Name: assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord
Uploaded: 2019-02-26T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord at JoVE.com

저자는 그들의 지원 및 동물 관리에 대 한 의료 학부, Ruhr 대학 보 훔에 동물 시설의 동료를 감사합니다.

동물 주제에 모든 절차는 함부르크와 노르 트 베스트 팔 렌, 독일의 연방 국가의 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다.  사용 하 여 살 균 기기, 보호 장갑 및 전체 수술을 통해 무 균 코트.
1.에 Utero 변환
<ol><li>PH 7.4에 인산 염 버퍼 염 (PBS)에 원하는 대상 (4 x 1011 바이러스 성 입자 / µ L AAV1의)에 대 한 코딩 adeno 관련 바이러스 타입 1 (AAV1)를 준비 합니다. 빠?...

<ol>
	<li>Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+axo-dendritic+synapses+in+the+hippocampal+cortex:+electron+and+light+microscopic+studies+on+the+layer+of+mossy+fibers.">Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers.</a> Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).</li><li>Hamlyn, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+the+mossy+fibre+endings+in+the+hippocampus+of+the+rabbit.">The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit.</a> Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).</li><li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).</li><li>Rollenhagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+transmission+at+large+hippocampal+mossy+fiber+synapses.">Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses.</a> Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+basic+protein+cleaves+cell+adhesion+molecule+L1+and+promotes+neuritogenesis+and+cell+survival.">Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Basic+Protein+Cleaves+Cell+Adhesion+Molecule+L1+and+Improves+Regeneration+After+Injury.">Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury.</a> Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).</li><li>Kraus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fragment+of+Adhesion+Molecule+L1+Binds+to+Nuclear+Receptors+to+Regulate+Synaptic+Plasticity+and+Motor+Coordination.">A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination.</a> Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferenzph&#228;nomene+am+osmierten+Pr&#228;parat+f&#252;r+die+systematische+elektronenmikroskopische+Untersuchung.">Interferenzph&#228;nomene am osmierten Pr&#228;parat f&#252;r die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung.</a> Mikroskopie. 30, 139 (1974).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+phenomenon+on+somium+tetroxide-fixed+specimens+for+systematic+electron+microscopy.">Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy.</a> Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Methods+for+Characterization+of+Brain+Regions.">General Methods for Characterization of Brain Regions.</a> Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).</li><li>Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+neural+tissues+or+electron+microscopy+by+perfusion+with+solutions+of+osmium+tetroxide.">Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide.</a> Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).</li><li>Webster, H. F., Collins, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+osmium+tetroxide+and+glutaraldehyde+perfusion+fixation+for+the+electron+microscopic+study+on+the+normal+rat+peripheral+nervous+system.">Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).</li><li>Andres, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zur+Methodik+der+Perfusionsfixierung+des+Zentralnervensystems+von+S&#228;ugern.">Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von S&#228;ugern.</a> Mikroskopie. 21, 169 (1967).</li><li>Forssmann, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+par+perfusion+pour+la+microscopie+&#233;lectronique.+Essai.+De+g&#233;n&#233;ralisation.">Fixation par perfusion pour la microscopie &#233;lectronique. Essai. De g&#233;n&#233;ralisation.</a> Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).</li><li>Descarries, L., Schr&#246;der, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+du+tissue+nerveux+par+perfusion+&#224;+grand+debit.">Fixation du tissue nerveux par perfusion &#224; grand debit.</a> Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).</li><li>Langford, L. A., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+potassium+ferricyanide+in+neural+fixation.">The use of potassium ferricyanide in neural fixation.</a> Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calretinin-positive+L5a+pyramidal+neurons+in+the+development+of+the+paralemniscal+pathway+in+the+barrel+cortex.">Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex.</a> Molecular Brain. 7, 84 (2014).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilins+regulate+synaptic+plasticity+and+mitochondrial+calcium+homeostasis+in+the+hippocampal+mossy+fiber+pathway.">Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway.</a> Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li><li>Nishiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+and+regulated+gene+expression+in+murine+Purkinje+cells+by+in+utero+electroporation.">Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation.</a> European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).</li><li>Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORalpha+regulates+multiple+aspects+of+dendrite+development+in+cerebellar+purkinje+cells+in+vivo.">RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).</li></ol>

Utero에서 변환의 중요 한 단계는 주입. 정확한 주입 뇌 심 또는 관심의 다른 영역으로 경험 및 실습 기술 필요합니다. 얇은 microcapillary 팁, 덜 조직 손상이 발생할 수 있습니다; 그러나,이 사출 압력을 증가 하는 비용입니다. Utero electroporation19,20,,2122, 달리 utero에서 변환 후 삽입 된 배아의 생존 율은 아?...

아니 광자는 전자의 깊이 학년에서 ultrathin 조직 표본을 침투 수 있습니다. 이 가벼운 현미경 검사 법 기술에 비해 미세 구조의 나노미터 해상도 이미지를 캡처에 가장 귀중 한 장점을 특성. 예를 들어 가장 미토 콘 드리 아, melanosomes, 등 다양 일 분 비과 립, microtubules, microfilaments, 섬 모, microvilli, 및 세포 접합 (세포 표면 세포내 세포의 시각화 수 있습니다. 전문화), 특히 신 경계1,2,,34synapses. 현재 방법론 연구의 전반적인 목표는 utero에서 변환의 가장 최신의 기술을 결합 하 여 태아 간섭에 따라 개발 하는 동안 신경가 소성에 변화의 ultrastructural 인식 이다. 관심의 virally 인코딩된 단백질 중앙 신 경계5,6,7,6척수 포함 하 여에 utero에서 불리고 되어 있다. 예를 들어, 함께 가장 utero에서 변환 사용 되었습니다 L1 및 핵 수용 체 단백질 사이 상호 작용에 관해서는 특히 L1 불충분 한 쥐에서 소성을 학습 하는 모터에 세포 접착 분자 L1의 효과 공부 하 고 소 뇌 신경7에서.
Neuroplasticity 매개 변수 분석 신 경계 내의 작은 지역의 지역화에 대 한 정확한 정보가 필요합니다. 따라서, 그것은 ultrastructural 세부 사항 및 다른 구조에 관하여 그들의 정확한 지형 방향을 설명 하기 위해 적절 한입니다. 현재 연구에서 특정 준비 방법 빛과 전자 현미경 검사 법에 따라 다른 형태학 분야의 상세한 조사에 제공 됩니다. 이 이렇게 결합 조직 조작, 마우스 뇌와 척수의 utero에 변환 시작 하 고 관류 고정, 다음의 몇 가지 기술을 몰드-포함, 그리고 가장에 대 한 처리 하는 조직. 포함 및 가장에 대 한 조직의 처리 사이 포함 하는 필수적인 단계는의 정확한 microphotographic 및 낮은 확대 설명서에 대 한 허용 간섭 빛 반사 기술을 사용 하 여 조직의 설명서 조직 표본8,,910. 현재 접근에 통합,이 기술은 신경 조직 표면 및 가장에 대 한 그들의 준비에 앞서 표본 조각 프로필의 지형 및 구조 정보를 검토 하는 연구를 수 있습니다.
전체 두뇌를 단면에 대 한 특별 한 프레임 stereotaxic 좌표에 해당 합니다. 이 프레임과 신경 조직에서 영역의 형태 3 차원 (3D) 재건 혜택 형태학 분석에 사용할 수 있습니다. 시각화 된 섹션의 macrographs 지형 좌표를 할당 빌드하고를 순차적으로 번호가 매겨진된 섹션 조직 아틀라스에 지도.
수 지 처리, 후 포함 된 조직 ultrathin 섹션으로 구분 됩니다 (< 70 nm) 위에서 언급 한 조직 아틀라스의 지도 따라 선택된 영역을 포함. 그들의 내용의 및 단지 내에 인접 구조에 연락처의 소성 매개 변수 (예: 횡단면 프로필 영역 시 냅 스 boutons 또는 axonal 섬유)의 고해상도 이미지를 얻기 위해 가장 ultrathin 섹션 대상이 됩니다. neuropil입니다.
여기에 설명 된 방법으로 마이크로-그리고 nanostructures 시각화 된 macrostructures에서 부드러운 전환 utero에서 변환 개발의 긴장 후 형태학 신경가 소성의 비교 심층 연구를 허용 시스템입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="968">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol</td>
			<td style="width:167px;">Serva</td>
			<td style="width:123px;">36975</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">26Gx 1&#39;&#39; needle</td>
			<td style="width:167px;">Henke-Sass, Wolf GmbH</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td>410 Anaesthesia Unit for air pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8323102</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="414">
			<td>Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)</td>
			<td>UKE (Viral Core Facility)</td>
			<td>-</td>
			<td>For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A9414</td>
			<td style="width:423px;">low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Air Pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">Eheim 100</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Araldite</td>
			<td style="width:167px;">CIBA-GEIGY</td>
			<td style="width:123px;">23857.9</td>
			<td style="width:423px;">resin for embedding of tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">aspirator tune assemblies</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:167px;">Temgesic</td>
			<td style="width:123px;">ampules</td>
			<td style="width:423px;">painkiller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">capillaries</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">GB100TF-10</td>
			<td style="width:423px;">with fillament</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">44160</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">11203-23</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">electric shaver</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)</td>
			<td style="width:167px;">Ethicon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">polyamide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:167px;">Bepanthene</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:257px;">Fast Green</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7252</td>
			<td style="width:423px;">for visualization of injected liquids</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:257px;">Gas Routing Switch 4/2 connectors</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8433020</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="132">
			<td height="132" style="height:132px;width:257px;">halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13011-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:257px;">Heparin-Natrium</td>
			<td style="width:167px;">Ratiopharm</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">25 000 I.E./5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Induction box for mice 
			with horizontally moving lid. 
			Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. 
			Wall thickness: 6 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris forceps (10cm, curved, serrated)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14007-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14501-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm 
			Outer dimensions: 257x110x18 mm. 
			Heating area: 190x90 mm 
			The removal of the isoflurane escaping 
			the breathing mask is downwards in compliance with the 
			regulations</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">isoflurane (Attane)</td>
			<td style="width:167px;">JD medical</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">inhalation anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">LED RGB lights</td>
			<td style="width:167px;">Cameo</td>
			<td style="width:123px;">CLQS15RGBW</td>
			<td style="width:423px;">LEDs 2 x 15 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Light microscope Basic DM E</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">4x (N.A. 0.1 &#8734;/-), 10x (N.A. 0.22 &#8734;/0.17), 40x (N.A. 0.65 &#8734;/0.17), 100x (N.A. 1.25 &#8734;/0.17) objectives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">micropipette puller</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">P-97</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13010-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Nickel grids, 200 mesh</td>
			<td style="width:167px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">1GC200</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Osmium (VIII)-oxid</td>
			<td style="width:167px;">Degussa</td>
			<td style="width:123px;">73219</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Propylene oxide</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">82320</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">razor blades</td>
			<td style="width:167px;">Schick</td>
			<td style="width:123px;">87-10489</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Sodium pentobarbital (Narcoren)</td>
			<td style="width:167px;">Merial GmbH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Technovit 4004 two components glue</td>
			<td style="width:167px;">Kulzer</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">Telemacrodevice</td>
			<td style="width:167px;">Canon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Thermopuller P-97</td>
			<td style="width:167px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">thin vibrating razor blade device</td>
			<td style="width:167px;">Krup</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">with Szabo thin blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">toluidine blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">89640</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Transmission electron microscope C20</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">up to 200 kV</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:257px;">Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts 
			Outer diameter: 6mm 
			Inner diameter: 4mm 
			Wa 
			ll thickness: 1mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ultracut E</td>
			<td style="width:167px;">Reichert-Jung</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Univentor Scavenger</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8338001</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Vannas scissors (8 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">15009-08</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord

현재 연구 관심사의 단백질에 의해 영향을 명확 하 게 확인 된 지형 구조에서 ultrastructural 매개 변수는 정확한 morphometrical 분석에 utero 변환 전송 전자 현미경 (TEM)와 결합 그 바이러스 전송을 통해 유기 체에 도입 되었습니다. 이 결합 된 접근 다음 지형 탐색 지도 조직 아틀라스에서 ultrastructural 식별 macrostructural에서 부드러운 전환에 대 한 수 있습니다. 에-utero-불리고 조직의 고해상도 전자 현미경 계시는 neuropil와 소성 매개 변수, cross-sectioned 시 냅 시스 bouton 지역, 시 냅 스 소포 내 미토 콘 드리 아의 수의 좋은 열 대권 외는 bouton 프로필, 시 냅 스 연락처, cross-sectioned axonal, 수 초 두께, myelin lamellae 수 및 미토 콘 드리 아 프로필의 cross-sectioned 분야의 길이. 이러한 매개 변수의 분석 유전자 구성의 바이러스 성 전송에 의해 영향을 받는 신경 영역에 ultrastructural가 소성의 변화에 대 한 필수적인 통찰력을 보여준다. 이 결합 된 방법만 사용할 수 없는 신경가 소성에 유전자 조작된 생체 약물의 직접 효과 공부 하지만 또한 가능성 (예를 들어, 컨텍스트에서 신경가 소성의 utero 구조 연구 신경 퇴행 성 질병)입니다.

쥐의 안정적이 고 빠른 마 취에 대 한 수많은 안전 매개 변수 고려 되었다, 하 고 마 취 단위의 최적화 된 작업 영역 적절 한 (그림 1A)으로 판명. 단위는 쥐와 쥐와 같은 작은 동물에 성공적인 수술에 필요한 정밀 액체 isoflurane 및 주위 공기의 혼합을 제어 하도록 설계 되었습니다. 공기와 isoflurane 원하는 설정에 따라 기화 기에 혼합 하 고 ?...

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Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

평가의 개발 쥐의 뇌와 척수의 Utero 변환 후 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수

전송 전자 현미경 검사 법 및 utero에서 변환의 조합을 개발 하는 동안 신경 시스템의 정밀한 열 대권 외의 형태학 적 변화를 공부에 대 한 강력한 접근 이다. 이 결합 된 메서드는 그들의 지형 표현에 관하여 neuroplasticity 기본 구조 세부 사항에 변화에 대 한 깊은 통찰력을 수 있습니다.

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

우리의 결합된 접근은 자궁에 있는 초기 신경계에 초기 발달 내정간섭 후에 초구조신경 가소성 매개변수가 어떻게 변화하는지 대답하는 것을 돕습니다. 우리 방법의 주요 장점은 조직 아틀라스 내의 미리 정의 된 좌표 시스템에서 매크로 메소 마이크로 및 나노 구조의 고해상도 이미지를 획득하는 것입니다. 우리의 방법의 의미는 선천성 신경 퇴행성 질환에 대한 번역 치료 잠재력입니다.예를 들어, 자궁 경색 기법에서 이를 사용하여 배아 단계에서 치료 및 구조. 우리의 방법은 다른 모델에 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 마우스 종은 관심 영역뿐만 아니라 변경할 수 있습니다.처음으로 우리의 방법을 시도하는 연구원은 전자 현미경 화상 진찰을 위한 조직을 준비하는 방법의 지식뿐만 아니라 심오한 외과 훈련이 필요합니다. 먼저 원하는 표적을 위해 아데노 관련 바이러스 유형 1 코팅의 11가지 바이러스 입자에 4회 10번 을 포함하는 맞춤형 모세관 팁을 적재하고, 패스트 그린 염료로 흡착튜브에 부착한다. 라벨이 부착된 아데노 관련 바이러스 입자의 15마이크로리터를 모세관에 추가합니다.다음으로, 마취배아의 날 14.5 임신 마우스에서 발가락 꼬집어에 대한 반응의 부족을 확인하고, 피부를 소독한다. 곡선 된 세상 홍채 집게와 직선 텅스텐 초경 가위를 사용하여 리나 중앙 값을 따라 피부 절개를합니다. 직선 두몬트 핀셋을 사용하여 복막 벽을 잡고, 직선 반나스 가위와 라인나 알바를 따라 계속하고 복부 개구부 위에 회귀 파라핀 필름의 조각을 배치하고 뿔 내부의 배아를 손상시키지 않고 자궁 뿔을 노출하는 숟가락 같은 장치를 사용합니다.자궁 경적에 섭씨 37도 PBS를 몇 방울 떨어 뜨린 후 자궁 낭 내부의 손상이나 기형에 대한 배아를 검사합니다. 각 주사에 대해 원하는 위치가 달성 될 때까지 배아를 주머니 안쪽에 주의 깊게 돌립니다. 배아가 제자리에 있을 때, 각 태아에 Fast Green 표지된 바이러스 입자 용액의 1~2개의 마이크로리터를 주입하십시오.모든 배아가 주입된 후 자궁 뿔을 복강으로 다시 배치하고 37도 섭씨 PBS를 복부에 몇 방울 더 넣습니다. 그런 다음 폴리아미드 6-0 크기의 봉합사를 사용하여 간막 벽과 폴리아미드 3-0 크기의 봉합사 및 Halsted의 모기 혈전성 집게를 닫아 피부를 닫습니다. 텔레 매크로 사진에 대한 관심의 격리 된 조직을 포함하려면, 재현 가능한 단면 각도와 특수 프레임에 조직 샘플을 배치하고 좌표를 문서화.조직이 덮을 때까지 30도 섭씨 3%아가로즈로 프레임을 채우고 아가로즈가 굳어질 때까지 플라스틱 뚜껑으로 프레임을 덮습니다. 아가로즈가 경화되는 동안 텔레 매크로 그래픽 장치를 사용하여 내장된 조직과 프레임 내의 좌표를 이미지합니다. 아가로즈가 고화되면, 아가로즈 임베디드 조직을 첫 번째 프레임의 좌표에 해당하는 절단 갭으로 프레임으로 옮기는다.얇고 진동하는 면도날을 가진 장치를 사용하여 임베디드 조직을 적절한 실험 두께의 섹션으로 자른다. 그런 다음 PBS의 각 조직 섹션을 이미지화하고 이미지를 폴더로 수집합니다. 전염 전자 현미경 검사법을 위한 조직 샘플을 준비하기 위하여는, 생물 안전 캐비닛에서, PBS에 있는 2개의 30 분 세척으로 조직 단면도를 세척하고, 실온에서 2% 수성 osmium tetroxide 용액에 2 시간 인큐베이션에 선행됩니다.인큐베이션이 끝나면 PBS에서 30분 동안 2회 더 세척하고 표시된 대로 순차적으로 10-15분 에탄올 몰입으로 섹션을 탈수합니다. 70%에탄올 침수 후, 각 샘플을 둔한 검은 색 배경에 검은 색 접시에 넣고 45도 각도로 왼쪽과 오른쪽의 샘플에 적용된 LED RGB 빛 아래 의 표본을 70% 에탄올로 이미지합니다. 폴더에서 일련의 샘플 이미지를 수집하여 좌표로 섹션 이미지의 아틀라스를 만듭니다.시편을 30분 100% 에탄올 인큐베이션 2개로 처리하고, 실온에서 30분 100% 프로필렌 산화물 배양 2개를 넣습니다. 시료가 배양되는 동안, 신선하게 준비된 수지와 1대 2 비율로 소실렌 산화물을 혼합하고 두 솔루션모두에 3%의 가속기를 추가합니다. 두 번째 프로필렌 옥사이드 인큐베이션 후, 실온에서 2시간 동안 1-2 수지 프로필렌 옥사이드 방류 매체 용액으로 샘플을 옮기고, 실온에서 1대 1 수지 프로필렌 옥사이드 에 2시간 배양한다.두 번째 인큐베이션이 끝나면 조직을 평평한 폴리프로필렌 접시로 옮기고, 65~85°C에서 12~24시간 동안 3%의 가속기를 함유한 신선한 수지로 내장된 조직을 치료한다. 그런 다음 조직을 실온으로 식히고 폴리 프로필렌 접시에서 수지 임베디드 표본을 제거합니다. 관심 영역을 매핑하려면 이전에 준비된 이미지 아틀라스에서 관심 영역이 포함된 이미지를 선택합니다.관심 영역의 테두리를 단면 된 이미지에 스케치하고, 현미경 아래 임베디드 시편에 이러한 테두리를 광학적으로 중첩시키고, 1 인치 26 게이지 바늘을 사용하여 이러한 영역테두리를 수지 시편에 긁어. 그런 다음 수지의 부드러워지기 위해 표본을 섭씨 95도로 가열합니다. 다음으로, 오븐에서 따뜻한 수지 표본을 꺼내서 면도날을 사용하여 관심 영역을 소비합니다.표본을 적절한 구경의 막대를 들고 있는 아크릴 유리에 접착하고, 반및 초박형 단면에 장착된 시편을 다듬습니다. 초미세토메를 사용하여 반박형 0.7마이크로미터 및 초박형 70나노미터 섹션을 획득하여 유리 캐리어의 반박형 섹션과 니켈 그리드의 초박형 섹션을 수집합니다. PBS에서 1%Toluidine 블루로 반박형 부분을 4분 동안 염색한 다음, 빛 현미경으로 단면을 검사하기 전에 탈이온화된 물에 여러 개의 세설이 뒤따릅니다.초박형 단면은 추가 수정 없이 180킬로볼트에서 전염 전자 현미경 검사법에 의해 직접 평가될 수 있다. 단면 후, 조직 조각은 방금 입증 된 것처럼 텔레 매크로 사진으로 이미지됩니다. 미루와 에탄올 침지 후, 단면도는 간섭 라이트 텔레 맥로그래피에 의해 다시 이미지화되어 각 조직 표면에 대해 특별히 색이 지정된 패턴을 드러냅니다.추가 탈수 및 수지 포함 후, 관심 영역을 선택하고 전송 전자 현미경 검사법을 위해 추가 처리됩니다. 해마와 소뇌에서, 이끼 섬유 시냅스는 큰 사전 시냅스 부폰을 포함하여 다른 시냅스에 비해 독특한 초구조적 특성을 나타내는 것으로 알려져 있습니다. 그들의 단면 단면도에서, boutons는 소포와 미토콘드리아의 광대 한 수를 포함하고, 아주 수시로 몇몇 수지상 척추를 둘러싸는.척수에서 등쪽 푸니큘러스에는 올리고드렌드로글리아가 골수화한 많은 축산 섬유가 들어 있습니다. 대지 섹션에서는 척수의 두 후불 뿔 사이에서 등색 성균을 찾을 수 있습니다. 전송 전자 현미경 이미지에서 단면 된 골수화 축축이 둥글게 나타나고 축을 둘러싼 myelin 칼집이 라멜라에서 구성됩니다.제조된 아틀라스 및 초구조 파라미터의 미세지형 투과 전자 현미경 이미지는 다양한 치료 조건 하에서 상이한 부분의 형태학적 신경가소성의 비교뿐만 아니라 동일한 영역 내의 파라미터 간의 비교에도 도움이 된다. 자궁 에서 자궁 트랜스듀션을 시작하기 전에 철저히 계획하고 준비해야 하며, 합병증이 있을 경우 재료와 계측기의 백업을 해야 합니다. 우리의 방법에 따라, 관심의 정의 된 분자의 초구조 추적을 위한 전자 현미경 검사전에 면역 금 라벨링과 같은 다른 기술을 추가 할 수 있습니다.전체 유기체의 전체론적 보기로 시작하여 분자 지형을 향해 확대, 우리는 연구하고 조직 기능과 형태 사이의 관계를 조작 할 수 있습니다. 오스뮴 테트옥사이드는 위험합니다. 이 시약으로 작업 할 때 항상 후드 아래에서 작동하고 보호 안경과 손 장갑을 착용해야합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

연구

발생학

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

유전자 발현에 영향을 미치는 신호 전달 진학을 확인하기 위해 닭 배아 사지 개발에 구슬의 접목

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

마우스 자궁에서 임신 기간 동안 산모의 혈관 재 평가

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

해 부 및 마우스 뇌 개발의 코로나 슬라이스 준비

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

정 맥 및 양수 내 Utero Murine 모델에 이식

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

5-Methylcytosine 개발에 5-Hydroxymethylcytosine의 Immunohistochemical 검출 및 Postmitotic 마우스 망막

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

개발 병아리 광섬유 Tectum에 접선 셀 이동의 시각화

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...