Name: assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord
Uploaded: 2019-02-26T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord at JoVE.com

Gli autori ringraziano i colleghi della struttura animale alla facoltà di medicina, Università della Ruhr di Bochum, per la loro cura di animali e di supporto.

Tutte le procedure su soggetti animali sono state approvate dai comitati di etica animale istituzionale degli Stati federali di Amburgo e Nordrhein-Westfalen, Germania.  Utilizzare strumenti sterili, guanti protettivi e cappotti asettici durante tutta la procedura chirurgica.
1. nella trasduzione del Utero
<ol><li>Preparare virus adeno-associato di tipo 1 (AAV1) che codifica per la destinazione desiderata (4 x 1011 virale particelle / µ l di AAV1) in tampone fosfato salino (PBS...

<ol>
	<li>Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+axo-dendritic+synapses+in+the+hippocampal+cortex:+electron+and+light+microscopic+studies+on+the+layer+of+mossy+fibers.">Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers.</a> Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).</li><li>Hamlyn, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+the+mossy+fibre+endings+in+the+hippocampus+of+the+rabbit.">The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit.</a> Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).</li><li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).</li><li>Rollenhagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+transmission+at+large+hippocampal+mossy+fiber+synapses.">Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses.</a> Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+basic+protein+cleaves+cell+adhesion+molecule+L1+and+promotes+neuritogenesis+and+cell+survival.">Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Basic+Protein+Cleaves+Cell+Adhesion+Molecule+L1+and+Improves+Regeneration+After+Injury.">Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury.</a> Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).</li><li>Kraus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fragment+of+Adhesion+Molecule+L1+Binds+to+Nuclear+Receptors+to+Regulate+Synaptic+Plasticity+and+Motor+Coordination.">A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination.</a> Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferenzph&#228;nomene+am+osmierten+Pr&#228;parat+f&#252;r+die+systematische+elektronenmikroskopische+Untersuchung.">Interferenzph&#228;nomene am osmierten Pr&#228;parat f&#252;r die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung.</a> Mikroskopie. 30, 139 (1974).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+phenomenon+on+somium+tetroxide-fixed+specimens+for+systematic+electron+microscopy.">Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy.</a> Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Methods+for+Characterization+of+Brain+Regions.">General Methods for Characterization of Brain Regions.</a> Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).</li><li>Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+neural+tissues+or+electron+microscopy+by+perfusion+with+solutions+of+osmium+tetroxide.">Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide.</a> Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).</li><li>Webster, H. F., Collins, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+osmium+tetroxide+and+glutaraldehyde+perfusion+fixation+for+the+electron+microscopic+study+on+the+normal+rat+peripheral+nervous+system.">Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).</li><li>Andres, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zur+Methodik+der+Perfusionsfixierung+des+Zentralnervensystems+von+S&#228;ugern.">Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von S&#228;ugern.</a> Mikroskopie. 21, 169 (1967).</li><li>Forssmann, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+par+perfusion+pour+la+microscopie+&#233;lectronique.+Essai.+De+g&#233;n&#233;ralisation.">Fixation par perfusion pour la microscopie &#233;lectronique. Essai. De g&#233;n&#233;ralisation.</a> Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).</li><li>Descarries, L., Schr&#246;der, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+du+tissue+nerveux+par+perfusion+&#224;+grand+debit.">Fixation du tissue nerveux par perfusion &#224; grand debit.</a> Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).</li><li>Langford, L. A., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+potassium+ferricyanide+in+neural+fixation.">The use of potassium ferricyanide in neural fixation.</a> Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calretinin-positive+L5a+pyramidal+neurons+in+the+development+of+the+paralemniscal+pathway+in+the+barrel+cortex.">Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex.</a> Molecular Brain. 7, 84 (2014).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilins+regulate+synaptic+plasticity+and+mitochondrial+calcium+homeostasis+in+the+hippocampal+mossy+fiber+pathway.">Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway.</a> Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li><li>Nishiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+and+regulated+gene+expression+in+murine+Purkinje+cells+by+in+utero+electroporation.">Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation.</a> European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).</li><li>Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORalpha+regulates+multiple+aspects+of+dendrite+development+in+cerebellar+purkinje+cells+in+vivo.">RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).</li></ol>

Un passo cruciale di trasduzione nell'utero è la procedura di iniezione. L'iniezione precisa nei ventricoli del cervello o in un'altra area di interesse richiede esperienza e abilità pratiche. Più sottile è la punta di microcapillary, può verificarsi il meno danno tessutale; Tuttavia, questo è a costo di aumentare la pressione di iniezione. In contrasto con elettroporazione nell'utero19,20,21,2...

Nessun fotone può penetrare un campione di tessuto ultrasottile del grado di profondità di un elettrone. Questo attribuisce vantaggi inestimabili a TEM a catturare immagini a risoluzione nanometrica di strutture fini rispetto alle tecniche di microscopia chiara. Ad esempio, TEM consente la visualizzazione di organelli intracellulari come i mitocondri, i melanosomes e vari tipi di granuli secretori, microtubuli, microfilamenti, ciglia, microvilli e giunzioni intercellulari (superficie cellulare specializzazioni), in particolare le sinapsi nel sistema nervoso1,2,3,4. L'obiettivo generale del presente studio metodologico è il riconoscimento ultrastrutturale dei cambiamenti nella plasticità neurale durante lo sviluppo su interferenza prenatale combinando le tecniche di state-of-the-art di trasduzione nell'utero e TEM. Viralmente codificato le proteine di interesse sono state trasdotte nell'utero nel sistema nervoso centrale5,6,7, compreso il midollo spinale6. Per esempio, nell'utero trasduzione in combinazione con TEM è stato utilizzato per studiare l'effetto della molecola di adesione cellulare L1 sull'apprendimento plasticità nei topi L1-carenti, in particolare per quanto riguarda l'interazione tra L1 e proteine recettori nucleari motorio in neuroni cerebellari7.
L'analisi dei parametri di neuroplasticità richiede informazioni precise circa la localizzazione delle zone più piccole all'interno del sistema nervoso. Pertanto, essa è sufficiente descrivere dettagli ultrastrutturali e il loro orientamento topografico esatta rispetto alle altre strutture. Nello studio presente, è presentato un metodo specifico preparatorio puntando l'indagine dettagliata di aree morfologiche distinte sulla base sia di luce e di microscopia elettronica. Questo approccio combina diverse tecniche di manipolazione dei tessuti, a partire con trasduzione nell'utero del cervello del topo e del midollo spinale e seguita dalla fissazione di aspersione, incorporamento di muffa e il tessuto di elaborazione per TEM. Un passo essenziale incluso tra l'incorporamento e la lavorazione del tessuto per TEM è la documentazione del tessuto, usando la tecnica di riflessione della luce di interferenza che permette la precisa documentazione microfotografici e basso ingrandimento dei tessuto esemplari8,9,10. Inglobato l'approccio attuale, questa tecnica permette ai ricercatori di esaminare dettagli topografici e strutturali delle superfici di tessuto nervoso e dei profili di fetta di campione prima della loro preparazione per TEM.
Una cornice speciale per il sezionamento intero cervello corrisponde alle coordinate stereotassiche. Questo telaio avvantaggia la ricostruzione (3D) tridimensionale morfologica delle aree nel tessuto nervoso e può essere utilizzato per l'analisi morfometrica. Le grafie delle sezioni visualizzate vengono assegnate coordinate topografiche e le sezioni numerate progressivamente costruire mappe in un Atlante di tessuto.
Dopo resina l'elaborazione, il tessuto incorporato è sezionato in sezioni ultrasottili (< 70 nm) contenenti aree selezionate, secondo le mappe dell'Atlante del tessuto di cui sopra. Le sezioni ultrasottili sono sottoposti a TEM per ottenere immagini ad alta risoluzione di parametri di plasticità (ad es., sezione profilo aree di boutons sinaptici o fibre assonali) del loro contenuto e dei contatti per le strutture vicine all'interno del complesso neuropil.
Con il metodo descritto nel presente documento, la transizione da macrostrutture visualizzati per micro - e nanostrutture consente studi comparativi approfonditi di plasticità neuronale morfologici dopo nell'utero trasduzione dello sviluppo nervoso sistema.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="968">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol</td>
			<td style="width:167px;">Serva</td>
			<td style="width:123px;">36975</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">26Gx 1&#39;&#39; needle</td>
			<td style="width:167px;">Henke-Sass, Wolf GmbH</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td>410 Anaesthesia Unit for air pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8323102</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="414">
			<td>Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)</td>
			<td>UKE (Viral Core Facility)</td>
			<td>-</td>
			<td>For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A9414</td>
			<td style="width:423px;">low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Air Pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">Eheim 100</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Araldite</td>
			<td style="width:167px;">CIBA-GEIGY</td>
			<td style="width:123px;">23857.9</td>
			<td style="width:423px;">resin for embedding of tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">aspirator tune assemblies</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:167px;">Temgesic</td>
			<td style="width:123px;">ampules</td>
			<td style="width:423px;">painkiller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">capillaries</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">GB100TF-10</td>
			<td style="width:423px;">with fillament</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">44160</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">11203-23</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">electric shaver</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)</td>
			<td style="width:167px;">Ethicon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">polyamide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:167px;">Bepanthene</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:257px;">Fast Green</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7252</td>
			<td style="width:423px;">for visualization of injected liquids</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:257px;">Gas Routing Switch 4/2 connectors</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8433020</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="132">
			<td height="132" style="height:132px;width:257px;">halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13011-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:257px;">Heparin-Natrium</td>
			<td style="width:167px;">Ratiopharm</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">25 000 I.E./5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Induction box for mice 
			with horizontally moving lid. 
			Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. 
			Wall thickness: 6 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris forceps (10cm, curved, serrated)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14007-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14501-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm 
			Outer dimensions: 257x110x18 mm. 
			Heating area: 190x90 mm 
			The removal of the isoflurane escaping 
			the breathing mask is downwards in compliance with the 
			regulations</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">isoflurane (Attane)</td>
			<td style="width:167px;">JD medical</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">inhalation anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">LED RGB lights</td>
			<td style="width:167px;">Cameo</td>
			<td style="width:123px;">CLQS15RGBW</td>
			<td style="width:423px;">LEDs 2 x 15 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Light microscope Basic DM E</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">4x (N.A. 0.1 &#8734;/-), 10x (N.A. 0.22 &#8734;/0.17), 40x (N.A. 0.65 &#8734;/0.17), 100x (N.A. 1.25 &#8734;/0.17) objectives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">micropipette puller</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">P-97</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13010-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Nickel grids, 200 mesh</td>
			<td style="width:167px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">1GC200</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Osmium (VIII)-oxid</td>
			<td style="width:167px;">Degussa</td>
			<td style="width:123px;">73219</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Propylene oxide</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">82320</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">razor blades</td>
			<td style="width:167px;">Schick</td>
			<td style="width:123px;">87-10489</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Sodium pentobarbital (Narcoren)</td>
			<td style="width:167px;">Merial GmbH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Technovit 4004 two components glue</td>
			<td style="width:167px;">Kulzer</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">Telemacrodevice</td>
			<td style="width:167px;">Canon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Thermopuller P-97</td>
			<td style="width:167px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">thin vibrating razor blade device</td>
			<td style="width:167px;">Krup</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">with Szabo thin blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">toluidine blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">89640</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Transmission electron microscope C20</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">up to 200 kV</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:257px;">Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts 
			Outer diameter: 6mm 
			Inner diameter: 4mm 
			Wa 
			ll thickness: 1mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ultracut E</td>
			<td style="width:167px;">Reichert-Jung</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Univentor Scavenger</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8338001</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Vannas scissors (8 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">15009-08</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord

Il presente studio combina trasduzione nell'utero, con microscopia elettronica a trasmissione (TEM), che mira ad un'analisi morfometrica precisa dei parametri ultrastrutturali in strutture topografiche inequivocabilmente identificati, colpite da una proteina di interesse che è introdotta nell'organismo tramite trasferimento virale. Questo approccio combinato consente una transizione fluida dal macrostrutturali identificazione ultrastrutturale di seguenti mappe topografiche in un Atlante di tessuto. Microscopia elettronica ad alta risoluzione del tessuto in-utero-trasdotte rivela l'ultrastruttura bene del neuropil e i relativi parametri di plasticità, quali le bouton sinaptico zone, il numero delle vescicole sinaptiche e dei mitocondri all'interno di un Profilo di bouton, la lunghezza dei contatti sinaptici, le aree di axonal, lo spessore di foderi di myelin, il numero delle lamelle di mielina e le zone di profili di mitocondri. L'analisi di questi parametri rivela intuizioni essenziali modifiche ultrastrutturali plasticità nelle aree del sistema nervoso che sono interessati dal trasferimento virale del costrutto genetico. Questo metodo combinato non può essere utilizzato solo per studiare l'effetto diretto di geneticamente biomolecole e/o droghe sulla plasticità neuronale, ma apre anche la possibilità di studiare il salvataggio nell'utero della plasticità neuronale (ad es., nel contesto della malattie neurodegenerative).

Per anestesia affidabile e veloce di topi, sono stati considerati numerosi parametri di sicurezza e un'area di lavoro ottimizzata dell'unità anestesia si è rivelata adeguata (Figura 1A). L'unità è progettata per controllare la miscela di isoflurane liquida e aria ambiente con una precisione richiesta per riuscito ambulatorio su piccoli animali, quali topi e ratti. Aria e isoflurano sono mescolati in vaporizzatore secondo le impostazioni d...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord at JoVE.com

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturali dopo In Utero trasduzione del Mouse cervello e midollo spinale

La combinazione di microscopia elettronica di trasmissione e trasduzione nell'utero è un approccio potente per studiare i cambiamenti morfologici nell'ultrastruttura bene del sistema nervoso durante lo sviluppo. Questo metodo combinato consente approfondimenti cambiamenti nei dettagli strutturali sottostanti la neuroplasticità rispetto alla loro rappresentazione topografica.

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Il nostro approccio combinato aiuta a rispondere a come cambiano i parametri di neuroplasticità ultrastrutturale dopo i primi interventi di sviluppo al nascente sistema nervoso in utero. Il principale vantaggio del nostro metodo è l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione di macro-meso-micro-e nanostrutture nel sistema di coordinate predefinito all'interno di un atlante tissutale. L'implicazione del nostro metodo è il suo potenziale terapeutico trascizionale per le malattie neurodegenerative congenite.Ad esempio, il trattamento e il salvataggio a stadi embrionali usando questo nella tecnica di trasduzione utero. Il nostro metodo può essere applicato a qualsiasi altro modello. Ad esempio, le specie di topi possono essere modificate, così come l'area di interesse.I ricercatori che provano il nostro metodo per la prima volta hanno bisogno di un profondo allenamento chirurgico, così come la conoscenza di come preparare il tessuto per l'imaging microscopico elettronico. Inizia caricando una punta capillare personalizzata contenente quattro volte 10 alle 11 particelle virali del rivestimento virus di tipo 1 adeno-associato per il bersaglio desiderato ed etichettata con colorante Fast Green su un tubo aspiratore. Aggiungere 15 microlitri delle particelle virali etichettate adeno-associate nel capillare.Successivamente, confermare la mancanza di risposta al dito del piedi in un topo incinta anestetizzato giorno embrionale 14.5 e disinfettare la pelle. Utilizzare forcette dell'iride seghettate curve e forbici dritte in carburo di tungsteno per fare un'incisione cutanea lungo la linea mediana. Utilizzando pinzette Dumont dritte per afferrare la parete peritoneale, continuare lungo la linea alba con forbici Vannas dritte e posizionare un pezzo di pellicola di paraffina fenestrata sopra l'apertura addominale e utilizzare un dispositivo simile a un cucchiaio per esporre le corna uterine senza danneggiare gli embrioni all'interno delle corna.Dopo aver applicato alcune gocce di PBS a 37 gradi Celsius sulle corna uterine, ispezionare gli embrioni alla ricerca di danni o malformazioni all'interno del sacco uterino. Ruotare accuratamente gli embrioni all'interno delle sacche fino a raggiungere la posizione desiderata per ogni iniezione. Quando gli embrioni sono in posizione, iniettare uno o due microlitri della soluzione di particelle virali etichettate Fast Green in ogni embrione.Dopo che tutti gli embrioni sono stati iniettati, riposizionare le corna uterine nella cavità addominale e aggiungere alcune gocce di PBS a 37 gradi Celsius nell'addome. Quindi utilizzare suture di dimensioni poliammide 6-0 per chiudere la parete peritoneale e suture di dimensioni poliammide 3-0 e le forcep emostatiche Mosquito di Halsted per chiudere la pelle. Per incorporare tessuti isolati di interesse per la fotografia tele-macro, posizionare il campione di tessuto in una cornice speciale con l'angolo di sessatura riproducibile e documentare le coordinate.Riempire il telaio con 30 gradi Celsius 3%agarosio fino a quando il tessuto non è coperto e coprire il telaio con un coperchio di plastica fino a quando l'agarosio non si è indurito. Mentre l'agarosio si sta indurendo, usa il dispositivo grafico tele-macro per immagini il tessuto incorporato e le sue coordinate all'interno del fotogramma. Quando l'agarosio si è solidificato, trasferire il tessuto incorporato nell'agarosio nel telaio con spazi di taglio corrispondenti alle coordinate del primo telaio.Utilizzare un dispositivo con una lama di rasoio sottile e vibrante per tagliare il tessuto incorporato in sezioni di uno spessore sperimentale appropriato. Quindi immagini ogni sezione di tessuto in PBS e raccogli le immagini in una cartella. Per preparare i campioni di tessuto per la microscopia elettronica a trasmissione, in un armadio di biosicurezza, lavare le sezioni tissutali con due lavaggi di 30 minuti in PBS, seguiti da un'incubazione di due ore in soluzione di tetrossido di osmio acquoso al 2% a temperatura ambiente.Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni osmicate altre due volte in PBS per 30 minuti per lavaggio e disidratare le sezioni in immersioni sequenziali di etanolo da 10 a 15 minuti come indicato. Dopo l'immersione al 70% di etanolo, posizionare ogni campione in un piatto nero su uno sfondo nero opaco e immagini i campioni in etanolo al 70% sotto la luce RGB LED applicata ai campioni dai lati sinistro e destro con angoli di 45 gradi. Creare un atlante delle immagini della sezione con le coordinate raccogliendo le immagini degli esempi in serie in una cartella.Trattare i campioni con due incubazioni di etanolo al 100% di 30 minuti, seguite da due incubazioni di ossido di propilene al 100% di 30 minuti, entrambe a temperatura ambiente. Durante l'incubazione dei campioni, mescolare la resina preparata al momento con ossido di propilene a rapporti uno-a-uno e uno-a-due e aggiungere l'acceleratore del 3% a entrambe le soluzioni. Dopo la seconda incubazione di ossido di propilene, trasferire i campioni nella soluzione media di incorporamento di ossido di propilene di resina uno-a-due per due ore a temperatura ambiente, seguita da un'incubazione di due ore nella soluzione media di incorporamento di ossido di propilene di resina uno-a-uno a temperatura ambiente.Alla fine della seconda incubazione, trasferire i tessuti in piatti in polipropilene e curare i tessuti incorporati con resina fresca contenente il 3% di acceleratore per 12-24 ore a 65-85 gradi Celsius. Quindi raffreddare il tessuto a temperatura ambiente e rimuovere i campioni incorporati nella resina dalle stoviglie in polipropilene. Per mappare un'area di interesse, selezionare un'immagine contenente l'area di interesse dall'atlante delle immagini preparato in precedenza.Traccia i bordi dell'area di interesse sull'immagine sesata, sovrappone otticamente questi bordi al campione incorporato al microscopio e usa un ago calibro 26 da un pollice per graffiare questi bordi della regione sul campione di resina. Quindi, riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per ammorbidire la resina. Successivamente, esegna i campioni di resina calda dal forno e usa una lama di rasoio per asportare le aree di interesse.Incollare i campioni su barre di tenuta in vetro acrilico del calibro appropriato e tagliare i campioni montati per sezioni semi-e ultrasottili. Usa un ultramicrotomo per acquisire sezioni semisottili da 0,7 micrometri e ultrasottili da 70 nanometri, raccogliendo le sezioni semisottili sui supporti di vetro e le sezioni ultrasottili sulle griglie di nichel. Macchiare le sezioni semisottili con 1%Toluidina blu in PBS per quattro minuti, seguite da diversi lavaggi in acqua deionizzata, prima di esaminare le sezioni con microscopia leggera.Le sezioni ultrasottili possono quindi essere valutate direttamente mediante microscopia elettronica a trasmissione a 180 kilovolt senza ulteriori modifiche. Dopo il sezionamento, le fette di tessuto vengono fotografate dalla fotografia tele-macro come appena dimostrato. Dopo l'osmicazione e l'immersione in etanolo, le sezioni vengono nuovamente immaginite dalla tele-macrografia della luce di interferenza, rivelando un motivo specificamente colorato per ogni superficie tissutale.Dopo un'ulteriore disidratazione e incorporamento della resina, le aree di interesse vengono selezionate e ulteriormente lavorate per la microscopia elettronica a trasmissione. Nell'ippocampo e nel cervelletto, le sinapsi delle fibre muschiose mostrano caratteristiche ultrastrutturali uniche rispetto ad altre sinapsi, tra cui grandi bouton presnaptici. Nei loro profili di sezione trasversale, i bouton contengono un gran numero di vescicole e mitocondri, e molto spesso racchiudono diverse spine dendritiche.Nel midollo spinale, il funicolo dorsale contiene molte fibre assonali mielinate da oligodendroglia. Sulle sezioni trasversali, il funicolo dorsale può essere trovato tra entrambe le corna posteriori del midollo spinale. Nelle immagini della microscopia elettronica a trasmissione, gli assoni mielini catenati a sezione trasversale appaiono rotondi, e le suone mieline che circondano gli assoni sono organizzate nelle lamelle.L'atlante preparato e le immagini di microscopia elettronica a trasmissione micrografica dei parametri ultrastrutturali sono utili non solo per il confronto della neuroplasticità morfologica di diverse sezioni in varie condizioni di trattamento, ma anche per confronti tra parametri all'interno della stessa area. Ricorda di pianificare e preparare a fondo prima di iniziare la trasduzione in utero e di essere sicuro di avere il backup di materiali e strumenti in caso di complicazioni. Seguendo il nostro metodo, è possibile aggiungere altre tecniche come l'etichettatura immunogold prima della microscopia elettronica per il tracciamento ultrastrutturale di una molecola di interesse definita.Partendo da una visione olistica dell'intero organismo e zoomando verso la topografia molecolare, siamo in grado di studiare e manipolare la relazione tra funzione tissutale e morfologia. Il tetrossido di osmio è pericoloso. Assicurati di lavorare sempre sotto il cofano e di indossare occhiali protettivi e guanti quando lavori con questo reagente.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex utero elettroporazione e Organotipica Fetta Cultura del mouse ippocampale Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolamento di Neural cellule staminali / progenitrici dalla Regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Valutazione della migrazione delle cellule endoteliali dopo l&#39;esposizione a sostanze chimiche tossiche

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

L&#39;innesto di Perline in via di sviluppo di pollo Limbs embrioni per identificare percorsi di trasduzione del segnale che influenzano l&#39;espressione genica

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Valutazione della materna vascolare rimodellamento durante la gravidanza in utero mouse

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Dissezione e preparazione coronale fetta di sviluppare la ghiandola pituitaria del Mouse

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Endovenosa e Intra-amniotic nell'Utero trapianto nel modello murino

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Rilevazione di Immunohistochemical di 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina nello sviluppo e Retina di topo Postmitotic

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualizzazione della migrazione cellulare tangenziale nel Tectum ottica di pulcino in via di sviluppo

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...