Name: improving high viscosity extrusion of microcrystals for time-resolved serial femtosecond crystallography at x-ray lasers
Uploaded: 2019-02-28T14:30:00
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我们感谢 gebhard schertler、rafael abela 和 chris milne 支持在 psi 使用高粘度喷射器。richard neutze 和他的团队被认可讨论时间解析的晶体学和样品交付使用高粘度喷射器。为了提供财政支助, 我们感谢瑞士国家科学基金会提供赠款31003A_141235、31003A_159558 (向 j. s.) 和 PZ00P3_174169 (向 p. n.) 提供的赠款。根据 marie-sklolowska-curie 第706号赠款协议, 该项目得到了欧洲联盟 "地平线 2020" 研究和创新方案的资助。

1. 蛋白质晶体样品制备
<ol><li>在样品注射前大约 30分钟, 将50μl 的基于晶体的单油蛋白基 lcp 装入100μl 注射器中。</li>
	<li>用于在大气压力下注射: 将10μl 的液体石蜡装入第二个注射器的背面。垂直按住注射器, 排出注射器中的气泡。<ol>
<li>用于注入真空环境: 将5μl 的 mag 7.9 和5μl 的液体石蜡加载到第二个注射器的背面。垂直按住注射器, 排出注射器中的气泡。</li>
	</ol>
</li>
	<li>用石蜡与 mag 7.9 连?...

tr-sfx 方法与粘性挤出喷射器已被证明是一种可行的技术,结构动力学研究细菌视紫红质 9,10 和光系统 ii13 , 现在似乎准备研究蛋白质驱动其他照片生物过程, 如光驱动离子传输或感官感知5,50。上述协议旨在最大限度地提高 TR-SFX 细菌视紫红质数据收集的成功率, 但我们相信可以作为模板, 优化?...

串行飞秒晶体学 (sfx) 是一种结构生物学技术, 利用 x 射线自由电子激光器 (xfel) 的独特特性, 从数千颗微米大小的晶体中确定室温结构, 同时超过大多数晶体。辐射损伤由 "衍射在破坏之前" 原则1,2,3。
在 sfx (TR-SFX) 的时间解析扩展中, 来自 xfel 的飞秒脉冲用于研究蛋白质4,5的结构变化。感兴趣的蛋白质是用光学激光 (或另一个活动触发器) 激活的, 就在 xfel 在泵-探针设置中被 xfel 击中之前。通过精确控制泵与探针脉冲之间的延迟, 可以在不同的状态下捕获目标蛋白。分子电影的结构变化超过十一个数量级的时间显示了新的 xfel 源的力量, 研究几个蛋白质靶标 6,7,8, 9, 10、11、12、13。主要是, 该方法将动态光谱和静态结构技术结合在一起, 提供了近原子分辨率下蛋白质动力学的一瞥。
tr-sfx 的简单系统可能包含具有光敏感成分的内源性激活触发器, 如视网膜在细菌视紫红质 (br)9,10, 光系统 ii,13中的色谱,光活性黄色蛋白 (pyp)6,7可逆光敏荧光蛋白11, 或肌红蛋白8中的可光解一氧化碳.该技术的令人兴奋的变化仍在开发中, 它依靠混合和注入方案14,15 来研究酶反应或用于诱发结构变化的电场16。鉴于 xfel 源只提供了几年, 并将过去的成功推断到未来, 该方法显示了我们对蛋白质功能的理解作为真正改变游戏规则的潜力。
由于生物样本被一次暴露在高功率 xfel 脉冲中破坏, 因此有必要采用新的蛋白质晶体学方法。在这些程序中, 需要开发生长大量均匀微晶的能力 17、18、19.为了在 xfel 中进行数据收集, 必须交付、丢弃这些晶体, 然后为每个 xfel 脉冲续订这些晶体。鉴于 xfels 在10-120 赫兹的情况下发射可用脉冲, 样品交付必须快速、稳定和可靠, 同时保持晶体的完整性并限制消耗。其中最成功的解决方案是高粘度微挤出喷射器, 它提供了一个连续流的液晶脂质立方相 (lcp) 跨越脉冲 x 射线光束20的流动柱.嵌入在 lcp 流中的随机取向晶体, 由 xfel 脉冲将 x 射线散射到记录衍射图的探测器上。lcp 是样品输送介质的自然选择, 因为它经常被用作 17、21、22、23等膜蛋白晶体的生长介质, 而其他高粘度载体介质24、25、26、27、28、29、30 和可溶性蛋白质31也被用于注射器中。sfx 与高粘度喷射器已成功地在结构测定膜蛋白 13,32包括 g 蛋白耦合受体 (gpcr)33,34, 35、36、37, 数据质量足以满足本地阶段38、39 的要求, 同时同时具有时间和样本效率。目前, 这些喷油器在同步加速器源 28、30、40、41以及技术上更经常地用于室温测量。在 xfels9、10、13、42上需要tr-sfx 实验。
可比较的 tr-sfx 实验是使用其他喷射器类型进行的, 如液相输送在流量聚焦喷嘴 6,7, 12, 然而, 这种方法需要蛋白质量不能提供给许多生物上有趣的目标。据报告, 在使用粘性挤出的情况下, 每 10, 000个指数化衍射模式平均消耗0.72 毫克蛋白质, 而液体喷射喷嘴的平均消费量为9.35 毫克 (即样品增加约 130倍)效率)20。高粘度喷油器已被证明是 TR-SFX 的一个可行的样品输送装置, 而只是牺牲了其中的一部分样品效率43。例如, 在 nogly 等人 (2018年)10中, 样本消费量约为每 10, 000个指数模式1.5 毫克, 这与使用 pyp 进行的类似 tr-sfx 实验相比是有利的, 该实验的平均样本消费量要高得多, 每 10, 000 人中有74毫克蛋白质索引模式 6。因此, 当可用蛋白质的数量受到限制或晶体直接生长在 lcp 中时, 高粘度喷射器具有明显的优势。
要使 tr-sfx 使用高粘度喷射器产生最可靠的数据, 需要解决几个技术问题: 流速需要保持在最小临界值以上;命中率应保持在不会使数据收集缓慢的水平 (例如, 大于 5%); 必须在没有过度中断的情况下交付样本。理想情况下, 早在计划的 tr-sfx 实验尽可能高效地使用可用 xfel 时间之前, 这些条件就已经得到满足。在合理的情况下, lcp 流的减慢可能会使探测晶体被多个光学激光脉冲激活, 并导致混合活动状态, 或探测泵浦材料时, 泵送材料预计在光束中。注塑预测试的另一个好处是, xfel 数据收集过程中的停机时间降至最低, 因为时间将减少到更换堵塞的喷嘴、更换非挤出样品和其他维护任务。
在这里, 我们提出了一种使用高粘度微挤出喷射器优化 tr-sfx 数据收集样品交付的方法。为了简单起见, 所描述的方法并不依赖于获得 x 射线源, 尽管在同步加速器波束线 29上的工作将提供有关预期命中率和晶体衍射的进一步信息。我们的协议是为了优化实验来捕获质子泵细菌-视紫红质10中的视网膜异构, 并分两个阶段进行, 从准备挤出的晶体样品开始, 然后对挤出进行监测使用高速摄像机设置。在第一阶段, 晶体满载的 lcp 与额外的 lcp、低过渡温度脂质或其他添加剂混合, 以确保最终混合物适合在不堵塞或减速的情况下输送到样品环境中。为了提高混合性能和样品均匀性, 研制了一种新型的三向注射器耦合器。第二阶段由高速摄像机记录的挤压试验组成, 直接测量挤压速度稳定性。在对视频数据进行分析后, 可以对样品制备协议进行调整, 以提高实验结果。这些过程可以调整为 tr-sfx 数据收集准备其他蛋白质, 只需进行最少的修改, 这将有助于有效利用有限的 xfel 波束时间。随着新的 xfel 设施刚刚开始运作44、45 , 并将基于注射器的串行数据收集方法转移到 28、30、40、41的同步加速器, 未来几年一定会继续为越来越广泛的蛋白质靶标的结构动力学提供令人兴奋的新见解。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="744">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Mosquito LCP Syringe Coupling</td>
			<td style="width:175px;">TTP labtech store</td>
			<td style="width:101px;">3072-01050</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 &#181;l</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td style="width:101px;">HA-81065</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 &#181;l</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td style="width:101px;">HA-81265</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Monoolein</td>
			<td style="width:175px;">Nu-Chek Prep, Inc.</td>
			<td style="width:101px;">M-239</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">7.9 MAG</td>
			<td style="width:175px;">Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td style="width:101px;">850534O</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">50% w/v PEG 2000</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:101px;">MD2-250-7</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Paraffin (liquid)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">1.07162</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">High speed camera</td>
			<td style="width:175px;">Photron</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:224px;">Photron Mini AX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">High magnification lens</td>
			<td style="width:175px;">Navitar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>12X Zoom Lens System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Three axis stage</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:101px;">PT3/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Fiber light</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:101px;">OSL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Fused silica fiber</td>
			<td style="width:175px;">Molex/Polymicro</td>
			<td style="width:101px;">TSP-505375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Lite touch ferrule</td>
			<td style="width:175px;">IDEX</td>
			<td style="width:101px;">LT-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">ASU high viscosity injector</td>
			<td style="width:175px;">Arizona State University</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HPLC pump</td>
			<td style="width:175px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:101px;">LC-20AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Electronic gas regulator</td>
			<td style="width:175px;">Proportion Air</td>
			<td style="width:101px;">GP1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving high viscosity extrusion of microcrystals for time-resolved serial femtosecond crystallography at x-ray lasers

在 x 射线自由电子激光器 (xfels) 的连续飞秒晶体学实验 (sfx) 中, 高粘度微挤出喷射器大幅降低了样品消耗。一系列使用光驱动质子泵细菌视灯相的实验进一步确定了这些注射剂作为为时间分辨的串行飞秒晶体学 (tr-sfx) 提供晶体的首选, 以解决结构变化。光激活后的蛋白质。为了获得高质量的多个结构快照, 必须收集大量数据, 并确保每个泵浦激光脉冲之间的晶体间隙。在这里, 我们详细介绍了我们如何优化细菌视紫红素微晶的挤出, 为我们最近在 linac 相干光源 (lcls) 进行的 tr-sfx 实验。该方法的目标是优化挤出, 以实现稳定和连续的流动, 同时保持高密度的晶体, 从而提高 tr-sfx 实验中收集数据的速度。我们通过使用一种新型的三向注射器耦合装置制备具有均匀分布的晶体的脂质立方相来实现这一目标, 然后根据高速对挤出稳定性的测量调整样品组成。摄像机设置。该方法可以调整, 以优化其他微晶的流动。该设置将提供给新的瑞士免费电子激光设施的用户。

此处描述的过程 (图 3) 的理想起始材料是将微晶高密度集成到喷射器的粘性载体介质中。该程序要求每个制备过程中大约有50μl 的含晶载流子。它们可以直接在 lcp 中生长, 就像这里使用的 br9, 10 一样, 例如 (图 4), 也可以使用传统蒸汽扩散设置中生长的晶体进行制备。在 ishchenko 等人 (...

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Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

时间解析的飞秒晶体学实验的成功取决于有效的样品传递。在这里, 我们描述了从高粘度微挤压喷射器中优化细菌视紫红质微晶挤出的方案。该方法依赖于样品同质化与一种新的三向耦合器和可视化与高速相机。

改进 x 射线激光时分辨序列飞秒晶体学微晶的高粘度挤出

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

该协议旨在确保在时间解析的串行晶体学实验中经常遇到的问题不会损害数据质量。这种方法的一个主要优点是它对单个晶体系统的适应性。高速摄像机挤出测试还使我们能够直接测量挤出稳定性。首先，在注射前约30分钟将50微升的结晶单醇基LCP装在100微升注射器中。对于注入真空环境，将五升 MAG 7.9 和五微升液体石蜡加载到第二个注射器的背面。垂直握住注射器，将气泡从注射器中排出。使用 MAG 7.9 和石蜡将注射器连接到标准注射器配线。然后轻轻按压柱塞，清除压入器中的空气，直到在对插针的尖端可见少量混合物。将样品注射器连接到带车的注射器对子，不要将任何空气引入样品中。通过多次通过副体将样品穿过，混合在脂质和石蜡中。接下来，在另一个100微升注射器中装载20微升预混合LCP。从配对器上取出空注射器，并使用标准注射器配对器将预混合 LCP 连接到含晶体注射器。然后，将样本通过对两个对分器传递 100 次。要将样品进入立方相，请加入三个单醇微升，混合50次。重复此过程，直到形成透明相，以避免单烯过量。作为样品刚度和挤出性的初步测试，将空注射器从注射器对子中分离开，并垂直握住注射器，通过注射器挤压少量取样器。如果拉伸样品形成直立圆柱体，则样品已准备好进行拉伸测试。通过添加更多预混料 LCP，将样品的总体积调整为 100 微升。将样品注射器和两个空注射器连接到三向注射器对子上。将一半样品传递到第二个注射器中，然后同时将样品的两半压入第三个注射器中，至少混合50次。将含有混合样品的注射器放在立体显微镜下，以验证晶体的均匀分布。净化 HPLC 泵和所有水管，确保流量准确。然后，清除喷油器的液压阶段。接下来，打开相机并连接到随附的软件。运行实时视频以进行视觉反馈时，将喷嘴尖端放在框架中心，然后通过三轴舞台对焦。将摄像机的帧速率设置为每秒 1，000 帧。然后，将分辨率设置为 512 x 512 像素。现在，曝光时间由帧速率设置，调整照明水平，直到喷嘴可见。重新定位喷嘴尖端，使喷嘴从左到右居，位于框架的三分之一以上。在时间推移模式下设置摄像机。将间隔设置为 30 秒，重复设置为 40 次。将触发模式设置为随机。并输入要记录的帧数为 1，000。现在，将储液罐装载 20 微升的测试样品，并连接毛细管喷嘴。将填充的储液罐连接到喷油器。然后，将气体管路连接到喷嘴上的端口，然后启动气体流。在此之后，同时启动泵和摄像机录制。监控挤出，直到泵压力在接近预期结束时间时急剧上升。然后，停止记录，关闭泵，通过打开安全阀释放系统压力。之后，使用分析软件打开视频文件并校准测量工具。在视频中查找在拉伸中可见可跟踪特征的帧。记录帧编号。接下来，将视频前进到显示相同要素但已移出上一步中其位置的帧。记录帧编号。使用直线测量工具，通过分析测量测量与要素起点和终点的距离。对视频的每个部分重复上述步骤几次。最后，绘制数据系列。此处所述步骤的理想起始材料是将高密度微晶体并入喷油器的粘性载体介质中。蛋白质晶体用于收集关于质子泵送细菌罗多普辛的 TRSFX 数据，该数据揭示了光子吸收后发生的超快变化。使用三向对子器制备样品后，对注射器中的材料进行目视检查，显示样品均匀性。显微镜图像可以确认晶体的密度。当输送介质清晰、粘稠时，样品处于立方相。浊性混合物表明样品处于海绵或跛脚阶段，但并不是决定性的，因为高晶体密度可能会掩盖LCP的清晰度。通过将注射器柱塞从样品中拉出，可以进行低压测试以识别海绵相。在喷射测试期间，样品应挤出以几乎恒定速度移动的长连续 LCP 列。在滴水模式下运行的样本表示粘度太低。来自形成列的样本的数据应显示挤出保持高于实验参数规定的最小速度。使用该协议进行优化后，可以在专家设施收集时间解析串行晶体学数据。这将揭示整个蛋白质在执行其功能时的构象变化。

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