Name: assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord
Uploaded: 2019-02-26T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord at JoVE.com

המחברים תודה העמיתים של המתקן בעלי חיים בפקולטה לרפואה, אוניברסיטת הרוהר בוכום, תמיכה וטיפול החיה שלהם.

כל ההליכים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדות האתיקה בעלי חיים מוסדיים של הברית הפדרלית של המבורג, Nordrhein-Westfalen, גרמניה.  השתמש בכלים סטריליים, כפפות מגן ומעילים aseptic לאורך כל תהליך כירורגי.
1. ב. פשוט תאכל התמרה חושית
<ol><li>להכין וירוס adeno-הקשורים סוג 1 (AAV1) קידוד עבור היעד הרצו...

<ol>
	<li>Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+axo-dendritic+synapses+in+the+hippocampal+cortex:+electron+and+light+microscopic+studies+on+the+layer+of+mossy+fibers.">Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers.</a> Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).</li><li>Hamlyn, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+the+mossy+fibre+endings+in+the+hippocampus+of+the+rabbit.">The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit.</a> Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).</li><li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).</li><li>Rollenhagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+transmission+at+large+hippocampal+mossy+fiber+synapses.">Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses.</a> Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+basic+protein+cleaves+cell+adhesion+molecule+L1+and+promotes+neuritogenesis+and+cell+survival.">Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Basic+Protein+Cleaves+Cell+Adhesion+Molecule+L1+and+Improves+Regeneration+After+Injury.">Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury.</a> Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).</li><li>Kraus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fragment+of+Adhesion+Molecule+L1+Binds+to+Nuclear+Receptors+to+Regulate+Synaptic+Plasticity+and+Motor+Coordination.">A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination.</a> Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferenzph&#228;nomene+am+osmierten+Pr&#228;parat+f&#252;r+die+systematische+elektronenmikroskopische+Untersuchung.">Interferenzph&#228;nomene am osmierten Pr&#228;parat f&#252;r die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung.</a> Mikroskopie. 30, 139 (1974).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+phenomenon+on+somium+tetroxide-fixed+specimens+for+systematic+electron+microscopy.">Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy.</a> Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Methods+for+Characterization+of+Brain+Regions.">General Methods for Characterization of Brain Regions.</a> Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).</li><li>Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+neural+tissues+or+electron+microscopy+by+perfusion+with+solutions+of+osmium+tetroxide.">Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide.</a> Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).</li><li>Webster, H. F., Collins, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+osmium+tetroxide+and+glutaraldehyde+perfusion+fixation+for+the+electron+microscopic+study+on+the+normal+rat+peripheral+nervous+system.">Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).</li><li>Andres, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zur+Methodik+der+Perfusionsfixierung+des+Zentralnervensystems+von+S&#228;ugern.">Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von S&#228;ugern.</a> Mikroskopie. 21, 169 (1967).</li><li>Forssmann, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+par+perfusion+pour+la+microscopie+&#233;lectronique.+Essai.+De+g&#233;n&#233;ralisation.">Fixation par perfusion pour la microscopie &#233;lectronique. Essai. De g&#233;n&#233;ralisation.</a> Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).</li><li>Descarries, L., Schr&#246;der, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+du+tissue+nerveux+par+perfusion+&#224;+grand+debit.">Fixation du tissue nerveux par perfusion &#224; grand debit.</a> Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).</li><li>Langford, L. A., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+potassium+ferricyanide+in+neural+fixation.">The use of potassium ferricyanide in neural fixation.</a> Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calretinin-positive+L5a+pyramidal+neurons+in+the+development+of+the+paralemniscal+pathway+in+the+barrel+cortex.">Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex.</a> Molecular Brain. 7, 84 (2014).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilins+regulate+synaptic+plasticity+and+mitochondrial+calcium+homeostasis+in+the+hippocampal+mossy+fiber+pathway.">Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway.</a> Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li><li>Nishiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+and+regulated+gene+expression+in+murine+Purkinje+cells+by+in+utero+electroporation.">Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation.</a> European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).</li><li>Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORalpha+regulates+multiple+aspects+of+dendrite+development+in+cerebellar+purkinje+cells+in+vivo.">RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).</li></ol>

צעד מכריע של התמרה חושית ברחם הוא ההליך הזרקה. הזרקה מדויקת לתוך המוח החדרים או תחום התעניינות נוסף דורש ניסיון ומיומנות מעשית. רזה הטיפ microcapillary, הנזק רקמות עלולות להתרחש; עם זאת, זה על חשבון הגדלת הזרקה בלחץ. בניגוד אלקטרופורציה ברחם19,20,21<...

פוטון לא יכולים לחדור של דגימות רקמה ודק במיוחד בכיתה עומק של אלקטרון. זה מייחסת יתרונות שלא יסולא בפז TEM בלכידת ננומטר תמונות ברזולוציה של המבנים המרשימים לעומת טכניקות במיקרוסקופ אור. לדוגמה, TEM מאפשר החזיית תאיים organelles כגון המיטוכונדריה, melanosomes, סוגים שונים של הפרשה בגרגרים, microtubules, שמתרגם, cilia, microvilli, והצמתים המערכת (תא השטח מתמחה), בפרט synapses מערכת העצבים1,2,3,4. המטרה הכוללת של מתודולוגי במחקר הוא ההכרה ultrastructural של שינויים פלסטיות עצבית במהלך הפיתוח על הפרעה לפני הלידה על-ידי שילוב טכניקות המדינה-of-the-art של התמרה חושית ברחם, TEM. לשווק מקודד חלבונים עניין יש כבר transduced ברחם לתוך מערכת העצבים המרכזית5,6,7, כולל את חוט השדרה6. למשל, נעשה שימוש ברחם התמרה חושית בשילוב עם TEM לימוד ההשפעה של המולקולה אדהזיה תא L1 על למידה פלסטיות בעכברים חשוכת-L1, בפרט לגבי יחסי הגומלין בין L1 חלבונים גרעיניים קולטן מוטורית בנוירונים אסטרוציטומה7.
הניתוח של פרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית דורש מידע מדויק על הלוקליזציה של האזורים הקטנים בתוך מערכת העצבים. לכן, זה מספיק כדי לתאר פרטים ultrastructural ונטיותיהם הטופוגרפי המדויק לגבי מבנים אחרים. במחקר הנוכחי, מוצגת שיטת הכנה ספציפיים מכוון החקירה נתונים היסטוריים של תחומים ברורים מורפולוגי המבוסס על אור והן מיקרוסקופ אלקטרונים. גישה זו משלבת מספר טכניקות של רקמות מניפולציה, החל ברחם התמרה חושית של העכבר המוח ואת חוט השדרה ואחריו יציבות זלוף, הטבעה-עובש, עיבוד הרקמה TEM. צעד חיוני כללה בין את ההטמעה, העיבוד של הרקמה עבור TEM הוא התיעוד של הרקמה, בטכניקה הפרעות השתקפות אור המאפשר מדויק microphotographic והגדלה נמוכה תיעוד רקמות דגימות8,9,10. טכניקה זו שולבו הגישה הנוכחית, מאפשר לחוקרים לבחון פרטים הטופוגרפי ומבניים של רקמות עצבים משטחים ושל הדגימה פרופילים פרוסה לפני שלהם לקראת TEM.
מסגרת מיוחדת עבור חלוקתה המוח כולו מתאים קואורדינטות stereotaxic. מסגרת זו מועילה מורפולוגי תלת מימדי (3D) בבניה מחדש של אזורי ברקמות עצבים, והוא יכול לשמש לניתוח morphometric. Macrographs הסעיפים מטמיעים מוקצים קואורדינטות הטופוגרפי, ולבנות הסעיפים ממוספרים באופן סדרתי מפות אטלס רקמות.
לאחר שרף עיבוד, הרקמה מוטבע הוא למחלקה למקטעים זגוגית (< 70 ננומטר) המכילים אזורים נבחרים, לפי המפות של הרי האטלס הרקמות הנ ל. הסעיפים זגוגית ותוחלת TEM להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה של פלסטיות פרמטרים (למשל, חתך פרופיל תחומי עם העיתון ons סינפטית או סיבי עצב) של התוכן שלהם ושל אנשי קשר למבנים הסמוכים בתוך המתחם מורכב.
בשיטת המתוארים בזאת, חלקה המעבר macrostructures מטמיעים מיקרו - ו nanostructures היתרי השוואתי מעמיק של פלסטיות מורפולוגית עצביים לאחר בתוך הרחם התמרה חושית לפתח לחוצה מערכת.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="968">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol</td>
			<td style="width:167px;">Serva</td>
			<td style="width:123px;">36975</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">26Gx 1&#39;&#39; needle</td>
			<td style="width:167px;">Henke-Sass, Wolf GmbH</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td>410 Anaesthesia Unit for air pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8323102</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="414">
			<td>Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)</td>
			<td>UKE (Viral Core Facility)</td>
			<td>-</td>
			<td>For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A9414</td>
			<td style="width:423px;">low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Air Pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">Eheim 100</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Araldite</td>
			<td style="width:167px;">CIBA-GEIGY</td>
			<td style="width:123px;">23857.9</td>
			<td style="width:423px;">resin for embedding of tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">aspirator tune assemblies</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:167px;">Temgesic</td>
			<td style="width:123px;">ampules</td>
			<td style="width:423px;">painkiller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">capillaries</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">GB100TF-10</td>
			<td style="width:423px;">with fillament</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">44160</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">11203-23</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">electric shaver</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)</td>
			<td style="width:167px;">Ethicon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">polyamide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:167px;">Bepanthene</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:257px;">Fast Green</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7252</td>
			<td style="width:423px;">for visualization of injected liquids</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:257px;">Gas Routing Switch 4/2 connectors</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8433020</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="132">
			<td height="132" style="height:132px;width:257px;">halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13011-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:257px;">Heparin-Natrium</td>
			<td style="width:167px;">Ratiopharm</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">25 000 I.E./5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Induction box for mice 
			with horizontally moving lid. 
			Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. 
			Wall thickness: 6 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris forceps (10cm, curved, serrated)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14007-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14501-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm 
			Outer dimensions: 257x110x18 mm. 
			Heating area: 190x90 mm 
			The removal of the isoflurane escaping 
			the breathing mask is downwards in compliance with the 
			regulations</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">isoflurane (Attane)</td>
			<td style="width:167px;">JD medical</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">inhalation anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">LED RGB lights</td>
			<td style="width:167px;">Cameo</td>
			<td style="width:123px;">CLQS15RGBW</td>
			<td style="width:423px;">LEDs 2 x 15 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Light microscope Basic DM E</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">4x (N.A. 0.1 &#8734;/-), 10x (N.A. 0.22 &#8734;/0.17), 40x (N.A. 0.65 &#8734;/0.17), 100x (N.A. 1.25 &#8734;/0.17) objectives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">micropipette puller</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">P-97</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13010-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Nickel grids, 200 mesh</td>
			<td style="width:167px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">1GC200</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Osmium (VIII)-oxid</td>
			<td style="width:167px;">Degussa</td>
			<td style="width:123px;">73219</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Propylene oxide</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">82320</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">razor blades</td>
			<td style="width:167px;">Schick</td>
			<td style="width:123px;">87-10489</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Sodium pentobarbital (Narcoren)</td>
			<td style="width:167px;">Merial GmbH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Technovit 4004 two components glue</td>
			<td style="width:167px;">Kulzer</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">Telemacrodevice</td>
			<td style="width:167px;">Canon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Thermopuller P-97</td>
			<td style="width:167px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">thin vibrating razor blade device</td>
			<td style="width:167px;">Krup</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">with Szabo thin blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">toluidine blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">89640</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Transmission electron microscope C20</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">up to 200 kV</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:257px;">Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts 
			Outer diameter: 6mm 
			Inner diameter: 4mm 
			Wa 
			ll thickness: 1mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ultracut E</td>
			<td style="width:167px;">Reichert-Jung</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Univentor Scavenger</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8338001</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Vannas scissors (8 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">15009-08</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord

המחקר הנוכחי משלב התמרה חושית ברחם במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) מכוון ניתוח morphometrical מדויק של פרמטרים ultrastructural במבנים הטופוגרפי חד משמעית מזוהה, מושפע חלבון עניין זה הוא הציג לתוך האורגניזם באמצעות העברה ויראלי. גישה משולבת זו מאפשר מעבר חלק מ macrostructural כדי ultrastructural זיהוי על ידי מפות ניווט הטופוגרפי הבאים באטלס רקמות. מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה של הרקמה בעם רחם-transduced חושף את ultrastructure בסדר של מורכב ואת הפרמטרים שלה פלסטיות, כגון אזורים בוטון סינפטית בחתך רוחב, מספר הסינפטיות, המיטוכונדריה בתוך פרופיל בוטון, האורך של קשרים סינפטיים, אזורים עצב בחתך רוחב, העובי של עטיפות המיאלין, המספר של מיאלין lamellae ואזורי בחתך רוחב של המיטוכונדריה פרופילים. הניתוח של פרמטרים אלה מגלה חיוני תובנות שינויים של ultrastructural פלסטיות באזורים של מערכת העצבים המושפעות על-ידי העברת ויראלי הבונה גנטי. שיטה משולבת זו לא ניתן להשתמש רק ללמוד על השפעה ישירה של מולקולות מהונדס גנטית ו/או סמים על פלסטיות עצביים אבל פותח גם את האפשרות ללמוד חילוץ ברחם פלסטיות עצביים (למשל, בהקשר של מחלות ניווניות).

הרדמה מהיר ואמין של עכברים, בטיחות פרמטרים רבים נחשבו, סביבת העבודה של אופטימיזציה של יחידת הרדמה התבררה נאותה (איור 1א'). יחידת נועד לשלוט התערובת של איזופלוריין נוזלי, אויר עם דיוק הנדרש לניתוח מוצלח-חיים קטנים, כגון עכברים וחולדות. אוויר, איזופל...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord at JoVE.com

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

הערכה של הפרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית Ultrastructural לאחר התמרה חושית עם רחם של פיתוח העכבר המוח ואת חוט השדרה

השילוב של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים התמרה חושית ברחם היא גישה חזקה ללמוד שינויים מורפולוגיים במוצא ultrastructure בסדר של מערכת העצבים במהלך הפיתוח. שיטה משולבת זו מאפשרת תובנות שינויים בפרטים מבניים שבבסיס והנוירולוגיה הפלסטית ביחס ייצוגן הטופוגרפי.

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

הגישה המשולבת שלנו מסייעת לענות על האופן שבו פרמטרים אולטרה-מבניים של נוירופלסטיות משתנים לאחר התערבויות התפתחותיות מוקדמות למערכת העצבים המתהווה ברחם. היתרון העיקרי של השיטה שלנו הוא רכישת תמונות ברזולוציה גבוהה של מקרו-מזו-מיקרו וננו-מבנים במערכת הקואורדינטות המוגדרת מראש בתוך אטלס רקמה. המשמעות של השיטה שלנו היא הפוטנציאל הטיפולי התרגומי שלה למחלות ניווניות מולדות.לדוגמה, טיפול והצלה בשלבים עובריים באמצעות זה בטכניקת השכפול ברחם. השיטה שלנו יכולה להיות מיושמת על כל מודל אחר. לדוגמה, ניתן לשנות את מיני העכברים, כמו גם את תחום העניין.חוקרים המנסים את השיטה שלנו בפעם הראשונה זקוקים להכשרה כירורגית מעמיקה, כמו גם את הידע כיצד להכין את הרקמה להדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים. התחל על ידי טעינת קצה נימי מותאם אישית המכיל ארבע פעמים 10 ל 11 חלקיקים ויראליים של ציפוי סוג וירוס הקשורים אדנו 1 עבור היעד הרצוי, ותיוג עם צבע ירוק מהיר על צינור שאפתן. הוסף 15 microliters של חלקיקי וירוס הקשורים אדנו שכותרתו לתוך נימי.לאחר מכן, לאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן ביום עוברי הרדמה 14.5 עכבר בהריון, ולחטא את העור. השתמש מטלחי איריס משוננים מעוקל ומספריים קרביד טונגסטן ישר לעשות חתך בעור לאורך linea mediana. באמצעות פינצטה ישרה Dumont לאחוז בקיר peritoneal, להמשיך לאורך אלבה linea עם מספריים ואנה ישר ולה מניחים חתיכת סרט פרפין fenestrated מעל פתח הבטן ולהשתמש במכשיר דמוי כפית כדי לחשוף את קרני הרחם מבלי לפגוע בעוברים בתוך הקרניים.לאחר החלת כמה טיפות של PBS 37 מעלות צלזיוס על קרני הרחם, לבדוק את העוברים לנזק או מומים בתוך הסק הרחם. להפוך את העוברים בזהירות בתוך השק שלהם עד המיקום הרצוי עבור כל זריקה מושגת. כאשר העוברים נמצאים במקום, להזריק אחד עד שני microliters של פתרון חלקיקי וירוס מסומן ירוק מהיר לתוך כל עובר.לאחר שכל העוברים הוזרקו, מניחים את קרני הרחם בחזרה לחלל הבטן, ומוסיפים כמה טיפות של PBS 37 מעלות צלזיוס לתוך הבטן. לאחר מכן השתמשו בתפרים בגודל פוליאמיד 6-0 כדי לסגור את הקיר הצפק ותפרים בגודל פוליאמיד 3-0 ומטלות המוסטטיות יתושים של Halsted כדי לסגור את העור. כדי להטמיע רקמות מבודדות המעוגלות בצילום טל-מאקרו, מקם את דגימת הרקמה במסגרת מיוחדת עם זווית ההשתנה המתרבה ותעד את הקואורדינטות.ממלאים את המסגרת במכסה פלסטיק ב-30 מעלות צלזיוס עד שהרקמות מכוסות, ומכסים את המסגרת במכסה פלסטיק עד שהתעוררותה מתקשה. בזמן שהתעוררות מתקשה, השתמש בהתקן הגרפי tele-macro כדי לדמיין את הרקמה המוטבעת ואת הקואורדינטות שלה בתוך המסגרת. כאשר התעוררות התגבשה, להעביר את הרקמה מוטבעת אגרוז לתוך המסגרת עם פערי חיתוך המתאימים הקואורדינטות של המסגרת הראשונה.השתמש במכשיר עם סכין גילוח דק ורוטט כדי לחתוך את הרקמה המוטבעת לחלקים של עובי ניסיוני מתאים. לאחר מכן דמיין כל מקטע רקמה ב- PBS, ואסוף את התמונות לתיקיה. כדי להכין את דגימות הרקמה עבור מיקרוסקופ אלקטרונים שידור, בארון biosafety, לשטוף את חלקי הרקמה עם שתי שטיפות 30 דקות PBS, ואחריו דגירה של שעתיים בתסת פתרון 2% אוסמיניום tetroxide מים בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, לשטוף את החלקים osmicated פעמיים נוספות PBS במשך 30 דקות לכל לשטוף ולייבש את החלקים ברצף 10-15 דקות אתנול טבילה כאמור. לאחר טבילת האתנול בשיעור 70%, הנח כל דגימה בצלחת שחורה על רקע שחור עמום ודמיין את הדגימות ב-70%אתנול תחת אור LED RGB שהוחל על הדגימות מצד שמאל וימין בזוויות של 45 מעלות. צור אטלס של תמונות המקטע עם קואורדינטות על ידי איסוף תמונות של הדגימות בסדרה בתיקיה.פנקו את הדגימות בשתי דגירה של 30 דקות של 100% אתנול, ואחריהן שתי דגירה של 30 דקות תחמוצת פרופילן 100%, שתיהן בטמפרטורת החדר. בזמן שהדגימות דגירה, מערבבים שרף טרי עם תחמוצת פרופילן ביחס של אחד לאחד ואחד לשני, ומוסיפים מאיץ של 3% לשני הפתרונות. לאחר הדגירה השנייה של תחמוצת פרופילן, מעבירים את הדגימות לתחמוצת פרופילן של שרף אחד לשניים המטביעה פתרון בינוני למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה של שעתיים בתחמוצת פרופילן שרף אחד לאחד המטביעה פתרון בינוני בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה השנייה, מעבירים את הרקמות לצלחות פוליפרופילן שטוחות, ומרפאים את הרקמות המוטבעות בשרף טרי המכיל 3% מאיץ למשך 12 עד 24 שעות ב-65 עד 85 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מקררים את הרקמה לטמפרטורת החדר, ומסירים את הדגימות המוטמעות בשרף ממנות הפוליפרופילן. למיפוי אזור מעניין, בחרו תמונה הכוללת את אזור העניין מאטלס התמונה שהוכן קודם לכן.לשרטט את גבולות אזור העניין על התמונה חתוכים, אופטית superimpose גבולות אלה על הדגימה מוטבעת מתחת למיקרוסקופ, ולהשתמש מחט מד 26 אינץ ' כדי לגרד גבולות אזור אלה על דגימת השרף. לאחר מכן, מחממים את הדגימות ל 95 מעלות צלזיוס על מנת לרכך את הגוף. לאחר מכן, מוציאים את דגימות שרף חם מהתנור, ולהשתמש סכין גילוח כדי excise את אזורי העניין.הדבק את הדגימות על מוטות החזקת זכוכית אקרילית ברמה המתאימה, וחתוך את הדגימות המותקנות עבור חתך דק למחצה ודק במיוחד. השתמש ultramicrotome לרכוש חצי דק 0.7 מיקרומטר וקטעים דקים במיוחד 70 ננומטר, איסוף החלקים הדקים למחצה על נושאות זכוכית, ואת החלקים הדקים במיוחד על רשתות ניקל. הכתם את החלקים הדקים למחצה בכחול 1% ב- PBS במשך ארבע דקות, ואחריו כמה שטיפות במים מיונים, לפני בחינת החלקים על ידי מיקרוסקופיה קלה.לאחר מכן ניתן להעריך ישירות את החלקים הדקים במיוחד על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של שידור ב-180 קילו-וולט ללא שינוי נוסף. לאחר ההקטעה, פרוסות הרקמה מדמיין על ידי צילום tele-macro כפי שהוכח רק. לאחר ההתנדפות וטבילת האתנול, החלקים נדמיונים שוב על ידי הפרעה קל טל מקרוגרפיה, חושף דפוס צבעוני במיוחד עבור כל משטח רקמה.לאחר התייבשות נוספת והטבעת שף, אזורי העניין נבחרים ומעובדים עוד יותר עבור מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. בהיפוקמפוס ובקטנום, סינפסות סיבים טחב ידועים להפגין מאפיינים אולטרה-מבניים ייחודיים בהשוואה הסינפסות אחרות, כולל boutons presynaptic גדול. בפרופילי חתך רוחב שלהם, boutons מכילים מספר עצום של וריצים ומיטוכונדריה, ולעתים קרובות מאוד להקיף כמה קוצים דנדריטיים.בחוט השדרה, funiculus הגבי מכיל סיבים אקסונאליים רבים כי הם מיאלין על ידי אוליגודאנדרוגליה. על קטעים רוחביים, funiculus הגבי ניתן למצוא בין שתי הקרניים האחוריות של חוט השדרה. על תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור, אקסונים מירליים חתוכים מופיעים עגולים, ואת נדן המירלין המקיף את האקסונים מאורגנים lamellae.האטלס המוכן ותמונות מיקרוסקופיית האלקטרונים המיקרוגרפיות של הפרמטרים האולטרה-מבניים מועילים לא רק להשוואת הנוירופלסטיות המורפולוגית של חלקים שונים בתנאי טיפול שונים, אלא גם להשוואות בין פרמטרים באותו אזור. זכור לתכנן ביסודיות ולהתכונן לפני תחילת ההעתקה ברחם, כדי להיות בטוח שיש גיבוי של חומרים ומכשירים במקרה של סיבוכים. בעקבות השיטה שלנו, ניתן להוסיף טכניקות אחרות כגון תיוג אימונוגולד לפני מיקרוסקופ אלקטרונים עבור מעקב אולטרה מבני של מולקולה מוגדרת של עניין.החל מתצוגה הוליסטית של האורגניזם כולו והתקרבות לטופוגרפיה המולקולרית, אנו מסוגלים ללמוד ולתפעל את הקשר בין תפקוד הרקמה למורפולוגיה. אוסיום טטרוקסיד מסוכן. הקפד תמיד לעבוד מתחת למכסה המנוע, וללבוש משקפי מגן וכפפות יד בעת עבודה עם זה reagent.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

בידוד של תאי גזע / עצביים מהאזור סביב חדרי המוח של העכברוש למבוגרים וחוט השדרה אנושי

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

הערכה של נדידת תאי האנדותל לאחר חשיפה לכימיקלים רעילים

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

הערכה של כלי דם אימהי שיפוץ במהלך ההריון ברחם העכבר

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

ניתוח והכנת פרוסה הילתית בפיתוח העכבר בלוטת יותרת המוח

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

תוך ורידי, אינטרה-שפיר בתוך הרחם השתלת במודל מאתר

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunohistochemical זיהוי של 5-Methylcytosine, 5-Hydroxymethylcytosine בפיתוח ואת הרשתית העכבר Postmitotic

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...