97</td>
			<td style="width:167px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">thin vibrating razor blade device</td>
			<td style="width:167px;">Krup</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">with Szabo thin blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">toluidine blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">89640</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Transmission electron microscope C20</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">up to 200 kV</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:257px;">Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts 
			Outer diameter: 6mm 
			Inner diameter: 4mm 
			Wa 
			ll thickness: 1mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ultracut E</td>
			<td style="width:167px;">Reichert-Jung</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Univentor Scavenger</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8338001</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Vannas scissors (8 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">15009-08</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord

Die vorliegende Studie verbindet im Mutterleib Transduktion mit Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) mit dem Ziel einer präzise morphometrischen Analysis der Ultrastrukturforschung Parameter eindeutig identifizierten topographische Strukturen, ein Protein des Interesses betroffen Das wird in den Organismus über virale Übertragung eingeführt. Dieser kombinierte Ansatz ermöglicht einen reibungslosen Übergang vom Macrostructural zum Ultrastrukturforschung Identifikation durch folgende topographische Navigationskarten in einem Gewebe-Atlas. Hochauflösende Elektronenmikroskopie des Gewebes in-Utero-ausgestrahlt verrät das feine Ultrastruktur der Neuropil und dessen Plastizität Parameter, wie z. B. Modellbaugruppe synaptische Bouton Bereiche, die Anzahl der synaptischen Vesikel und Mitochondrien innerhalb einer Bouton Profil, die Länge der synaptischen Kontakte, geschnittenen axonale Bereiche, die Dicke der Myelinscheiden, die Anzahl der Myelin-Lamellen und geschnittenen Flächen der Mitochondrien Profile. Die Analyse dieser Parameter zeigt wesentliche Einblicke in die Veränderungen der Ultrastrukturforschung Plastizität in den Bereichen des Nervensystems, die durch die viralen Übertragung von genetischen Konstrukt betroffen sind. Diese kombinierte Methode kann nicht nur zur Untersuchung der direkten Wirkung von gentechnisch Biomoleküle und/oder Drogen auf neuronale Plastizität, sondern eröffnet auch die Möglichkeit, die im Mutterleib Rettung neuronale Plastizität (z. B. im Rahmen der Studie Neurodegenerative Erkrankungen).

Für die zuverlässige und schnelle Anästhesie von Mäusen zahlreiche sicherheitstechnischen Kenngrößen galten, und ein optimierten Arbeitsbereich des Referats Anästhesie erwies sich als ausreichend (Abb. 1A). Das Gerät soll die Mischung aus flüssigen Isoflurane und Umgebungsluft mit einer Genauigkeit erforderlich für eine erfolgreiche Operation auf kleine Tiere wie Mäuse und Ratten zu kontrollieren. Luft und Isofluran im Verdampfer e...

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Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Bewertung der Ultrastrukturforschung Neuroplastizität Parameter nach In Utero Transduktion von Entwicklungsländern Mausgehirn und Rückenmark

Die Kombination von Transmissions-Elektronenmikroskopie und in der Gebärmutter Transduktion ist ein leistungsfähiger Ansatz für das Studium der morphologischer Veränderungen in den feinen Ultrastruktur des Nervensystems während der Entwicklung. Diese kombinierte Methode ermöglicht tiefe Einblicke in Änderungen in Strukturdetails Neuroplastizität in Bezug auf ihre topographische Darstellung zugrunde liegen.

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Unser kombinierter Ansatz hilft zu beantworten, wie sich ultrastrukturelle Neuroplastizitätsparameter nach frühen Entwicklungsinterventionen in das entstehende Nervensystem in utero ändern. Der Hauptvorteil unserer Methode ist die Erfassung hochauflösender Bilder von Makro-Meso-Mikro- und Nanostrukturen im vordefinierten Koordinatensystem innerhalb eines Gewebeatlas. Die Implikation unserer Methode ist ihr translationales therapeutisches Potenzial für angeborene neurodegenerative Erkrankungen.Zum Beispiel, Behandlung und Rettung in embryonalen Stadien mit diesem in utero Transduktionstechnik. Unsere Methode kann auf jedes andere Modell angewendet werden. Zum Beispiel können die Mausarten geändert werden, sowie das Gebiet von Interesse.Forscher, die unsere Methode zum ersten Mal ausprobieren, benötigen eine profunde chirurgische Ausbildung sowie das Wissen, wie das Gewebe auf die elektronenmikroskopische Bildgebung vorbereitet werden kann. Beginnen Sie mit dem Laden einer kundenspezifischen Kapillarspitze, die viermal 10 auf die 11 Viruspartikel der Adeno-assoziierten Virustyp-1-Beschichtung für das gewünschte Ziel enthält, und beschriftet mit Fast Green Farbstoff auf ein Saugrohr. Fügen Sie 15 Mikroliter der beschrifteten Adeno-assoziierten Viruspartikel in die Kapillare ein.Als nächstes bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen in einem anästhesierten embryonalen Tag 14.5 schwangere Maus, und desinfizieren Sie die Haut. Verwenden Sie gekrümmte gezackte Iris Zangen und gerade Hartmetallschere, um einen Hautschnitt entlang der Linea Mediana zu machen. Mit geraden Dumont Pinzetten, um die Peritonealwand zu greifen, weiter entlang der linea alba mit geraden Vannas Schere und legen Sie ein Stück fenestrated Paraffin Film über die Bauchöffnung und verwenden Sie ein Löffel-ähnliche Gerät, um die Gebärmutterhörner zu belichten, ohne die Embryonen in den Hörnern zu beschädigen.Nach der Anwendung einiger Tropfen 37-Grad-Celsius PBS auf die Gebärmutterhörner, überprüfen Sie die Embryonen auf Schäden oder Fehlbildungen im Inneren des Gebärmuttersacks. Drehen Sie die Embryonen vorsichtig in ihren Säcken, bis die gewünschte Position für jede Injektion erreicht ist. Wenn die Embryonen vorhanden sind, injizieren Sie jedem Embryo ein bis zwei Mikroliter der fast grün markierten Viruspartikellösung.Nachdem alle Embryonen injiziert wurden, legen Sie die Uterushörner wieder in die Bauchhöhle und fügen Sie ein paar Tropfen 37-Grad-Celsius PBS in den Bauch. Verwenden Sie dann Polyamid 6-0 große Nähte, um die Peritonealwand und Polyamid 3-0 Größe Nähte und Halsted s Mosquito hämostatische Zange zu schließen, um die Haut zu schließen. Um isolierte Gewebe einzubetten, die für die Telemakrofotografie von Interesse sind, legen Sie die Gewebeprobe in einen speziellen Rahmen mit dem reproduzierbaren Schnittwinkel und dokumentieren Sie die Koordinaten.Füllen Sie den Rahmen mit 30-Grad-Celsius 3%Agarose, bis das Gewebe bedeckt ist, und bedecken Sie den Rahmen mit einem Kunststoffdeckel, bis die Agarose verhärtet ist. Während die Agarose aushärtet, verwenden Sie das Telemakro-Grafikgerät, um das eingebettete Gewebe und seine Koordinaten innerhalb des Rahmens abzubilden. Wenn sich die Agarose verfestigt hat, übertragen Sie das agarose-eingebettete Gewebe in den Rahmen mit Schnittlücken, die den Koordinaten des ersten Rahmens entsprechen.Verwenden Sie ein Gerät mit einer dünnen und vibrierenden Rasierklinge, um das eingebettete Gewebe in Abschnitte mit einer geeigneten experimentellen Dicke zu schneiden. Zeigen Sie dann jeden Gewebeabschnitt in PBS ab, und sammeln Sie die Bilder in einem Ordner. Zur Vorbereitung der Gewebeproben für die Transmissionselektronenmikroskopie in einem Biosicherheitsschrank die Gewebeabschnitte mit zwei 30-minütigen Waschungen in PBS zu waschen, gefolgt von einer zweistündigen Inkubation in 2% wässriger Osmiumtetroxidlösung bei Raumtemperatur.Am Ende der Inkubation die osmischen Abschnitte zwei weitere Male in PBS für 30 Minuten pro Waschen waschen und dehydrieren Sie die Abschnitte in sequenziellen 10-bis 15-minütigen Ethanol-Eintauchen, wie angegeben. Nach dem 70%Ethanol-Eintauchen legen Sie jede Probe in eine schwarze Schale auf einem stumpfschwarzen Hintergrund und stellen Sie die Proben in 70% Ethanol unter LED-RGB-Licht auf die Proben von der linken und rechten Seite in 45-Grad-Winkeln auf. Erstellen Sie einen Atlas der Schnittbilder mit Koordinaten, indem Sie Bilder der Samples in Reihe in einem Ordner sammeln.Behandeln Sie die Proben mit zwei 30-minütigen 100%Ethanol-Inkubationen, gefolgt von zwei 30-minütigen 100%propylenoxid-Inkubationen, beide bei Raumtemperatur. Während der Inkubation der Proben, mischen Sie frisch zubereitetes Harz mit Propylenoxid im Verhältnis eins zu eins und eins zu zwei, und fügen Sie 3% Beschleuniger zu beiden Lösungen hinzu. Nach der zweiten Propylenoxid-Inkubation die Proben zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in die ein-zu-zwei Harzpropylen-Einbettmedium-Lösung übertragen, gefolgt von einer zweistündigen Inkubation in der eins-zu-eins-Harz-Propylenoxid-Einbettmediumlösung bei Raumtemperatur.Am Ende der zweiten Inkubation das Gewebe in flache Polypropylenschalen übertragen und das eingebettete Gewebe mit frischem Harz mit 3% Beschleuniger für 12 bis 24 Stunden bei 65 bis 85 Grad Celsius aushärten. Dann kühlen Sie das Gewebe auf Raumtemperatur, und entfernen Sie die harzeingebetteten Proben aus den Polypropylen-Geschirr. Um ein Interessengebiet zu kartieren, wählen Sie ein Bild aus, das den Interessenbereich enthält, aus dem zuvor erstellten Bildatlas.Skizzieren Sie die Ränder des Interessenbereichs auf das schnittförmige Bild, überlagern Sie diese Grenzen optisch auf die eingebettete Probe unter dem Mikroskop, und verwenden Sie eine ein Zoll große 26-Spur-Nadel, um diese Bereichsgrenzen auf die Harzprobe zu kratzen. Dann erhitzen Sie die Proben auf 95 Grad Celsius, um das Harz zu erweichen. Als nächstes nehmen Sie die warmen Harzproben aus dem Ofen und verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Bereiche von Interesse zu verbrauchen.Kleben Sie die Proben auf Acrylglashaltestäbe des entsprechenden Kalibers und stutzen Sie die montierten Proben für halb- und ultradünne Schnitte. Verwenden Sie ein Ultramikrotom, um halbdünne 0,7-Mikrometer- und ultradünne 70-Nanometer-Abschnitte zu erwerben, die die hauchdünnen Abschnitte auf Glasträgern und die ultradünnen Abschnitte auf Nickelgittern sammeln. Färben Sie die halbdünnen Abschnitte vier Minuten lang mit 1%Toluidinblau in PBS, gefolgt von mehreren Wärteilen in entionisiertem Wasser, bevor Sie die Abschnitte durch Lichtmikroskopie untersuchen.Die ultradünnen Abschnitte können dann ohne weitere Modifikation direkt durch Transmissionselektronenmikroskopie bei 180 Kilovolt beurteilt werden. Nach dem Schnitt werden die Gewebescheiben durch Telemakrofotografie abgebildet, wie gerade gezeigt. Nach DerOsmierung und Demintauchung von Ethanol werden die Abschnitte durch Interferenzlicht-Telemacrographie wieder abgebildet, wodurch ein speziell gefärbtes Muster für jede Gewebeoberfläche offenbart wird.Nach zusätzlicher Austrocknung und Harzeinbettung werden die Interessengebiete ausgewählt und für die Transmissionselektronenmikroskopie weiterverarbeitet. Im Hippocampus und Kleinhirn, Moosfaser-Synapsen sind dafür bekannt, einzigartige ultrastrukturelle Eigenschaften im Vergleich zu anderen Synapsen aufweisen, einschließlich großer präsynaptischer Boutons. In ihren Querschnittsprofilen enthalten die Boutons eine große Anzahl von Vesikeln und Mitochondrien und umschließen sehr oft mehrere dendritische Stacheln.Im Rückenmark enthält der dorsale Funiculus viele axonale Fasern, die durch Oligodendroglia myeliniert werden. Auf querenden Abschnitten findet sich der dorsale Funiculus zwischen beiden hinteren Hörnern des Rückenmarks. Bei Transmissionselektronenmikroskopiebildern erscheinen querschnittsförmige myelinierte Axone rund, und die Myelinscheiden, die die Axone umgeben, sind in der Lamellen organisiert.Der erstellte Atlas und die mikrografische Transmissionselektronenmikroskopie der ultrastrukturellen Parameter sind nicht nur hilfreich für den Vergleich der morphologischen Neuroplastizität verschiedener Abschnitte unter verschiedenen Behandlungsbedingungen, sondern auch für Vergleiche zwischen Parametern innerhalb desselben Bereichs. Denken Sie daran, gründlich zu planen und vorzubereiten, bevor Sie die in utero Transduktion beginnen, und sicher sein, Backup von Materialien und Instrumenten im Falle von Komplikationen zu haben. Nach unserer Methode können andere Techniken hinzugefügt werden, wie z. B. die Immunogold-Etikettierung vor der Elektronenmikroskopie zur ultrastrukturellen Rückverfolgung eines definierten Moleküls von Interesse.Ausgehend von einer ganzheitlichen Sicht auf den gesamten Organismus und dem Zoomen in Richtung molekularer Topographie sind wir in der Lage, die Beziehung zwischen Gewebefunktion und Morphologie zu untersuchen und zu manipulieren. Osmiumtetroxid ist gefährlich. Achten Sie darauf, immer unter der Haube zu arbeiten, und Schutzbrille und Handschuhe zu tragen, wenn Sie mit diesem Reagenz arbeiten.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Bewertung der Endothelzellmigration nach der Exposition gegenüber toxischen Chemikalien

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Pfropfen von Beads in die Entwicklung von Hühnerembryo-Glieder zu identifizieren Signaltransduktionswegen Beeinflussung der Genexpression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Beurteilung der Maternal Vascular Remodeling während der Schwangerschaft in der Gebärmutter Maus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Dissektion und koronale Slice Vorbereitung Maus Hypophyse zu entwickeln

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenöse und Intra-Fruchtwasser In der Gebärmutter Transplantation in den Mausmodell

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunhistochemische Nachweis von 5 Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine bei der Entwicklung und der postmitotischen Maus Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisierung der tangentialen Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...