Name: assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord
Uploaded: 2019-02-26T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord at JoVE.com

Los autores agradecen a los colegas de la instalación animal en la Facultad de medicina, Universidad del Ruhr de Bochum, para el cuidado de sus animales y apoyo.

Todos los procedimientos sobre temas animales han sido aprobados por los comités institucionales de ética animal de los Estados federales de Hamburgo y Nordrhein-Westfalen, Alemania.  Utilizar instrumentos estériles, guantes y abrigos asépticas a lo largo de todo el procedimiento quirúrgico.
1. en la transducción de útero
<ol><li>Preparar virus adeno-asociado tipo 1 (AAV1) codificación para el destino deseado (4 x 1011 viral partículas/μl de AAV1) en solución salina t...

<ol>
	<li>Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+axo-dendritic+synapses+in+the+hippocampal+cortex:+electron+and+light+microscopic+studies+on+the+layer+of+mossy+fibers.">Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers.</a> Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).</li><li>Hamlyn, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+the+mossy+fibre+endings+in+the+hippocampus+of+the+rabbit.">The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit.</a> Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).</li><li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).</li><li>Rollenhagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+transmission+at+large+hippocampal+mossy+fiber+synapses.">Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses.</a> Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+basic+protein+cleaves+cell+adhesion+molecule+L1+and+promotes+neuritogenesis+and+cell+survival.">Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Basic+Protein+Cleaves+Cell+Adhesion+Molecule+L1+and+Improves+Regeneration+After+Injury.">Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury.</a> Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).</li><li>Kraus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fragment+of+Adhesion+Molecule+L1+Binds+to+Nuclear+Receptors+to+Regulate+Synaptic+Plasticity+and+Motor+Coordination.">A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination.</a> Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferenzph&#228;nomene+am+osmierten+Pr&#228;parat+f&#252;r+die+systematische+elektronenmikroskopische+Untersuchung.">Interferenzph&#228;nomene am osmierten Pr&#228;parat f&#252;r die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung.</a> Mikroskopie. 30, 139 (1974).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+phenomenon+on+somium+tetroxide-fixed+specimens+for+systematic+electron+microscopy.">Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy.</a> Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Methods+for+Characterization+of+Brain+Regions.">General Methods for Characterization of Brain Regions.</a> Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).</li><li>Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+neural+tissues+or+electron+microscopy+by+perfusion+with+solutions+of+osmium+tetroxide.">Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide.</a> Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).</li><li>Webster, H. F., Collins, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+osmium+tetroxide+and+glutaraldehyde+perfusion+fixation+for+the+electron+microscopic+study+on+the+normal+rat+peripheral+nervous+system.">Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).</li><li>Andres, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zur+Methodik+der+Perfusionsfixierung+des+Zentralnervensystems+von+S&#228;ugern.">Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von S&#228;ugern.</a> Mikroskopie. 21, 169 (1967).</li><li>Forssmann, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+par+perfusion+pour+la+microscopie+&#233;lectronique.+Essai.+De+g&#233;n&#233;ralisation.">Fixation par perfusion pour la microscopie &#233;lectronique. Essai. De g&#233;n&#233;ralisation.</a> Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).</li><li>Descarries, L., Schr&#246;der, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+du+tissue+nerveux+par+perfusion+&#224;+grand+debit.">Fixation du tissue nerveux par perfusion &#224; grand debit.</a> Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).</li><li>Langford, L. A., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+potassium+ferricyanide+in+neural+fixation.">The use of potassium ferricyanide in neural fixation.</a> Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calretinin-positive+L5a+pyramidal+neurons+in+the+development+of+the+paralemniscal+pathway+in+the+barrel+cortex.">Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex.</a> Molecular Brain. 7, 84 (2014).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilins+regulate+synaptic+plasticity+and+mitochondrial+calcium+homeostasis+in+the+hippocampal+mossy+fiber+pathway.">Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway.</a> Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li><li>Nishiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+and+regulated+gene+expression+in+murine+Purkinje+cells+by+in+utero+electroporation.">Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation.</a> European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).</li><li>Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORalpha+regulates+multiple+aspects+of+dendrite+development+in+cerebellar+purkinje+cells+in+vivo.">RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).</li></ol>

Un paso crucial de transducción en el útero es el procedimiento de inyección. La inyección precisa en ventrículos cerebrales o en otra área de interés requiere experiencia y habilidad práctica. La más fina la punta microcapillary, el menor daño tisular puede ocurrir; sin embargo, esto es a costa de aumentar la presión de la inyección. En contraste con electroporación en el útero19,20,21,<sup class="xref"...

Ningún fotón puede penetrar a una muestra de tejido ultrafino en el grado de profundidad de un electrón. Esto atribuye ventajas inestimables a TEM en la captura de imágenes de resolución nanométrica de estructuras finas en comparación con técnicas de microscopía de luz. Por ejemplo, permite la visualización de los organelos intracelulares como mitocondrias, melanosomas y varios tipos de gránulos secretores, microtúbulos, microfilamentos, cilios, microvellosidades y uniones intercelulares (superficie de la célula TEM especializaciones), en particular sinapsis en el sistema nervioso1,2,3,4. El objetivo general del presente estudio metodológico es el reconocimiento ultraestructural de los cambios en la plasticidad neuronal durante el desarrollo sobre interferencia prenatal mediante la combinación de las técnicas de vanguardia de transducción en el útero y TEM. Virally codificadas proteínas de interés han sido transduced en el útero en el sistema nervioso central5,6,7, incluyendo la médula espinal6. Por ejemplo, en el útero transducción en combinación con TEM se ha utilizado para estudiar el efecto de la molécula de adherencia de célula L1 motor aprendizaje plasticidad en ratones deficientes en L1, en particular con respecto a la interacción entre las proteínas del receptor nuclear y L1 en las neuronas cerebelosas7.
El análisis de parámetros de neuroplasticidad requiere información precisa sobre la localización de las zonas más pequeñas dentro del sistema nervioso. Por lo tanto, es adecuada describir detalles ultraestructurales y su orientación topográfica exacta con respecto a otras estructuras. En el presente estudio, se presenta un método preparatorio específico con el objetivo de la investigación detallada de áreas morfológicas distintas basadas en la luz y la microscopia electrónica. Este enfoque combina varias técnicas de manipulación del tejido, a partir de transducción en el útero de ratón cerebro y médula espinal y seguido por la fijación de la perfusión, incrustación de molde y procesamiento del tejido para TEM. Un paso esencial entre la fijación y el procesamiento del tejido para TEM es la documentación de los tejidos, utilizando la técnica de reflexión de la luz de interferencia que permite la documentación precisa microfotográficos y baja magnificación de muestras de tejido8,9,10. Incorporado en el enfoque actual, esta técnica permite a los investigadores examinar detalles topográficos y estructurales de las superficies de tejido nervioso y de perfiles de segmento de muestra antes de su preparación para TEM.
Un marco especial para seccionar todo cerebro corresponde a las coordenadas estereotáxicas. Este marco de beneficios morfológica reconstrucción tridimensional (3D) de zonas en tejido nervioso y puede ser utilizado para el análisis morfométrico. Las macrographs de las visualizadas secciones se asignan a coordenadas topográficas, y las secciones en serie numeradas crear mapas en un atlas de tejido.
Después de procesamiento de la resina, se secciona el tejido embebido en secciones ultrafinas (< 70 nm) que contiene las áreas seleccionadas, según los mapas del atlas mencionado tejido. Las secciones ultrafinas son sometidas a TEM para obtención de imágenes de alta resolución de los parámetros (por ejemplo, áreas de sección transversal Perfil de botones sinápticos o axonales fibras) de la plasticidad de sus contenidos y de contactos a estructuras vecinas dentro del complejo neuropilo.
Con el método descrito en este documento, la transición de macroestructuras visualizado a micro - y nanoestructuras permite estudios comparativos detallados de la plasticidad neuronal morfológica después en el útero de transducción el desarrollo nervioso sistema.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="968">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol</td>
			<td style="width:167px;">Serva</td>
			<td style="width:123px;">36975</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">26Gx 1&#39;&#39; needle</td>
			<td style="width:167px;">Henke-Sass, Wolf GmbH</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td>410 Anaesthesia Unit for air pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8323102</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="414">
			<td>Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)</td>
			<td>UKE (Viral Core Facility)</td>
			<td>-</td>
			<td>For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A9414</td>
			<td style="width:423px;">low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Air Pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">Eheim 100</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Araldite</td>
			<td style="width:167px;">CIBA-GEIGY</td>
			<td style="width:123px;">23857.9</td>
			<td style="width:423px;">resin for embedding of tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">aspirator tune assemblies</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:167px;">Temgesic</td>
			<td style="width:123px;">ampules</td>
			<td style="width:423px;">painkiller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">capillaries</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">GB100TF-10</td>
			<td style="width:423px;">with fillament</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">44160</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">11203-23</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">electric shaver</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)</td>
			<td style="width:167px;">Ethicon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">polyamide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:167px;">Bepanthene</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:257px;">Fast Green</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7252</td>
			<td style="width:423px;">for visualization of injected liquids</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:257px;">Gas Routing Switch 4/2 connectors</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8433020</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="132">
			<td height="132" style="height:132px;width:257px;">halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13011-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:257px;">Heparin-Natrium</td>
			<td style="width:167px;">Ratiopharm</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">25 000 I.E./5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Induction box for mice 
			with horizontally moving lid. 
			Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. 
			Wall thickness: 6 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris forceps (10cm, curved, serrated)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14007-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14501-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm 
			Outer dimensions: 257x110x18 mm. 
			Heating area: 190x90 mm 
			The removal of the isoflurane escaping 
			the breathing mask is downwards in compliance with the 
			regulations</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">isoflurane (Attane)</td>
			<td style="width:167px;">JD medical</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">inhalation anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">LED RGB lights</td>
			<td style="width:167px;">Cameo</td>
			<td style="width:123px;">CLQS15RGBW</td>
			<td style="width:423px;">LEDs 2 x 15 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Light microscope Basic DM E</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">4x (N.A. 0.1 &#8734;/-), 10x (N.A. 0.22 &#8734;/0.17), 40x (N.A. 0.65 &#8734;/0.17), 100x (N.A. 1.25 &#8734;/0.17) objectives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">micropipette puller</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">P-97</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13010-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Nickel grids, 200 mesh</td>
			<td style="width:167px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">1GC200</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Osmium (VIII)-oxid</td>
			<td style="width:167px;">Degussa</td>
			<td style="width:123px;">73219</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Propylene oxide</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">82320</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">razor blades</td>
			<td style="width:167px;">Schick</td>
			<td style="width:123px;">87-10489</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Sodium pentobarbital (Narcoren)</td>
			<td style="width:167px;">Merial GmbH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Technovit 4004 two components glue</td>
			<td style="width:167px;">Kulzer</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">Telemacrodevice</td>
			<td style="width:167px;">Canon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Thermopuller P-97</td>
			<td style="width:167px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">thin vibrating razor blade device</td>
			<td style="width:167px;">Krup</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">with Szabo thin blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">toluidine blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">89640</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Transmission electron microscope C20</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">up to 200 kV</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:257px;">Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts 
			Outer diameter: 6mm 
			Inner diameter: 4mm 
			Wa 
			ll thickness: 1mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ultracut E</td>
			<td style="width:167px;">Reichert-Jung</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Univentor Scavenger</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8338001</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Vannas scissors (8 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">15009-08</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord

El presente estudio combina la transducción en el útero con microscopía electrónica de transmisión (TEM) con el objetivo de un análisis preciso morfométricas de parámetros ultraestructurales en estructuras topográficas claramente identificados, afectados por una proteína de interés se introduce en el organismo vía transferencia viral. Este enfoque combinado permite una transición fluida de macroestructurales a identificación ultraestructural por mapas topográficos de la navegación en un atlas de tejido. Alta resolución microscopia electrónica del tejido en el útero-transduced revela la fina ultraestructura el neuropil y sus parámetros de plasticidad, tales como áreas de sección bouton sináptico, el número de vesículas sinápticas y mitocondrias dentro de un Perfil de Bouton, la longitud de los contactos sinápticos, sección áreas axonales, el grosor de las vainas de mielina, el número de laminillas del myelin y áreas de sección de perfiles de las mitocondrias. El análisis de estos parámetros revela conocimientos esenciales en los cambios de plasticidad ultraestructural en las áreas del sistema nervioso que se ven afectados por la transferencia viral de la construcción genética. Este método combinado no sólo se puede utilizar para estudiar el efecto directo de biomoléculas genéticamente o drogas en la plasticidad neuronal pero también abre la posibilidad para estudiar el rescate en el útero de la plasticidad neuronal (por ejemplo, en el contexto de enfermedades neurodegenerativas).

Para la anestesia rápida y fiable de los ratones, se consideraron varios parámetros de seguridad, y un espacio de trabajo optimizado de la unidad de anestesia demostró para ser adecuada (figura 1A). La unidad está diseñada para controlar la mezcla de isoflurano líquido y aire ambiente con una precisión necesaria para la exitosa cirugía en pequeños animales, como ratones y ratas. Aire e isoflurano se mezclan en el vaporizador de acuer...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord at JoVE.com

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Evaluación de parámetros de neuroplasticidad ultraestructurales después en la transducción de útero de cerebro de ratón en desarrollo y a la médula espinal

La combinación de microscopía electrónica de transmisión y transducción de señales en el útero es un poderoso enfoque para estudiar los cambios morfológicos en la ultraestructura fina del sistema nervioso durante el desarrollo. Este método combinado permite penetraciones profundas en cambios en los detalles estructurales subyacentes de neuroplasticidad con respecto a su representación topográfica.

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Nuestro enfoque combinado ayuda a responder cómo los parámetros de neuroplasticidad ultraestructural cambian después de las intervenciones tempranas del desarrollo al naciente sistema nervioso en el útero. La principal ventaja de nuestro método es la adquisición de imágenes de alta resolución de macro-meso-micro-y nanoestructuras en el sistema de coordenadas predefinido dentro de un atlas de tejido. La implicación de nuestro método es su potencial terapéutico traslacional para enfermedades neurodegenerativas congénitas.Por ejemplo, tratamiento y rescate en etapas embrionarias utilizando esta técnica de transducción del útero. Nuestro método se puede aplicar a cualquier otro modelo. Por ejemplo, las especies de ratón se pueden cambiar, así como el área de interés.Los investigadores que prueban nuestro método por primera vez necesitan un entrenamiento quirúrgico profundo, así como el conocimiento de cómo preparar el tejido para la toma de imágenes microscópicas electrónicas. Comience cargando una punta capilar personalizada que contenga cuatro veces 10 a las 11 partículas virales del recubrimiento de virus asociado al adeno tipo 1 para el objetivo deseado, y etiquetado con tinte Fast Green en un tubo aspirador. Añadir 15 microlitros de las partículas de virus asociadas a adeno etiquetadas en el capilar.A continuación, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del otro en un ratón embarazada anestesizado día embrionario 14.5 y desinfecte la piel. Utilice fórceps de iris serrados curvos y tijeras rectas de carburo de tungsteno para hacer una incisión de la piel a lo largo de la línea mediana. Usando pinzas dumont rectas para agarrar la pared peritoneal, continúe a lo largo de la linea alba con tijeras Vannas rectas y coloque un pedazo de película de parafina fenestrada sobre la abertura abdominal y use un dispositivo similar a una cuchara para exponer los cuernos uterinos sin dañar los embriones dentro de los cuernos.Después de aplicar unas gotas de PBS de 37 grados celsius en los cuernos uterinos, inspeccione los embriones en busca de daño o malformaciones dentro del saco uterino. Gire los embriones cuidadosamente dentro de sus sacos hasta que se logre la posición deseada para cada inyección. Cuando los embriones estén en su lugar, inyecte de uno a dos microlitros de la solución de partículas de virus etiquetados con Fast Green en cada embrión.Después de inyectar todos los embriones, coloque los cuernos uterinos de nuevo en la cavidad abdominal, y agregue unas gotas de PBS de 37 grados Celsius en el abdomen. Luego usa suturas de tamaño poliamida 6-0 para cerrar la pared peritoneal y las suturas de tamaño poliamida 3-0 y los fórceps hemostáticos Mosquito de Halsted para cerrar la piel. Para incrustar tejidos aislados de interés para la fotografía tele-macro, coloque la muestra de tejido en un marco especial con el ángulo de sección reproducible y documente las coordenadas.Llene el marco con 30 grados-Celsius 3%agarosa hasta que el tejido esté cubierto, y cubra el marco con una tapa de plástico hasta que la agarosa se haya endurecido. Mientras la agarosa se está endureciendo, utilice el dispositivo gráfico tele-macro para crear imágenes del tejido incrustado y sus coordenadas dentro del marco. Cuando la agarosa se haya solidificado, transfiera el tejido incrustado en la agarosa al marco con huecos de corte correspondientes a las coordenadas del primer marco.Utilice un dispositivo con una cuchilla de afeitar delgada y vibrante para cortar el tejido incrustado en secciones de un espesor experimental adecuado. A continuación, imagine cada sección de tejido en PBS y recopile las imágenes en una carpeta. Para preparar las muestras de tejido para la microscopía electrónica de transmisión, en un gabinete de bioseguridad, lave las secciones tisulares con dos lavados de 30 minutos en PBS, seguido de una incubación de dos horas en una solución de tetróxido de osmio acuosa al 2%a temperatura ambiente.Al final de la incubación, lave las secciones osmicadas dos veces más en PBS durante 30 minutos por lavado y deshidrate las secciones en inmersiones secuenciales de etanol de 10 a 15 minutos como se indica. Después de la inmersión de 70%etanol, coloque cada muestra en un plato negro sobre un fondo negro opaco e imagine las muestras en 70%etanol bajo luz LED RGB aplicada a las muestras de los lados izquierdo y derecho en ángulos de 45 grados. Cree un atlas de las imágenes de la sección con coordenadas recopilando imágenes de las muestras en serie en una carpeta.Tratar los especímenes con dos incubaciones de 30 minutos al 100% de etanol, seguidas de dos incubaciones de óxido de 30 minutos al 100%, ambas a temperatura ambiente. Mientras las muestras están incubando, mezcle la resina recién preparada con óxido de propileno en una a una y una a dos proporciones, y agregue un acelerador del 3% a ambas soluciones. Después de la segunda incubación de óxido de propileno, transfiera las muestras a la solución media de incrustación de óxido de propileno de uno a dos durante dos horas a temperatura ambiente, seguida de una incubación de dos horas en la solución media de incrustación de óxido de propileno de uno a uno a temperatura ambiente.Al final de la segunda incubación, transfiera los tejidos a platos planos de polipropileno y cure los tejidos incrustados con resina fresca que contenga un acelerador del 3% durante 12 a 24 horas a 65 a 85 grados centígrados. A continuación, enfríe el tejido a temperatura ambiente y retire las muestras incrustadas en resina de los platos de polipropileno. Para asignar un área de interés, seleccione una imagen que contenga el área de interés del atlas de imagen preparado anteriormente.Dibuje los bordes del área de interés sobre la imagen seccionada, superponga ópticamente estos bordes sobre la muestra incrustada bajo el microscopio, y utilice una aguja de calibre de una pulgada de 26 para rayar estos bordes de la región sobre la muestra de resina. Luego, calienta los especímenes a 95 grados Celsius para suavizar la resina. A continuación, saque las muestras de resina tibia del horno y utilice una cuchilla de afeitar para extirpar las áreas de interés.Pegue los especímenes en barras de sujeción de vidrio acrílico del calibre adecuado y recorte las muestras montadas para una sección semi y ultrafina. Utilice un ultramicrotoma para adquirir secciones semidelgadas de 0,7 micrómetros y ultradelgadas de 70 nanómetros, recogiendo las secciones semifinas en los soportes de vidrio y las secciones ultradelgadas en las rejillas de níquel. Mancha las secciones semifinas con 1%Toluidina azul en PBS durante cuatro minutos, seguido de varios lavados en agua desionizada, antes de examinar las secciones por microscopía de luz.Las secciones ultradelgadas pueden evaluarse directamente mediante microscopía electrónica de transmisión a 180 kilovoltas sin más modificaciones. Después de la sección, las rebanadas de tejido son fotografiadas por la fotografía tele-macro como se acaba de demostrar. Después de la osmicación y la inmersión en etanol, las secciones se vuelven a ver mediante una telesmografía de luz de interferencia, revelando un patrón de color específico para cada superficie de tejido.Después de la deshidratación adicional y la incrustación de resina, las áreas de interés se seleccionan y procesan posteriormente para la microscopía electrónica de transmisión. En el hipocampo y el cerebelo, se sabe que las sinapsis de fibra musgosas presentan características ultraestructurales únicas en comparación con otras sinapsis, incluyendo grandes boutones presinápticos. En sus perfiles de sección transversal, los boutons contienen un gran número de vesículas y mitocondrias, y muy a menudo encierran varias espinas dendríticas.En la médula espinal, el funiculus dorsal contiene muchas fibras axonales que son mielinadas por oligodendroglia. En las secciones transversales, el funiculus dorsal se puede encontrar entre ambos cuernos posteriores de la médula espinal. En las imágenes de microscopía electrónica de transmisión, los axones mielinados seccionados aparecen redondos, y las vainas de mielina que rodean los axones están organizadas en las lamelas.El atlas preparado y las imágenes de microscopía electrónica de transmisión micrográfica de los parámetros ultraestructurales no sólo son útiles para la comparación de la neuroplasticidad morfológica de diferentes secciones bajo diversas condiciones de tratamiento, sino también para las comparaciones entre parámetros dentro de la misma área. Recuerde planificar y preparar a fondo antes de comenzar la transducción en el útero, y asegúrese de tener respaldo de materiales e instrumentos en caso de complicaciones. Siguiendo nuestro método, se pueden agregar otras técnicas como el etiquetado de inmunooro antes de la microscopía electrónica para el rastreo ultraestructural de una molécula definida de interés.Comenzando con una visión holística de todo el organismo y haciendo zoom hacia la topografía molecular, somos capaces de estudiar y manipular la relación entre la función tisular y la morfología. El tetróxido de osmio es peligroso. Asegúrese de trabajar siempre debajo de la capucha, y de usar gafas protectoras y guantes de mano cuando trabaje con este reactivo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero electroporación y organotípicos rebanada Cultura de ratón Hipocampo Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Evaluación de la migración de células endoteliales después de la exposición a sustancias químicas tóxicas

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Injerto de Cuentas en desarrollo Miembros de embrión de pollo para identificar señales de transducción Pathways afectan la Expresión Génica

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Evaluación del Materno remodelado vascular durante el embarazo en el útero de ratón

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Disección y preparación del segmento Coronal de desarrollo de hipófisis de ratón

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenosa y Intra-amniótico en el útero el trasplante en el modelo murino

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

La detección de Immunohistochemical de la 5-METILCITOSINA y 5-hidroximetilcitosina en desarrollo y en la Retina de ratón Postmitotic

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualización de la migración celular tangencial en el Tectum óptico de Chick en desarrollo

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...