Name: assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord
Uploaded: 2019-02-26T14:45:00
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著者は、そのサポートと動物のケアのため医学部、ルール大学ボーフムで飼養施設の同僚をありがちましょう。

動物の主題のすべてのプロシージャは、ハンブルク、ドイツのノルトライン ・ ヴェストファーレン州の州の動物倫理委員会によって承認されています。 滅菌器具、手袋、外科プロシージャ全体で無菌のコートを使用します。
1. 子宮伝達で
<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ph 7.4 でアデノ随伴ウイルス タイプ 1 (AAV1) (4 x 1011ウイルス粒子/μ AAV1) の目的のターゲ?...

<ol>
	<li>Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+axo-dendritic+synapses+in+the+hippocampal+cortex:+electron+and+light+microscopic+studies+on+the+layer+of+mossy+fibers.">Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers.</a> Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).</li><li>Hamlyn, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+the+mossy+fibre+endings+in+the+hippocampus+of+the+rabbit.">The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit.</a> Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).</li><li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).</li><li>Rollenhagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+transmission+at+large+hippocampal+mossy+fiber+synapses.">Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses.</a> Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+basic+protein+cleaves+cell+adhesion+molecule+L1+and+promotes+neuritogenesis+and+cell+survival.">Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Basic+Protein+Cleaves+Cell+Adhesion+Molecule+L1+and+Improves+Regeneration+After+Injury.">Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury.</a> Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).</li><li>Kraus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fragment+of+Adhesion+Molecule+L1+Binds+to+Nuclear+Receptors+to+Regulate+Synaptic+Plasticity+and+Motor+Coordination.">A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination.</a> Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferenzph&#228;nomene+am+osmierten+Pr&#228;parat+f&#252;r+die+systematische+elektronenmikroskopische+Untersuchung.">Interferenzph&#228;nomene am osmierten Pr&#228;parat f&#252;r die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung.</a> Mikroskopie. 30, 139 (1974).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+phenomenon+on+somium+tetroxide-fixed+specimens+for+systematic+electron+microscopy.">Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy.</a> Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Methods+for+Characterization+of+Brain+Regions.">General Methods for Characterization of Brain Regions.</a> Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).</li><li>Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+neural+tissues+or+electron+microscopy+by+perfusion+with+solutions+of+osmium+tetroxide.">Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide.</a> Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).</li><li>Webster, H. F., Collins, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+osmium+tetroxide+and+glutaraldehyde+perfusion+fixation+for+the+electron+microscopic+study+on+the+normal+rat+peripheral+nervous+system.">Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).</li><li>Andres, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zur+Methodik+der+Perfusionsfixierung+des+Zentralnervensystems+von+S&#228;ugern.">Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von S&#228;ugern.</a> Mikroskopie. 21, 169 (1967).</li><li>Forssmann, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+par+perfusion+pour+la+microscopie+&#233;lectronique.+Essai.+De+g&#233;n&#233;ralisation.">Fixation par perfusion pour la microscopie &#233;lectronique. Essai. De g&#233;n&#233;ralisation.</a> Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).</li><li>Descarries, L., Schr&#246;der, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+du+tissue+nerveux+par+perfusion+&#224;+grand+debit.">Fixation du tissue nerveux par perfusion &#224; grand debit.</a> Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).</li><li>Langford, L. A., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+potassium+ferricyanide+in+neural+fixation.">The use of potassium ferricyanide in neural fixation.</a> Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calretinin-positive+L5a+pyramidal+neurons+in+the+development+of+the+paralemniscal+pathway+in+the+barrel+cortex.">Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex.</a> Molecular Brain. 7, 84 (2014).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilins+regulate+synaptic+plasticity+and+mitochondrial+calcium+homeostasis+in+the+hippocampal+mossy+fiber+pathway.">Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway.</a> Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li><li>Nishiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+and+regulated+gene+expression+in+murine+Purkinje+cells+by+in+utero+electroporation.">Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation.</a> European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).</li><li>Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORalpha+regulates+multiple+aspects+of+dendrite+development+in+cerebellar+purkinje+cells+in+vivo.">RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).</li></ol>

子宮内での情報伝達の重要なステップは、注入の手順です。脳室または興味の別の領域に精密成形には、経験と実践的なスキルが必要です。シンナーのマイクロキャピ ラリー チップ以下の組織の損傷が発生します。しかし、これは射出圧力の増加を犠牲にしては。子宮内でエレクトロポレーション19,20,21,<sup class=...

光子は、電子の深さのグレードで極薄の組織標本を貫通できます。これはナノメートル微細構造の光学顕微鏡技術と比較した場合の解像度の画像をキャプチャで TEM に貴重な利点を属性します。たとえば、TEM は、分泌顆粒、微小管、フィラメント、繊毛、絨毛上皮 (細胞表面の様々 なタイプ、メラノソーム、ミトコンドリアなどの細胞内オルガネラの可視化特殊化)、特に神経系1,2,3,4シナプスします。本方法論研究の全体的な目標です神経可塑性変化の微細構造認識出生前干渉時に開発時に子宮内での伝達と TEM の最新の技術を組み合わせることによって興味のバイラル符号化された蛋白質は、中枢神経系5,6、7、6脊髄などに子宮内で導入されています。例えば、子宮内で伝達電子顕微鏡との組み合わせでは細胞接着分子 L1 の運動 L1 と核内受容体タンパク質間の相互作用に関して、特に L1 欠損マウスにおける可塑性を学習に及ぼす影響を研究するため使用されています小脳ニューロン7。
神経可塑性パラメーターの解析には、中枢神経系内の最小領域の局在に関する正確な情報が必要です。したがって、微細構造の詳細とその他の構造についての正確な地形向きについて説明するのには十分です。本研究では光と電子顕微鏡観察に基づく明瞭な形態の区域の詳しい調査を目指して特定の準備メソッドが表示されます。このアプローチは、組織操作、マウスの脳および脊髄の子宮内での伝達から始まる、および灌流固定後のいくつかのテクニックを組み合わせた金型埋め込むと TEM の組織を処理します。埋め込みと TEM のティッシュの処理の間に含まれている重要なステップはの microphotographic と低倍率の正確なドキュメントは、干渉光の反射法による組織のドキュメント組織標本8,9,10。本手法により、神経組織表面と TEM の準備の前に供試体スライス プロファイルの地形と構造の詳細を検討する研究手法に組み込まれ、.
頭脳全体の区分のための特別なフレームは、定位座標に対応します。このフレームは神経組織の区域の形態の三次元 (3 D) 再構成を利点し、形態分析に使用することができます。可視化のセクションの macrographs が地形座標を割り当てられ、連番付きのセクション組織アトラスのマップを構築します。
樹脂加工後で超薄切片に埋め込まれた組織の断面 (< 70 nm) 上記組織アトラスの地図によると、選択したエリアを含んでいます。その内容と連絡先団地内近隣構造物への塑性パラメーター (例えば、シナプス ボタンまたは軸索線維のプロファイル領域を断面するなど) の高解像度の画像を取得する TEM を超薄切片を受けます神経網。
記載の方法で可視化破面観察からマイクロ構造およびナノ構造への滑らかな移行は以後の子宮内開発の神経形態学的神経可塑性の詳細な比較を許可します。システム。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="968">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol</td>
			<td style="width:167px;">Serva</td>
			<td style="width:123px;">36975</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">26Gx 1&#39;&#39; needle</td>
			<td style="width:167px;">Henke-Sass, Wolf GmbH</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td>410 Anaesthesia Unit for air pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8323102</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="414">
			<td>Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)</td>
			<td>UKE (Viral Core Facility)</td>
			<td>-</td>
			<td>For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A9414</td>
			<td style="width:423px;">low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Air Pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">Eheim 100</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Araldite</td>
			<td style="width:167px;">CIBA-GEIGY</td>
			<td style="width:123px;">23857.9</td>
			<td style="width:423px;">resin for embedding of tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">aspirator tune assemblies</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:167px;">Temgesic</td>
			<td style="width:123px;">ampules</td>
			<td style="width:423px;">painkiller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">capillaries</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">GB100TF-10</td>
			<td style="width:423px;">with fillament</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">44160</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">11203-23</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">electric shaver</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)</td>
			<td style="width:167px;">Ethicon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">polyamide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:167px;">Bepanthene</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:257px;">Fast Green</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7252</td>
			<td style="width:423px;">for visualization of injected liquids</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:257px;">Gas Routing Switch 4/2 connectors</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8433020</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="132">
			<td height="132" style="height:132px;width:257px;">halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13011-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:257px;">Heparin-Natrium</td>
			<td style="width:167px;">Ratiopharm</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">25 000 I.E./5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Induction box for mice 
			with horizontally moving lid. 
			Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. 
			Wall thickness: 6 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris forceps (10cm, curved, serrated)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14007-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14501-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm 
			Outer dimensions: 257x110x18 mm. 
			Heating area: 190x90 mm 
			The removal of the isoflurane escaping 
			the breathing mask is downwards in compliance with the 
			regulations</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">isoflurane (Attane)</td>
			<td style="width:167px;">JD medical</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">inhalation anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">LED RGB lights</td>
			<td style="width:167px;">Cameo</td>
			<td style="width:123px;">CLQS15RGBW</td>
			<td style="width:423px;">LEDs 2 x 15 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Light microscope Basic DM E</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">4x (N.A. 0.1 &#8734;/-), 10x (N.A. 0.22 &#8734;/0.17), 40x (N.A. 0.65 &#8734;/0.17), 100x (N.A. 1.25 &#8734;/0.17) objectives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">micropipette puller</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">P-97</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13010-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Nickel grids, 200 mesh</td>
			<td style="width:167px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">1GC200</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Osmium (VIII)-oxid</td>
			<td style="width:167px;">Degussa</td>
			<td style="width:123px;">73219</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Propylene oxide</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">82320</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">razor blades</td>
			<td style="width:167px;">Schick</td>
			<td style="width:123px;">87-10489</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Sodium pentobarbital (Narcoren)</td>
			<td style="width:167px;">Merial GmbH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Technovit 4004 two components glue</td>
			<td style="width:167px;">Kulzer</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">Telemacrodevice</td>
			<td style="width:167px;">Canon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Thermopuller P-97</td>
			<td style="width:167px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">thin vibrating razor blade device</td>
			<td style="width:167px;">Krup</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">with Szabo thin blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">toluidine blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">89640</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Transmission electron microscope C20</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">up to 200 kV</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:257px;">Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts 
			Outer diameter: 6mm 
			Inner diameter: 4mm 
			Wa 
			ll thickness: 1mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ultracut E</td>
			<td style="width:167px;">Reichert-Jung</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Univentor Scavenger</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8338001</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Vannas scissors (8 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">15009-08</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord

本研究は興味の蛋白質によって影響される、明確に識別された地形構造の微細構造パラメーターの正確な寡を目指して透過型電子顕微鏡 (TEM) で子宮内で伝達を組み合わせたウイルスの転送を介して生物に導入されます。この手法により、細孔から微細構造同定へのスムーズな移行のため組織アトラスの次の地形のナビゲーション マップ。子宮導入組織の高分解能電子顕微鏡、神経とその可塑性パラメーター、断面のシナプスブートン エリア、シナプス小胞内のミトコンドリア数などの細かい微細構造を明らかにする、ブートン プロファイル、シナプス、断面の軸索地域、ミエリン鞘の太さ、髄鞘層板の数とミトコンドリア プロファイルの断面領域の長さ。これらのパラメーターの解析では、神経系の遺伝的構造のウイルスの伝達によって影響を受けるエリアの微細構造可塑性の変化に重要な洞察力を明らかにします。これらの併用のみ神経可塑性に遺伝子組み換えの生体分子や薬剤の直接影響を研究するため使用しないことができますが、また (のコンテキストでは例えば、神経可塑性の子宮内で救助を勉強する可能性を開きます神経変性疾患)。

マウスの信頼性と高速麻酔の安全な多数のパラメーターが考慮されたと麻酔ユニットの最適化されたワークスペースが十分な (図 1A) をあることを証明しました。単位は、マウスやラットなどの小動物の手術の成功に必要な精度で液体イソフルランと周囲の空気の混合を制御するために設計されています。空気とイソフルランは目的?...

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Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

子宮内開発のマウスの脳および脊髄の伝達の後の微細構造神経可塑性パラメーターの評価

透過型電子顕微鏡と子宮内で伝達の組み合わせは、開発中に神経系の細かい微細構造の形態学的変化を研究するための強力なアプローチです。これらの併用は、神経可塑性の地形表現に関しての基になる構造の詳細の変更への深い洞察をことができます。

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

我々の組み合わせアプローチは、子宮内の新生神経系への早期発達介入後に超構造的神経可塑性パラメータがどのように変化するかを答えるのに役立つ。我々の方法の主な利点は、組織アトラス内の定義済み座標系におけるマクロメソマイクロおよびナノ構造体の高解像度画像の取得である。我々の方法の意味は、先天性神経変性疾患の翻訳治療の可能性である。例えば、子宮導入技術でこれを用いた胚期における治療および救助。この方法は他のモデルに適用できます。例えば、マウスの種は、同様に、関心のある領域を変更することができます。私たちの方法を初めて試す研究者は、深遠な外科訓練だけでなく、電子顕微鏡イメージングのための組織を準備する方法の知識が必要です。目的の標的に対してアデノ関連ウイルス1型1コーティングの11個のウイルス粒子に4回10を含むカスタマイズされた毛細管先端をロードし、吸引管に高速グリーン染料で標識することから始めます。標識されたアデノ関連ウイルス粒子の15マイクロリットルを毛細血管に加える。次に、麻酔下の胚性マウス14.5日目のつまみつまみへの応答の欠如を確認し、皮膚を消毒する。湾曲した鋸歯状の虹彩鉗子とまっすぐな炭化物はさみを使用して、リアナ・メナーマに沿って皮膚切開を行います。まっすぐなデュモンピンセットを使用して腹壁をつかみ、まっすぐなヴァンナハサミでリニアアルバに沿って続け、腹部の開口部の上にフェネレートされたパラフィンフィルムの一部を置き、角の中の胚を損傷することなく、子宮ホーンを露出させるためにスプーンのような装置を使用します。子宮の角に37°C PBSの数滴を適用した後、子宮嚢内の損傷または奇形がないか胚を検査する。各注射の所望の位置が達成されるまで、胚を嚢の中に慎重に回します。胚が所定の位置にある場合は、各胚にファーストグリーン標識ウイルス粒子溶液の1〜2マイクロリットルを注入する。すべての胚が注入された後、子宮の角を腹腔に戻し、腹部に37°CPBSの数滴を加える。その後、ポリアミド6-0サイズの縫合糸を使用して腹膜壁とポリアミド3-0サイズの縫合糸とハルステッドのモスキートヘモスタティック鉗子を閉じて皮膚を閉じます。テレマクロ撮影に関心のある孤立した組織を埋め込むには、組織サンプルを再現可能な断面角度を持つ特別なフレームに入れ、座標を文書化します。組織が覆われるまで30°C3%アガロースでフレームを充填し、アガロースが硬化するまでプラスチック製の蓋でフレームを覆います。アガロースが硬化している間、フレーム内の埋め込まれた組織とその座標を画像化するためにテレマクログラフィックデバイスを使用します。アガロースが固まったら、第1フレームの座標に対応する切断隙を有して、アガロース埋め込まれた組織をフレームに移す。薄く振動カミソリの刃を備えた装置を使用して、埋め込まれた組織を適切な実験の厚さのセクションに切断します。次に、PBSの各組織セクションを画像化し、画像をフォルダに集めます。透過電子顕微鏡用の組織サンプルを調製するために、バイオセーフティキャビネットで、PBSで2回の30分間の洗浄で組織切片を洗浄し、続いて2%水性四酸化オスミウム溶液を室温で2時間培養します。インキュベーションの終わりに、PBSでさらに2回、洗浄につき30分間、浸透したセクションを洗浄し、示されているように10〜15分間の連続したエタノール浸漬でセクションを脱水します。70%エタノール浸漬後、各サンプルを黒い黒い背景に黒い皿に入れ、45度の角度で左右の側面からサンプルに適用されるLED RGB光の下で70%エタノールで標本をイメージします。フォルダー内のシリーズのサンプルの画像を収集することにより座標を使用してセクション画像の地図帳を作成します。2つの30分100%エタノールインキュベーションで試料を処理し、続いて室温で2つの30分100%プロピレンオキシドインキュベーションを行います。サンプルがインキュベートされている間、1対1および1対2の比率でプロピレンオキシドと作りたての樹脂を混合し、両方の溶液に3%の加速剤を加えます。第2のプロピレンオキシドインキュベーション後、試料を室温で2時間、1対1の樹脂プロピレンオキシド埋め込み液溶液中に2時間インキュベーションして、室温で1対2の樹脂プロピレンオキシド埋め込み培地溶液に移します。2回目のインキュベーションの終わりに、組織を平らなポリプロピレン皿に移し、65〜85°Cで12〜24時間3%の加速器を含む新鮮な樹脂で埋め込まれた組織を治す。その後、組織を室温まで冷却し、ポリプロピレン製の皿から樹脂埋め込み標本を取り除きます。対象領域をマップするには、以前に準備した画像アトラスから対象領域を含む画像を選択します。断面化された画像に対象領域の境界をスケッチし、これらの境界を顕微鏡下の埋め込み標本に光学的に重ね合わせ、1インチ26ゲージ針を使用してこれらの領域の境界を樹脂標本に傷つけます。その後、樹脂を軟化させるために、試料を95°Cに加熱します。次に、オーブンから暖かい樹脂の標本を取り出し、カミソリの刃を使用して対象領域を切除します。適切な口径のアクリルガラス保持バーに標本を接着し、半および超薄い切断のために取り付けられた標本をトリミングします。超マイクロトームを使用して、半薄型0.7マイクロメートルと超薄型70ナノメートルのセクションを取得し、ガラスキャリアの半薄いセクションとニッケルグリッドの超薄いセクションを収集します。PBSで1%トルイジンブルーの半薄いセクションを4分間染色し、続いて脱イオン水で数回の水を流し、軽い顕微鏡でセクションを調べる。超薄型断面は、さらに変更することなく、180キロボルトの透過電子顕微鏡検査によって直接評価することができます。断面化後、ティッシュスライスは、ちょうど実証したように、テレマクロ写真によって画像化されます。浸透およびエタノール浸漬後、各セクションは干渉光テレマクログラフィーによって再び画像化され、各組織表面に特異的に着色されたパターンを明らかにする。追加の脱水および樹脂埋め込み後、対象領域を選択し、さらに透過電子顕微鏡のために処理される。海馬や小脳では、苔むした繊維シナプスは、シナプス前の大型ブトンを含む他のシナプスと比較してユニークな超構造的特性を示すことが知られている。彼らの断面プロファイルでは、ブトンは膨大な数の小胞とミトコンドリアを含み、非常に頻繁にいくつかの樹状脊椎を囲みます。脊髄では、背骨の真菌は、オリゴデンドロリアによってミリン化される多くの軸索繊維を含む。横切り部では、脊髄の後角の両方の間に後部真菌が見られる。透過型電子顕微鏡画像では、断面化されたミエリン軸索が丸く現れ、軸索を取り巻くミエリン鞘はラメラに組織化されています。調製されたアトラスと超構造パラメータの顕微鏡顕微鏡画像は、様々な治療条件下での異なるセクションの形態学的神経可塑性の比較だけでなく、同じ領域内のパラメータ間の比較にも有用である。子宮内の導入を開始する前に徹底的に計画し、準備し、合併症の場合には材料や器具のバックアップを持っていることを確認することを忘れないでください。我々の方法に従って、他の技術は、対象となる定義された分子の超構造トレースのための電子顕微鏡の前に免疫金標識のような追加することができる。生物全体の全体的な視点から始まり、分子地形に向かってズームインし、組織機能と形態の関係を研究し、操作することができます。四酸化オスミウムは危険です。常にボンネットの下で作業し、この試薬で作業するときは保護メガネと手手袋を着用してください。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

子宮外エレクトロポレーションおよびマウスの海馬組織の器官型スライス培養

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

成体ラットおよびヒト脊髄の脳室周囲領域から神経幹/前駆細胞の単離

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

遺伝子発現に影響を​​及ぼすシグナル伝達経路を同定するために、ニワトリ胚手足の開発にビーズのグラフト

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

マウス子宮内妊娠中の母体の血管リモデリングの評価

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;腎臓

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

郭清とコロナのスライス標本マウス下垂体腺の開発

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

マウス モデルにおける静脈内投与と胎嚢内子宮内移植

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

5-メチルシトシンと開発の 5-ヒドロキシメチルシトシンの免疫組織化学的検出と後マウス網膜

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

発展途上ひよこ視蓋接線細胞移動の可視化

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...