Name: assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord
Uploaded: 2019-02-26T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord at JoVE.com

Yazarlar meslektaşları hayvan tesisi Tıp Fakültesi, Bochum Ruhr Üniversitesi, onların desteği ve hayvan bakımı için teşekkür ederiz.

Hayvan konularda tüm yordamları Hamburg ve Nordrhein-Westfalen, Almanya federal Devletleri kurumsal hayvan etik komiteleri tarafından onaylanmıştır.  Steril aletlerin, koruyucu eldiven ve aseptik kat tüm ameliyat boyunca kullanın.
1 rahim iletim.
<ol><li>Adeno ilişkili virüs tip 1 (AAV1) istenen hedef (4 x 1011 viral parçacıkların/µL, AAV1) için kodlama fosfat tamponlu tuz (PBS) pH 7.4 hazırlayın. 0.1 mg/µL hızlı yeşil ekleyin ve 37 ° C'de AAV1-hızlı-yeş...

<ol>
	<li>Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+axo-dendritic+synapses+in+the+hippocampal+cortex:+electron+and+light+microscopic+studies+on+the+layer+of+mossy+fibers.">Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers.</a> Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).</li><li>Hamlyn, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+the+mossy+fibre+endings+in+the+hippocampus+of+the+rabbit.">The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit.</a> Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).</li><li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).</li><li>Rollenhagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+transmission+at+large+hippocampal+mossy+fiber+synapses.">Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses.</a> Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+basic+protein+cleaves+cell+adhesion+molecule+L1+and+promotes+neuritogenesis+and+cell+survival.">Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).</li><li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Basic+Protein+Cleaves+Cell+Adhesion+Molecule+L1+and+Improves+Regeneration+After+Injury.">Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury.</a> Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).</li><li>Kraus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fragment+of+Adhesion+Molecule+L1+Binds+to+Nuclear+Receptors+to+Regulate+Synaptic+Plasticity+and+Motor+Coordination.">A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination.</a> Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferenzph&#228;nomene+am+osmierten+Pr&#228;parat+f&#252;r+die+systematische+elektronenmikroskopische+Untersuchung.">Interferenzph&#228;nomene am osmierten Pr&#228;parat f&#252;r die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung.</a> Mikroskopie. 30, 139 (1974).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+phenomenon+on+somium+tetroxide-fixed+specimens+for+systematic+electron+microscopy.">Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy.</a> Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Methods+for+Characterization+of+Brain+Regions.">General Methods for Characterization of Brain Regions.</a> Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).</li><li>Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+neural+tissues+or+electron+microscopy+by+perfusion+with+solutions+of+osmium+tetroxide.">Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide.</a> Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).</li><li>Webster, H. F., Collins, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+osmium+tetroxide+and+glutaraldehyde+perfusion+fixation+for+the+electron+microscopic+study+on+the+normal+rat+peripheral+nervous+system.">Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).</li><li>Andres, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zur+Methodik+der+Perfusionsfixierung+des+Zentralnervensystems+von+S&#228;ugern.">Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von S&#228;ugern.</a> Mikroskopie. 21, 169 (1967).</li><li>Forssmann, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+par+perfusion+pour+la+microscopie+&#233;lectronique.+Essai.+De+g&#233;n&#233;ralisation.">Fixation par perfusion pour la microscopie &#233;lectronique. Essai. De g&#233;n&#233;ralisation.</a> Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).</li><li>Descarries, L., Schr&#246;der, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+du+tissue+nerveux+par+perfusion+&#224;+grand+debit.">Fixation du tissue nerveux par perfusion &#224; grand debit.</a> Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).</li><li>Langford, L. A., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+potassium+ferricyanide+in+neural+fixation.">The use of potassium ferricyanide in neural fixation.</a> Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calretinin-positive+L5a+pyramidal+neurons+in+the+development+of+the+paralemniscal+pathway+in+the+barrel+cortex.">Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex.</a> Molecular Brain. 7, 84 (2014).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilins+regulate+synaptic+plasticity+and+mitochondrial+calcium+homeostasis+in+the+hippocampal+mossy+fiber+pathway.">Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway.</a> Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li><li>Nishiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+and+regulated+gene+expression+in+murine+Purkinje+cells+by+in+utero+electroporation.">Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation.</a> European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).</li><li>Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORalpha+regulates+multiple+aspects+of+dendrite+development+in+cerebellar+purkinje+cells+in+vivo.">RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).</li></ol>

Çok önemli bir adım rahimde iletim / enjeksiyon işlemdir. Hassas Enjeksiyon beyin ventrikül veya ilgi başka bir alan içine deneyim ve uygulamalı beceri gerektirir. Daha ince microcapillary uç, daha az doku hasarı oluşabilir; Ancak, bu enjeksiyon basıncı arttırmak pahasına. Rahimde elektroporasyon19,20,21,22aksine, enjekte embriyo rahimde iletim sonra hayatta kalma oranı çok yü...

Yok foton bir elektron derinlik sınıfta bir ultrathin doku numune nüfuz. Bu çok değerli avantajları TEM için nanometre çözünürlük fotoğraf güzel ışık mikroskobu teknikleri için karşılaştırıldığında yapıları yakalama öznitelikleri. Örneğin, mitokondri, melanosomes ve çeşitli salgı granülleri, mikrotübüller, microfilaments, kirpikler, microvilli ve hücreler arası kavşak (hücre yüzey gibi hücre içi organellerin görselleştirme için TEM sağlar uzmanlık), özellikle sinir sistemi1,2,3,4' te synapses. Metodolojik da çalışmanın genel amacı nöral plastisite değişimler ultrastructural tanıma geliştirme doğum öncesi girişim üzerine rahimde iletim ve TEM state-of--art teknikleri birleştirerek bulunuyor. İlgi virally kodlanmış proteinler rahimde omurilik6dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi5,6,7, transduced. Örneğin, rahimde iletim TEM ile birlikte hücre adezyon molekülü L1 etkisi motorlu plastisite L1-eksik farelerde özellikle L1 ve nükleer reseptör proteinler arasında etkileşimi ile ilgili öğrenme eğitimi için kullanılmıştır serebellar nöronlar7' de.
Nöroplastisite parametreler analiz sinir sistemi içinde en küçük alanlarda lokalizasyonu hakkında kesin bilgi gerektirir. Bu nedenle, ultrastructural detayları ve diğer yapıları ile ilgili tam topografik yönelimleri açıklamak yeterli olduğunu. Bu da çalışmanın, hem ışık hem elektron mikroskobu bağlı farklı morfolojik bölgelerin detaylı incelenmesi yönelik belirli bir hazırlık yöntemi gösterilir. Bu yaklaşım doku manipülasyonu, fare beyin ve omurilik rahimde iletim ile başlayan ve perfüzyon fiksasyon tarafından takip çeşitli teknikleri birleştiren kalıp gömme ve doku TEM için işleme. Kesin microphotographic ve düşük-büyütme belgelenmesi için sağlar girişim ışık yansıması tekniği kullanarak doku belgelerine gömme ve TEM için doku işleme arasında dahil önemli bir adım olduğunu doku örnekleri8,9,10. Mevcut yaklaşım dahil, bu teknik araştırmacılar topoğrafik ve yapısal detaylar sinir doku yüzeyler ve numune dilim profilleri onların hazırlık TEM için önce incelemek için sağlar.
Bütün beyin kesit için özel bir çerçeve stereotaksik koordinatlarına karşılık gelir. Bu çerçeve morfolojik üç boyutlu (3D) yeniden inşası sinir doku alanlarda faydaları ve xarakteristikaları analizi için kullanılabilir. Macrographs görüntülenmeyecektir bölümlerin topografik koordinatları atanır ve seri olarak numaralı kesitler doku atlas haritaları oluşturmak.
İşleme reçine sonra katıştırılmış doku ultrathin bölümlere kesitli (< 70 nm) yukarıda belirtilen doku atlas haritaları göre Seçili alanlar içeren. Ultrathin bölümleri TEM içeriklerini ve komşu yapılar kompleksi içinde ilgili kişilere plastisite parametreleri (örneğin, kesit profil alanları sinaptik boutons veya aksonal lifleri) yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için tabi neuropil.
Burada açıklanan yöntemi ile mikro - ve taşınımı için yumuşak bir geçiş görüntülenmeyecektir macrostructures üzerinden morfolojik nöronal plastisite karşılaştırmalı ayrıntılı çalışmalar geliştirme rahim içinde iletim sonra gergin verir sistem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="968">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol</td>
			<td style="width:167px;">Serva</td>
			<td style="width:123px;">36975</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">26Gx 1&#39;&#39; needle</td>
			<td style="width:167px;">Henke-Sass, Wolf GmbH</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td>410 Anaesthesia Unit for air pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8323102</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="414">
			<td>Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)</td>
			<td>UKE (Viral Core Facility)</td>
			<td>-</td>
			<td>For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A9414</td>
			<td style="width:423px;">low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Air Pump</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">Eheim 100</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Araldite</td>
			<td style="width:167px;">CIBA-GEIGY</td>
			<td style="width:123px;">23857.9</td>
			<td style="width:423px;">resin for embedding of tissue</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">aspirator tune assemblies</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:167px;">Temgesic</td>
			<td style="width:123px;">ampules</td>
			<td style="width:423px;">painkiller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">capillaries</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">GB100TF-10</td>
			<td style="width:423px;">with fillament</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">44160</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">11203-23</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">electric shaver</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)</td>
			<td style="width:167px;">Ethicon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">polyamide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:167px;">Bepanthene</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:257px;">Fast Green</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F7252</td>
			<td style="width:423px;">for visualization of injected liquids</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:257px;">Gas Routing Switch 4/2 connectors</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8433020</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="132">
			<td height="132" style="height:132px;width:257px;">halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13011-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:257px;">Heparin-Natrium</td>
			<td style="width:167px;">Ratiopharm</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">25 000 I.E./5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Induction box for mice 
			with horizontally moving lid. 
			Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. 
			Wall thickness: 6 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris forceps (10cm, curved, serrated)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14007-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">14501-14</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm 
			Outer dimensions: 257x110x18 mm. 
			Heating area: 190x90 mm 
			The removal of the isoflurane escaping 
			the breathing mask is downwards in compliance with the 
			regulations</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">isoflurane (Attane)</td>
			<td style="width:167px;">JD medical</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;">inhalation anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:257px;">LED RGB lights</td>
			<td style="width:167px;">Cameo</td>
			<td style="width:123px;">CLQS15RGBW</td>
			<td style="width:423px;">LEDs 2 x 15 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Light microscope Basic DM E</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">4x (N.A. 0.1 &#8734;/-), 10x (N.A. 0.22 &#8734;/0.17), 40x (N.A. 0.65 &#8734;/0.17), 100x (N.A. 1.25 &#8734;/0.17) objectives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">micropipette puller</td>
			<td style="width:167px;">Science-Products</td>
			<td style="width:123px;">P-97</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">13010-12</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Nickel grids, 200 mesh</td>
			<td style="width:167px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">1GC200</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Osmium (VIII)-oxid</td>
			<td style="width:167px;">Degussa</td>
			<td style="width:123px;">73219</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Propylene oxide</td>
			<td style="width:167px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">82320</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">razor blades</td>
			<td style="width:167px;">Schick</td>
			<td style="width:123px;">87-10489</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Sodium pentobarbital (Narcoren)</td>
			<td style="width:167px;">Merial GmbH</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Technovit 4004 two components glue</td>
			<td style="width:167px;">Kulzer</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">Telemacrodevice</td>
			<td style="width:167px;">Canon</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Thermopuller P-97</td>
			<td style="width:167px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">thin vibrating razor blade device</td>
			<td style="width:167px;">Krup</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">with Szabo thin blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">toluidine blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">89640</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Transmission electron microscope C20</td>
			<td style="width:167px;">Phillips</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">up to 200 kV</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:257px;">Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts 
			Outer diameter: 6mm 
			Inner diameter: 4mm 
			Wa 
			ll thickness: 1mm</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ultracut E</td>
			<td style="width:167px;">Reichert-Jung</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:423px;">ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Univentor Scavenger</td>
			<td style="width:167px;">Biomedical Instruments (Univentor)</td>
			<td style="width:123px;">8338001</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Vannas scissors (8 cm, straight)</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:123px;">15009-08</td>
			<td style="width:423px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ultrastructural neuroplasticity parameters after in utero transduction of the developing mouse brain and spinal cord

Bu da çalışmanın ilgi bir protein tarafından etkilenen belirsizliğe yer bırakmadan tanımlanan topografik yapılarda ultrastructural parametrelerinin kesin morfometrik analizi nişan rahimde iletim transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile birleştirir Bu viral havalesi yoluyla organizma içine giriliyor. Bu kombine yaklaşım aşağıdaki topografik navigasyon haritaları bir doku atlasında tarafından ultrastructural kimlik macrostructural yumuşak bir geçiş sağlar. Yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu içinde-utero-transduced doku ortaya neuropil ve plastisite parametreleri, cross-sectioned sinaptik bouton alanları, sinaptik veziküller ve mitokondri içinde sayısı gibi iyi ultrastructure bir Bouton profil, sinaptik kişiler, cross-sectioned aksonal alanları, miyelin kılıf kalınlığı, miyelin lamellae sayısı ve mitokondri profilleri cross-sectioned alanları uzunluğu. Bu parametreler analizi genetik yapı viral havalesi ile etkilenen sinir sistemi alanlarında ultrastructural plastisite değişiklikleri içine temel görüşler ortaya koymaktadır. Bu kombine yöntem yalnızca nöronal plastisite üzerinde genetiği biomolecules ve/veya uyuşturucu etkisi doğrudan çalışmak için kullanılamaz ancak da (örneğin, bağlamında nöronal plastisite rahimde Kurtarma çalışma imkanı açılır nörodejeneratif hastalıklar).

Güvenilir ve hızlı anestezi farelerin için çok sayıda güvenlik parametreleri kabul edildi ve en iyi duruma getirilmiş bir çalışma alanı anestezi biriminin yeterli (şekil 1A) kanıtladı. Birimi fare ve sıçanlar gibi küçük hayvanlar üzerinde başarılı ameliyat için gerekli bir hassasiyetle sıvı isoflurane ve ortam havası karışımı kontrol etmek için tasarlanmıştır. Hava ve isoflurane Buharlaştırıcı istenen a...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord at JoVE.com

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Sonra Ultrastructural nöroplastisite parametrelerinde Utero iletim gelişmekte olan fare beyin ve omurilik değerlendirilmesi

Transmisyon elektron mikroskobu ve rahimde iletim sinir sisteminin iyi ultrastructure morfolojik değişiklikler geliştirme sırasında çalışmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu kombine yöntem değişiklikleri içine derin anlayışlar nöroplastisite ile ilgili topografik ifadelerinin temel yapısal detayları verir.

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Kombine yaklaşımımız, rahimde yeni doğan sinir sistemine yapılan erken gelişimsel müdahaleler den sonra ultrastrüktost nöroplastisite parametrelerinin nasıl değiştiğini yanıtlamaya yardımcı olur. Yöntemimizin en büyük avantajı, makro-meso-mikro-ve nanoyapıların yüksek çözünürlüklü görüntülerinin doku atlası içinde önceden tanımlanmış koordinat sisteminde elde edilmesidir. Yöntemimizin anlamı konjenital nörodejeneratif hastalıklar için çevirisel tedavi potansiyelidir.Örneğin, tedavi ve embriyonik aşamalarında kurtarma rahim transdüksiyon tekniği nde bu kullanarak. Yöntemimiz başka bir modele uygulanabilir. Örneğin, fare türleri ve ilgi alanı değiştirilebilir.Metodumuzu ilk kez deneyen araştırmacılar, derin cerrahi eğitime ve elektron mikroskobik görüntülemeye nasıl hazırlanacağı konusunda bilgiye ihtiyaç duyarlar. İstenilen hedef için adeno ile ilişkili virüs tip 1 kaplamanın 11 viral partikülsi için dört kez 10 içeren özelleştirilmiş bir kılcal uç yükleyerek başlayın ve bir aspiratör tüpü üzerine Hızlı Yeşil boya ile etiketlendi. Kılcal damar içine etiketli adeno ilişkili virüs parçacıkları 15 mikrolitre ekleyin.Daha sonra, anestezi embriyonik gün 14,5 hamile fare de parmak sıkışma yanıt eksikliği onaylamak ve cildi dezenfekte. Linea mediana boyunca bir deri kesi yapmak için kavisli tırtıklı iris forceps ve düz tungsten karbür makas kullanın. Periton duvar kavrama düz Dumont cımbız kullanarak, düz Vannas makas ile linea alba boyunca devam ve karın açıklığı üzerinde fenestrated parafin film bir parça yerleştirin ve boynuzları içinde embriyolar zarar vermeden rahim boynuzları ortaya çıkarmak için bir kaşık gibi cihaz kullanın.Rahim boynuzları üzerine 37 derecelik Santigrat PBS birkaç damla uyguladıktan sonra, rahim kesesi içinde hasar veya malformasyonlar için embriyolar kontrol edin. Her enjeksiyon için istenilen pozisyon elde edilene kadar embriyoları keselerinin içine dikkatlice çevirin. Embriyolar yerleştirildiğinde, her embriyoya Fast Green etiketli virüs parçacık çözeltisinin bir ila iki mikrolitresini enjekte edin.Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, karın boşluğuna rahim boynuzları geri yerleştirin ve karın içine 37 derece-Celsius PBS birkaç damla ekleyin. Daha sonra periton duvarını ve poliamidi 3-0 boyutlu sütürleri ve Halsted'in Sivrisinek hemostatik forceps'larını kapatmak için poliamid 6-0 boyutlu dikişler kullanın. Tele-makro fotoğrafçılık için ilgi izole dokular gömmek için, tekrarlanabilir kesit açısı ile özel bir çerçeve içine doku örneği yerleştirin ve koordinatları belgeleyin.Çerçeveyi doku kapalana kadar %3 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 Agarose sertleşirken, çerçeve içinde gömülü dokuyu ve koordinatlarını görüntülemek için tele-makro grafik cihazını kullanın. Agarose katılaşmış olduğunda, agarose gömülü doku ilk çerçevenin koordinatlarına karşılık gelen kesme boşlukları ile çerçeve içine aktarın.Uygun bir deneysel kalınlıkta bölümler halinde gömülü doku kesmek için ince ve titreşimli jilet ile bir cihaz kullanın. Ardından PBS'deki her doku bölümünü görüntüleyin ve görüntüleri bir klasöre toplayın. Iletim elektron mikroskobu için doku örneklerini hazırlamak için, biyogüvenlik dolabında, pbs iki 30 dakikalık yıkar ile doku bölümleri yıkayın, oda sıcaklığında% 2 sulu osmiyum tetroksit çözeltisi iki saatlik kuluçka takip.Kuluçka sonunda, salınımlı bölümleri PBS'de yıkama başına 30 dakika daha iki kez yıkayın ve belirtildiği gibi sıralı 10 ila 15 dakikalık etanol daldırmadaki bölümleri susuz bırakın. %70 etanol daldırma sonra, mat siyah bir arka plan üzerinde siyah bir çanak içine her örnek yerleştirin ve 45 derecelik açılarda sol ve sağ taraftan örneklere uygulanan LED RGB ışığı altında% 70 etanol örnekleri görüntü. Bir klasörde seri örneklerin görüntülerini toplayarak koordinatları ile bölüm görüntülerinin bir atlasoluşturun.Numuneleri iki adet 30 dakikalık 100%etanol kuluçkasıyla tedavi edin, ardından oda sıcaklığında iki adet 30 dakikalık %100 propilen oksit kuluçkaları. Numuneler kuluçkaya yatarken, taze hazırlanmış reçine ile propilen oksitile bire bir ve bire iki oranlarda karıştırın ve her iki çözüme de %3 hızlandırıcı ekleyin. İkinci propilen oksit kuluçkasonra, oda sıcaklığında iki saat boyunca bir-iki reçine propilen oksit gömme orta çözelti içine örnekleri aktarın, oda sıcaklığında bir-bir reçine propilen oksit gömme orta çözelti iki saatlik kuluçka izledi.İkinci kuluçka sonunda, düz polipropilen yemekler içine dokuların transferi ve 65 ila 85 santigrat derece 12 ila 24 saat boyunca% 3 hızlandırıcı içeren taze reçine ile gömülü dokuları tedavi. Daha sonra dokuyu oda sıcaklığında soğutun ve polipropilen tabaklardan reçine gömülü numuneleri çıkarın. İlgi alanının haritasını çıkarmak için, önceden hazırlanmış görüntü atlasından ilgi alanını içeren bir resim seçin.İlgi alanının sınırlarını kesitli görüntüye çizin, bu sınırları mikroskop altındaki gömülü numuneye optik olarak üst üste bindirin ve bu bölge sınırlarını reçine numunesine kazımak için 1inç 26 gauge iğne kullanın. Daha sonra, resin yumuşatmak için numuneleri 95 dereceye ısıtın. Daha sonra, sıcak resenin örneklerini fırından çıkarın ve ilgi alanlarını çıkarmak için jilet kullanın.Numuneleri uygun kalibredeki akrilik cam tutma çubuklarına yapıştırın ve yarı ve ultra ince kesitler için monte edilmiş numuneleri kesin. Yarı ince 0,7 mikrometre ve ultra ince 70 nanometre bölümleri elde etmek için ultramikrotom kullanın, cam taşıyıcılar üzerinde yarı ince bölümleri ve nikel ızgaraları üzerinde ultra ince bölümleri toplama. Işık mikroskobu ile bölümleri incelemeden önce, pbs%1 Toluidin mavisi ile yarı ince kesitleri dört dakika boyunca lekeleyin, ardından deiyonize suda birkaç yıkıntı lar.Ultra ince kesitler daha sonra daha fazla değişiklik yapılmadan 180 kilovolt cinsinden iletim elektron mikroskobu ile doğrudan değerlendirilebilir. Kesitten sonra doku dilimleri tele-makro fotoğrafçılık la görüntülenir. Osmication ve etanol daldırma sonra, kesitler girişim ışık tele-macrography ile tekrar görüntülenir, her doku yüzeyi için özel renkli bir desen ortaya.Ek dehidratasyon ve reçin katıştırma sonra, ilgi alanları seçilir ve iletim elektron mikroskobu için daha fazla işlenir. Hipokampus ve serebellum, yosunlu lif sinapsları diğer sinapslar ile karşılaştırıldığında benzersiz ultrayapısal özellikleri sergilemek için bilinen, büyük presinaptik boutons dahil. Onların kesit profillerinde, boutons veziküller ve mitokondri çok sayıda içeren, ve çok sık birkaç dendritik dikenler içine.Omurilik, dorsal funiculus oligodendroglia tarafından miyelinated birçok aksonal lifler içerir. Transversal kesitlerde, dorsal funiculus omuriliğin her iki arka boynuzu arasında bulunabilir. İletim elektron mikroskobu görüntülerinde kesitli miyelinatlı aksonlar yuvarlak görünür ve aksonlari çevreleyen miyelin kılıfları lamellae'de düzenlenir.Ultrastrüktürel parametrelerin hazırlanan atlası ve mikrografik iletim elektron mikroskobu görüntüleri sadece farklı tedavi koşullarında farklı bölümlerin morfolojik nöroplastiplastisinin karşılaştırılmasında değil, aynı alan daki parametreler arasındaki karşılaştırmalarda da yararlıdır. Rahim transdüksiyonuna başlamadan önce iyice planlamayı ve hazırlamayı ve komplikasyon durumunda malzeme ve aletlerin yedekine sahip olduğundan emin olmayı unutmayın. Metodumuzu takiben, tanımlanmış bir ilgi molekülünün ultrastrüktürsel takibi için elektron mikroskobundan önce immünoaltın etiketleme gibi başka teknikler de eklenebilir.Tüm organizmanın bütünsel bir görünümü ile başlayarak ve moleküler topografya doğru yakınlaştırma, biz çalışma ve doku fonksiyonu ve morfoloji arasındaki ilişkiyi manipüle edebiliyoruz. Osmiyum tetroksit tehlikelidir. Her zaman kaputun altında çalıştığından emin olun ve bu reaktifle çalışırken koruyucu gözlük ve el eldiveni takın.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Gen İfade Etkileyen Sinyal İletimi Pathways tanımak Tavuk Embriyo uzuvlar Geliştirme içine Boncuk eklenme

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Fare Uterus içinde Gebelikte maternal Vasküler Yaptırma Değerlendirilmesi

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Diseksiyon ve fare hipofiz bezi geliştirme koronal dilim hazırlık

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

İntravenöz ve içi amniyotik rahim içinde nakli fare modeli

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

5-metilsitozin ve gelişmekte olan 5-arasında bakterilerde görülen immunohistokimyasal tespiti ve Postmitotic fare Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Görselleştirme teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik Tectum içinde

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...