Name: assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord
Uploaded: 2019-02-26T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord at JoVE.com

Forfatterne takke kolleger av dyr anlegget medisinske fakultetet, Ruhr Universitetet Bochum, for deres støtte og dyr omsorg.

Alle prosedyrer på dyr fag er godkjent av institusjonelle dyreetikk komiteer av delstatene Hamburg og Nordrhein-Westfalen, Tyskland.  Bruk sterilt instrumenter, vernehansker og aseptiske strøk gjennom hele kirurgiske prosedyren.
1. i Utero signaltransduksjon
<ol><li>Forberede adeno-assosiert virus type 1 (AAV1) coding for ønsket mål (4 x 1011 virus partikler/µL av AAV1) i fosfat-bufret saltvann (PBS) ved pH 7.4. Legge til 0,1 mg/µL Fast Green og beholde AAV1-rask-grønne b...

<ol>
	<li>Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+axo-dendritic+synapses+in+the+hippocampal+cortex:+electron+and+light+microscopic+studies+on+the+layer+of+mossy+fibers.">Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers.</a> Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).</li><li>Hamlyn, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+the+mossy+fibre+endings+in+the+hippocampus+of+the+rabbit.">The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit.</a> Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).</li><li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).</li><li>Rollenhagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+transmission+at+large+hippocampal+mossy+fiber+synapses.">Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses.</a> Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+basic+protein+cleaves+cell+adhesion+molecule+L1+and+promotes+neuritogenesis+and+cell+survival.">Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Basic+Protein+Cleaves+Cell+Adhesion+Molecule+L1+and+Improves+Regeneration+After+Injury.">Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury.</a> Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).</li><li>Kraus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fragment+of+Adhesion+Molecule+L1+Binds+to+Nuclear+Receptors+to+Regulate+Synaptic+Plasticity+and+Motor+Coordination.">A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination.</a> Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferenzph&#228;nomene+am+osmierten+Pr&#228;parat+f&#252;r+die+systematische+elektronenmikroskopische+Untersuchung.">Interferenzph&#228;nomene am osmierten Pr&#228;parat f&#252;r die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung.</a> Mikroskopie. 30, 139 (1974).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+phenomenon+on+somium+tetroxide-fixed+specimens+for+systematic+electron+microscopy.">Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy.</a> Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Methods+for+Characterization+of+Brain+Regions.">General Methods for Characterization of Brain Regions.</a> Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).</li><li>Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+neural+tissues+or+electron+microscopy+by+perfusion+with+solutions+of+osmium+tetroxide.">Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide.</a> Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).</li><li>Webster, H. F., Collins, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+osmium+tetroxide+and+glutaraldehyde+perfusion+fixation+for+the+electron+microscopic+study+on+the+normal+rat+peripheral+nervous+system.">Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).</li><li>Andres, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zur+Methodik+der+Perfusionsfixierung+des+Zentralnervensystems+von+S&#228;ugern.">Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von S&#228;ugern.</a> Mikroskopie. 21, 169 (1967).</li><li>Forssmann, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+par+perfusion+pour+la+microscopie+&#233;lectronique.+Essai.+De+g&#233;n&#233;ralisation.">Fixation par perfusion pour la microscopie &#233;lectronique. Essai. De g&#233;n&#233;ralisation.</a> Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).</li><li>Descarries, L., Schr&#246;der, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+du+tissue+nerveux+par+perfusion+&#224;+grand+debit.">Fixation du tissue nerveux par perfusion &#224; grand debit.</a> Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).</li><li>Langford, L. A., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+potassium+ferricyanide+in+neural+fixation.">The use of potassium ferricyanide in neural fixation.</a> Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calretinin-positive+L5a+pyramidal+neurons+in+the+development+of+the+paralemniscal+pathway+in+the+barrel+cortex.">Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex.</a> Molecular Brain. 7, 84 (2014).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilins+regulate+synaptic+plasticity+and+mitochondrial+calcium+homeostasis+in+the+hippocampal+mossy+fiber+pathway.">Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway.</a> Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li><li>Nishiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+and+regulated+gene+expression+in+murine+Purkinje+cells+by+in+utero+electroporation.">Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation.</a> European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).</li><li>Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORalpha+regulates+multiple+aspects+of+dendrite+development+in+cerebellar+purkinje+cells+in+vivo.">RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).</li></ol>

Et avgjørende skritt i i livmoren signaltransduksjon er injeksjon prosedyren. Presis injeksjon i hjernen ventriklene eller et annet område av interesse krever erfaring og praktiske ferdigheter. Det tynnere microcapillary spissen, jo mindre vevsskade kan oppstå; Dette er imidlertid på bekostning av økende injeksjon press. I motsetning til i livmoren electroporation19,20,21,22, overlevelse a...

Ingen Foton kan trenge en supertynn vev prøven i dybden klasse til et elektron. Dette attributtene uvurderlig fordeler til TEM fange nanometer oppløsning av fine strukturer sammenlignet med * lys teknikker. For eksempel tillater TEM visualisering av intracellulær organelles som mitokondrier, melanosomes og ulike typer sekretoriske granulater, piskehale som henger, microfilaments, flimmerhårene, microvilli og intercellulære veikryss (celleoverflaten spesialisering), spesielt synapser i nervesystemet1,2,3,4. Det overordnede målet med metodiske studien er ultrastructural anerkjennelse av endringer i nevrale plastisitet under utvikling på prenatal forstyrrelser ved å kombinere state-of-the-art teknikker i livmoren signaltransduksjon og TEM. Virally kodet proteiner rundt har vært transduced i livmoren i sentralnervesystemet5,6,7, inkludert ryggmarg6. For eksempel har i livmoren signaltransduksjon i kombinasjon med TEM blitt brukt for å studere effekten av celle vedheft molekyl L1 på motoren lære plastisitet i L1-mangelfull mus, spesielt med hensyn til samspillet mellom L1 og kjernefysiske reseptor proteiner i lillehjernen neurons7.
Analyse av neuroplasticity parametere krever presis informasjon om lokalisering av de minste områdene nervesystemet. Derfor er det tilstrekkelig å beskrive ultrastructural detaljer og deres nøyaktige topografiske retning når det gjelder andre strukturer. Studien presenteres en bestemt forberedende metode sikte på detaljert etterforskningen av forskjellige morfologiske områder basert på både lys og elektronmikroskop. Denne tilnærmingen kombinerer flere teknikker av vev manipulasjon, starter med i livmoren Albin på musen hjernen og ryggmarg og etterfulgt av perfusjon fiksering, innebygging av mold og behandling vev for TEM. Et viktig skritt inkludert mellom innebygging og behandling av vevet om TEM er dokumentasjon av vevet, ved hjelp av forstyrrelser lyset refleksjon teknikk som tillater presis microphotographic og lav forstørrelse dokumentasjon av vev prøver8,9,10. Innlemmet i den nåværende tilnærmingen, kan denne teknikken forskere å undersøke topografiske og strukturelle detaljer nervøse vev overflater og prøven skive profiler før sine forberedelser til TEM.
En spesiell ramme snitting hele hjernen tilsvarer stereotaxic koordinater. Denne rammen fordeler morfologiske tredimensjonale (3D) gjenoppbyggingen av områdene i nervøse vev og kan brukes for morphometric analyse. Macrographs av visualisert tilordnes topografiske koordinater, og delene serielt nummererte bygge kartene i en vev atlas.
Etter harpiks behandling, innebygde vev er delt inn i ultrathin deler (< 70 nm) som inneholder merkede områder, ifølge kart over nevnte vev atlas. Supertynn delene er utsatt for TEM å få høyoppløselige bilder av plastisitet parametere (f.eks tverrsnitt profil områder av synaptic boutons eller axonal fiber) innholdet og kontakter til nærliggende strukturer i komplekset neuropil.
Med metoden beskrevet her, tillater den glatte overgangen fra visualisert macrostructures mikro - og nanostrukturer sammenlignende grundige studier av morfologiske neuronal plastisitet etter i utero Albin på utvikle nervøs system.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="968">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol</td>
			<td style="width:167px;">Serva</td>
			<td style="width:123px;">36975</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">26Gx 1&#39;&#39; needle</td>
			<td style="width:167px;">Henke-Sass, Wolf GmbH</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td>410 Anaesthesia Unit for air pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8323102</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="414">
			<td>Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)</td>
			<td>UKE (Viral Core Facility)</td>
			<td>-</td>
			<td>For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A9414</td>
			<td style="width:423px;">low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Air Pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">Eheim 100</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Araldite</td>
			<td style="width:167px;">CIBA-GEIGY</td>
			<td style="width:123px;">23857.9</td>
			<td style="width:423px;">resin for embedding of tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">aspirator tune assemblies</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:167px;">Temgesic</td>
			<td style="width:123px;">ampules</td>
			<td style="width:423px;">painkiller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">capillaries</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">GB100TF-10</td>
			<td style="width:423px;">with fillament</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">44160</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">11203-23</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">electric shaver</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)</td>
			<td style="width:167px;">Ethicon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">polyamide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:167px;">Bepanthene</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:257px;">Fast Green</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7252</td>
			<td style="width:423px;">for visualization of injected liquids</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:257px;">Gas Routing Switch 4/2 connectors</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8433020</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="132">
			<td height="132" style="height:132px;width:257px;">halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13011-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:257px;">Heparin-Natrium</td>
			<td style="width:167px;">Ratiopharm</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">25 000 I.E./5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Induction box for mice 
			with horizontally moving lid. 
			Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. 
			Wall thickness: 6 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris forceps (10cm, curved, serrated)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14007-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14501-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm 
			Outer dimensions: 257x110x18 mm. 
			Heating area: 190x90 mm 
			The removal of the isoflurane escaping 
			the breathing mask is downwards in compliance with the 
			regulations</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">isoflurane (Attane)</td>
			<td style="width:167px;">JD medical</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">inhalation anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">LED RGB lights</td>
			<td style="width:167px;">Cameo</td>
			<td style="width:123px;">CLQS15RGBW</td>
			<td style="width:423px;">LEDs 2 x 15 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Light microscope Basic DM E</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">4x (N.A. 0.1 &#8734;/-), 10x (N.A. 0.22 &#8734;/0.17), 40x (N.A. 0.65 &#8734;/0.17), 100x (N.A. 1.25 &#8734;/0.17) objectives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">micropipette puller</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">P-97</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13010-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Nickel grids, 200 mesh</td>
			<td style="width:167px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">1GC200</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Osmium (VIII)-oxid</td>
			<td style="width:167px;">Degussa</td>
			<td style="width:123px;">73219</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Propylene oxide</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">82320</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">razor blades</td>
			<td style="width:167px;">Schick</td>
			<td style="width:123px;">87-10489</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Sodium pentobarbital (Narcoren)</td>
			<td style="width:167px;">Merial GmbH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Technovit 4004 two components glue</td>
			<td style="width:167px;">Kulzer</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">Telemacrodevice</td>
			<td style="width:167px;">Canon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Thermopuller P-97</td>
			<td style="width:167px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">thin vibrating razor blade device</td>
			<td style="width:167px;">Krup</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">with Szabo thin blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">toluidine blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">89640</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Transmission electron microscope C20</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">up to 200 kV</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:257px;">Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts 
			Outer diameter: 6mm 
			Inner diameter: 4mm 
			Wa 
			ll thickness: 1mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ultracut E</td>
			<td style="width:167px;">Reichert-Jung</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Univentor Scavenger</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8338001</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Vannas scissors (8 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">15009-08</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord

Studien kombinerer i livmoren signaltransduksjon med overføring elektronmikroskop (TEM) sikte på en presis morphometrical analyse av ultrastructural parametere i entydig identifisert topografiske strukturer, påvirket av et protein av interesse som er innført i organismen via viral overføring. Dette kombinert tilnærming gir en myk overgang fra macrostructural til ultrastructural identifikasjon av følgende topografiske navigasjonskart i en vev atlas. Høyoppløselig elektronmikroskop av i-utero-transduced vev avslører den fine ultrastructure av neuropil og plastisitet parameterne, som kryss-delt synaptic bouton områder, antall synaptic blemmer og mitokondrier innenfor en Bouton profil, lengden på synaptic kontakter, kryss-delt axonal områder, tykkelsen på myelin sheaths, antall myelin lamellae, og kryss-delt områder av mitokondrier profiler. Analyse av disse parameterne avslører viktig innsikt i endringer av ultrastructural plastisitet i områdene av nervesystemet som berøres av viral overføring av genetiske Konstruer. Denne kombinerte metoden kan ikke bare brukes for å studere den direkte effekten av genmodifiserte biomolecules og/eller narkotika på neuronal plastisitet, men åpner også muligheten til å studere i livmoren redning av neuronal plastisitet (f.eks i sammenheng med nevrodegenerative sykdommer).

Pålitelig og rask anestesi mus, mange sikkerhetsparametere ble vurdert og en optimalisert arbeidsområdet av anestesi viste seg for å være tilstrekkelig (figur 1A). Enheten er utviklet for å styre blanding av flytende isoflurane og luften med en presisjon kreves for vellykket operasjon på små dyr, for eksempel mus og rotter. Luft og isoflurane er blandet i vaporizer etter ønskede innstillinger og leveres i en boks eller gjennom en mask...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord at JoVE.com

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Vurdering av Ultrastructural Neuroplasticity parametere etter i Utero signaltransduksjon utvikle musen hjernen og ryggmarg

Kombinasjonen av overføring elektronmikroskop og i livmoren signaltransduksjon er en kraftig tilnærming for å studere morfologiske endringer i den fine ultrastructure av nervesystemet under utvikling. Denne kombinerte metoden gir dyp innsikt i endringer i strukturelle detaljer underliggende neuroplasticity med hensyn til deres topografiske representasjon.

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Vår kombinerte tilnærming bidrar til å svare på hvordan ultrastrukturelle nevroplastisitetsparametere endres etter tidlige utviklingsintervensjoner til det gryende nervesystemet i utero. Den største fordelen med vår metode er oppkjøpet av høyoppløselige bilder av makro-meso-mikro-og nanostrukturer i det forhåndsdefinerte koordinatsystemet i et vevatlas. Implikasjonen av vår metode er dens translasjonelle terapeutiske potensial for medfødte nevrodegenerative sykdommer.For eksempel behandling og redning på embryonale stadier ved hjelp av denne in utero transduksjonsteknikken. Vår metode kan brukes på en hvilken som helst annen modell. For eksempel kan museartene endres, samt interesseområdet.Forskere som prøver vår metode for første gang trenger dyp kirurgisk trening, samt kunnskap om hvordan å forberede vevet for elektron mikroskopisk bildebehandling. Begynn med å laste inn en tilpasset kapillærspiss som inneholder fire ganger 10 til de 11 viruspartiklene av adeno-assosiert virustype 1-belegg for ønsket mål, og merket med Fast Green fargestoff på et aspiratorrør. Tilsett 15 mikroliter av de merkede adeno-tilknyttede viruspartiklene i kapillæren.Deretter bekrefter du mangel på respons på tåklemme i en bedøvet embryonisk dag 14,5 gravid mus, og desinfiserer huden. Bruk buede taggete iris tang og rett wolframkarbid saks for å gjøre et hud snitt langs linea mediana. Bruk rett Dumont pinsett for å gripe den peritoneale veggen, fortsett langs linea alba med rett Vannas saks og plasser et stykke fenestrated parafinfilm over bukåpningen og bruk en skjelignende enhet for å avsløre livmorhornene uten å skade embryoene inne i hornene.Etter å ha påført noen dråper 37-graders Celsius PBS på livmorhornene, inspiser embryoene for skade eller misdannelser inne i livmorsekken. Snu embryoene forsiktig inne i sekker til ønsket posisjon for hver injeksjon er oppnådd. Når embryoene er på plass, injiser en til to mikroliter av Fast Green merket viruspartikkelløsning i hvert embryo.Etter at alle embryoene er injisert, plasser livmorhornene tilbake i bukhulen, og legg til noen dråper 37-graders Celsius PBS i magen. Bruk deretter polyamid 6-0 store suturer for å lukke bukhinneveggen og polyamid 3-0-størrelsesuturer og Halsteds Mosquito hemostatiske pinsett for å lukke huden. For å bygge inn isolert vev av interesse for tele-makrofotografering, legg vevsprøven i en spesiell ramme med den reproduserbare snittingsvinkelen, og dokumenter koordinatene.Fyll rammen med 30-graders Celsius 3% agarose til vevet er dekket, og dekk rammen med et plastlokk til agarose har herdet. Mens agarose er herding, bruk tele-makro grafisk enhet for å bilde det innebygde vevet og koordinatene i rammen. Når agarose har størknet, overføre agarose-innebygd vev inn i rammen med kutte hull som svarer til koordinatene til den første rammen.Bruk en enhet med et tynt og vibrerende barberblad for å kutte det innebygde vevet i deler av en passende eksperimentell tykkelse. Deretter bilde hver vev seksjon i PBS, og samle bildene i en mappe. For å forberede vevsprøvene for overføring av elektronmikroskopi, vask vevsseksjonene i et biosikkerhetsskap med to 30-minutters vasker i PBS, etterfulgt av en to timers inkubasjon i 2% vandig osmiumtetroksidløsning ved romtemperatur.På slutten av inkubasjonen vasker du de osmicated seksjonene to ganger til i PBS i 30 minutter per vask og dehydrerer seksjonene i sekvensielle 10-til 15-minutters etanolsenking som angitt. Etter 70% etanol nedsenking, plasser hver prøve i en svart tallerken på en kjedelig svart bakgrunn og bilde prøvene i 70% etanol under LED RGB lys påført prøvene fra venstre og høyre side på 45-graders vinkler. Opprett et atlas av seksjonsbildene med koordinater ved å samle inn bilder av prøvene i serier i en mappe.Behandle prøvene med to 30-minutters 100% etanol inkubasjoner, etterfulgt av to 30-minutters 100% propylenoksid inkubasjoner, begge ved romtemperatur. Mens prøvene inkuberer, bland nylaget harpiks med propylenoksid ved en-til-en- og en-til-to-forhold, og legg til 3% akselerator til begge løsningene. Etter den andre propylenoksid inkubasjon, overføre prøvene til en-til-to harpiks propylen oksid innebygging medium løsning i to timer ved romtemperatur, etterfulgt av en to-timers inkubasjon i en-til-en harpiks propylen oksid innebygging medium løsning ved romtemperatur.På slutten av den andre inkubasjonen, overfør vevet til flate polypropylenretter, og kurere det innebygde vevet med fersk harpiks som inneholder 3% akselerator i 12 til 24 timer ved 65 til 85 grader Celsius. Deretter kjøler du vevet til romtemperatur, og fjern de harpiks-innebygde prøvene fra polypropylenrettene. Hvis du vil tilordne et interesseområde, velger du et bilde som inneholder interesseområdet fra det tidligere forberedte bildeatlaset.Skisser grensene til interesseområdet på det seksjonerte bildet, legger optisk disse grensene på den innebygde prøven under mikroskopet, og bruk en en-tommers 26 gauge nål for å skrape disse områdegrensene på harpiksprøven. Varm deretter prøvene til 95 grader Celsius for å myke opp harpiksen. Deretter tar du ut de varme harpiksprøvene fra ovnen, og bruker et barberblad til å avgiftsdirektoratet interesseområdene.Lim prøvene på akrylglassholderstenger av riktig kaliber, og trim de monterte prøvene for halv- og ultratynn snitting. Bruk en ultramikrotom til å skaffe semitynne 0,7-mikrometer og ultratynne 70 nanometerseksjoner, samle de halvtynne delene på glassbærere, og de ultratynne delene på nikkelgitter. Beis de halvtynne seksjonene med 1% Toluiden blå i PBS i fire minutter, etterfulgt av flere vasker i deionisert vann, før du undersøker seksjonene ved lett mikroskopi.De ultratynne seksjonene kan deretter vurderes direkte ved overføring av elektronmikroskopi ved 180 kilovolt uten ytterligere modifisering. Etter snitting blir vevsskiver avbildet av telemakrofotografering som nettopp demonstrert. Etter osmication og etanol nedsenking, seksjonene er avbildet igjen av interferens lys tele-macrography, avslører et spesielt farget mønster for hver vev overflate.Etter ytterligere dehydrering og harpiksinnbygging velges og videre behandles for overføringselektronmikroskopi. I hippocampus og lillehjernen er mosefibersynapser kjent for å vise unike ultrastrukturelle egenskaper sammenlignet med andre synapser, inkludert store presynaptiske anfall. I deres tverrsnittsprofiler inneholder boutonene et stort antall vesikler og mitokondrier, og omslutter ofte flere dendrittiske spines.I ryggmargen inneholder dorsal funiculus mange aksonale fibre som er myelinert av oligodendroglia. På tverrgående seksjoner kan ryggsal funiculus bli funnet mellom begge bakre horn i ryggmargen. På transmisjon elektron mikroskopi bilder, tverrsnittet myelinated aksoner vises rundt, og myelin hylser rundt aksonene er organisert i lameller.De tilberedte atlasene og mikrografiske transmisjonselektronmikroskopibildene av de ultrastrukturelle parametrene er ikke bare nyttige for sammenligning av morfologisk nevroplastisitet av forskjellige seksjoner under ulike behandlingsforhold, men også for sammenligninger mellom parametere innenfor samme område. Husk å planlegge grundig og forberede før du starter in utero-transduksjonen, og for å være sikker på å ha sikkerhetskopiering av materialer og instrumenter i tilfelle komplikasjoner. Etter vår metode kan andre teknikker legges til som immunogold merking før elektronmikroskopi for ultrastrukturell sporing av et definert molekyl av interesse.Fra og med et helhetlig syn på hele organismen og zoome inn mot molekylær topografi, er vi i stand til å studere og manipulere forholdet mellom vevsfunksjon og morfologi. Osmiumtetroksid er farlig. Pass på at du alltid arbeider under panseret, og bruk vernebriller og håndhansker når du arbeider med denne reagensen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation og organotypiske Slice Culture of Mouse hippocampus Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolering av Neural Stem / stamceller fra periventricular Region of Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Vurdering av endotelcelle Migration etter eksponering for giftige kjemikalier

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Negl Perler inn Utvikling kyllingembryo Limbs å identifisere signaltransduksjonsveier Påvirker Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Vurdering av Maternal vaskulær remodelle under graviditeten i Mouse Livmor

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknikken til Target Mikroinjeksjon til utviklings<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Disseksjon og koronale del forberedelse for å utvikle musen hypofysen

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenøs og Intra-amniotic In Utero transplantasjon i Murine modellen

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunohistochemical påvisning av 5-Methylcytosine og 5-Hydroxymethylcytosine i utviklingen og Postmitotic musen netthinnen

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering av tangentiell celle migrasjon i utviklingsland Chick fiberoptisk Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...