Name: improving high viscosity extrusion of microcrystals for time-resolved serial femtosecond crystallography at x-ray lasers
Uploaded: 2019-02-28T14:30:00
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Nous reconnaissons Gebhard Schertler, Rafael Abela et Chris Milne pour favoriser l’utilisation des injecteurs haute viscosité à la PSI. Richard Neutze et son équipe sont reconnus pour des discussions sur la résolution temporelle de cristallographie et livraison d’échantillon à l’aide d’injecteurs haute viscosité. Soutien financier, nous reconnaissons la Swiss National Science Foundation pour subventions 31003A_141235, 31003A_159558 (à J.S.) et PZ00P3_174169 (pour avis). Ce projet a été financé par la recherche Horizon 2020 de l’Union européenne et le programme d’innovation en vertu de la subvention de Marie-Curie-Sklodowska accord N° 701646.

1. préparation des échantillons de Crystal protein
<ol><li>Environ 30 min avant que l’échantillon doit être injecté, charge 50 µL de cristal-laden monooléine base LCP dans une seringue en 100 µL.</li>
	<li>Pour injection à la pression atmosphérique : charge 10 µL de paraffine liquide à l’arrière d’une deuxième seringue. En tenant la seringue verticalement, expulser les bulles d’air de la seringue.<ol>
<li>Pour l’injection dans l’environnement sous vide : charge 5 µL de MAG 7,9 et 5 µL de p...

La méthode TR-SFX avec l’injecteur d’extrusion visqueuse s’est avéré pour être une technique viable pour les études de dynamique des structures de bactériorhodopsine9,10 et photosystème II13 et semble désormais prête à étudier des protéines conduisant l’autre certains processus biologiques photo comme transport ionique axée sur la lumière ou de la perception sensorielle5,<sup class="...

Femtoseconde série cristallographie (SFX) est une technique de biologie structurale qui exploite les propriétés uniques des rayons x lasers à électrons libres (XFEL) afin de déterminer les structures de la température ambiante des milliers de cristaux de taille micrométrique tout en semant la plupart des les dommages de rayonnement par la « diffraction avant destruction » principe1,2,3.
Dans une extension temporelle de SFX (TR-SFX), les impulsions femtoseconde de XFEL sont utilisées pour étudier les changements structurels en protéines4,5. La protéine d’intérêt est activée avec un laser optique (ou une autre activité trigger) juste avant d’être abattu par XFEL dans une installation de pompe-sonde. Par précisément contrôler le délai entre les impulsions de la pompe et la sonde, la protéine cible peut être capturée dans des États différents. Films moléculaires des changements structuraux onze ordres de grandeur dans le temps de démontrer la puissance des nouvelles sources XFEL pour étudier la dynamique de plusieurs protéines cibles6,7,8,9, 10,11,12,13. Principalement, la méthode rejoint les techniques structurelles dynamiques spectroscopiques et statiques en un seul, fournissant un aperçu dans la dynamique des protéines à près de résolution atomique.
Des systèmes simples pour TR-SFX peuvent contenir un déclencheur endogène d’activation avec un composant photosensibles comme rétinienne à la bactériorhodopsine (bR)9,10, les chromophores photosystème II12,13, protéine jaune photoactif (PP)6,7 réversible ayant protéine fluorescente11, ou un photolyzable le monoxyde de carbone dans la myoglobine8. Excitant les variations de la technique encore en développement dépendent du mix et injectent des schémas14,15 , afin d’étudier les réactions enzymatiques ou un champ électrique utilisé pour induire des changements structurels16. Étant donné que les sources XFEL seulement existent depuis quelques années et en extrapolant au-delà de succès dans l’avenir, la méthode montre potentielle comme un vrai jeu-changeur en ce qui concerne notre compréhension de la façon dont la fonction de protéines.
Parce que les échantillons biologiques sont détruites par une seule exposition à une forte puissance impulsion XFEL, nouvelles approches pour la cristallographie des protéines ont été nécessaires. Parmi ces procédures, la capacité de croître de grandes quantités de microcristaux uniforme devait être développés17,18,19. Pour activer la collecte de données à un XFEL, ces cristaux doit être livrés, mis au rebut et ensuite renouvelé à chaque impulsion XFEL. Étant donné que XFELs feu utilisables impulsions à 10 à 120 Hz, livraison d’échantillon doit être rapide, stable et fiable, tout en également maintenant les cristaux intacte et limitante la consommation. Parmi les solutions les plus réussies est un injecteur de micro-extrusion de haute viscosité, qui délivre un très streaming radiographie faisceau pulsé20colonne de température ambiante chargés de cristal lipidique phase cubique (LCP). Les cristaux orientés au hasard, intégré dans le flux de la LCP, qui sont interceptés par l’éparpillement d’impulsions XFEL radiographies sur un détecteur où un patron de diffraction est enregistré. LCP est un choix naturel pour une moyenne de livraison échantillon tel qu’il est fréquemment utilisé comme un milieu de croissance pour membrane protein cristaux17,21,22,23, encore d’autres support de haute viscosité 24,25,26,27,28,29,30 et31 de la protéines solubles ont également été utilisés dans l’injecteur. SFX avec l’injecteur haute viscosité a réussi au cours de la détermination de la structure de la membrane protéines13,32 dont G (RCPG) des récepteurs couplés aux protéines33,34, 36, 35,37, avec la qualité des données suffisante pour native "phasage"38,39 tout en étant à temps et l’échantillon efficace. Actuellement, ces injecteurs sont plus couramment utilisés pour les mesures de la température ambiante à rayonnement synchrotron sources28,30,40,41 ainsi que pendant plus techniquement exigeant des expériences de TR-SFX à XFELs9,10,13,,42.
Des expériences de TR-SFX comparables ont été réalisées en utilisant d’autres types d’injecteur comme phase liquide livraison dans un flux axé buse6,7,12, cependant, cette méthode nécessite des quantités de protéines n’est pas disponibles pour un grand nombre cibles intéressantes sur le plan biologique. Pour la détermination des structures statiques à l’aide de l’extrusion visqueuse une consommation moyenne de 0,072 mg de protéines par diffraction de 10 000 indexé par rapport à 9,35 mg pour le jet de liquid les buses ont été signalés (c'est-à-dire, environ 130 fois plus d’échantillon efficace)20. L’injecteur haute viscosité s’est avéré être un dispositif d’administration échantillon viable pour TR-SFX tout en seulement sacrifiant certains de cet échantillon efficacité43. Dans Nogly et coll. (2018)10, par exemple, consommation d’échantillon était environ 1,5 mg par 10 000 modèles indexées, qui se compare favorablement à des expériences similaires de TR-SFX en utilisant le PP où la consommation moyenne d’échantillon était beaucoup plus élevée avec 74 mg de protéine pour 10 000 habitants 6de patrons indexée. Injecteurs de haute viscosité ont donc des avantages manifestes lorsque la quantité de protéines disponibles est limité, ou lorsque les cristaux est cultivées directement en LCP.
Pour TR-SFX en utilisant haute viscosité injecteurs de céder les données plus fiables plusieurs questions techniques doivent être abordés : la vitesse d’écoulement doit rester supérieur à une valeur critique minimale ; le taux de succès doit être maintenu à un niveau qui ne rend pas la collecte de données lente (par exemple, supérieure à 5 %) ; et l’échantillon doit être livré sans perturbations excessives. Idéalement, ces conditions sont déjà remplies bien avant une expérience TR-SFX régulier d’utiliser le temps disponible de XFEL aussi efficacement que possible. Exploitation, un ralentissement du flux de LCP peut permettre de sonder les cristaux qui ont été activés avec plus d’une impulsion laser optique et provoquer des États actifs mixtes, ou matériau pompé de palpage lorsqu’umpumped matériel est attendu dans le faisceau. Un autre avantage d’injection pré-test est que les temps d’arrêt au cours de la collecte de données à un XFEL est minimisée comme temps relégué au remplacement des injecteurs bouchés, changeant des échantillons non-extrusion, et autres tâches de maintenance est réduite.
Nous présentons ici une méthode pour optimiser la livraison d’échantillon pour la collecte de données TR-SFX avec un injecteur de micro-extrusion de haute viscosité. Pour plus de simplicité, les méthodes décrites ne comptent pas sur l’accès à une source de rayons x, même si le travail à une source de rayonnement de synchrotron29 pourrait fournir des informations complémentaires sur le taux de succès escomptés et diffraction de cristal. Nos protocoles ont été développés pour optimiser les expériences pour capturer une isomérisation rétinienne dans la pompe à protons bactériorhodopsine10 et sont réalisés en deux phases, commençant par la préparation des échantillons de cristaux pour l’extrusion suivie par l’extrusion de surveillance en utilisant une configuration de caméra à grande vitesse. Dans la première phase, le LCP chargés de cristal est mélangé avec LCP supplémentaire, lipides de transition basse température ou d’autres additifs pour assurer que le mélange final est adapté pour la livraison dans l’environnement de l’échantillon sans colmatage ou ralentissement. Un nouveau coupleur seringue trois voies a été développé pour améliorer l’homogénéité mélange de performance et d’échantillon. La deuxième phase se compose d’un test d’extrusion enregistré par une caméra rapide de mesurer directement la stabilité de vitesse d’extrusion. Suite à l’analyse des données vidéo, effectuer le réglage du protocole de préparation d’échantillon pour améliorer les résultats expérimentaux. Ces procédures peuvent être adaptés pour préparer d’autres protéines pour la collecte de données TR-SFX, avec des modifications minimes et contribueront à une utilisation efficace des beamtime XFEL limitée. Avec de nouvelles installations XFEL juste de commencer leur opération44,45 et le transfert des méthodes de collecte de données série axée sur l’injecteur à synchrotrons28,30,40,41 , les années à venir sûrement continuera à fournir passionnantes nouvelles connaissances sur la dynamique structurale d’une gamme toujours plus grande des protéines cibles.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="744">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Mosquito LCP Syringe Coupling</td>
			<td style="width:175px;">TTP labtech store</td>
			<td style="width:101px;">3072-01050</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 &#181;l</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td style="width:101px;">HA-81065</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 &#181;l</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td style="width:101px;">HA-81265</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Monoolein</td>
			<td style="width:175px;">Nu-Chek Prep, Inc.</td>
			<td style="width:101px;">M-239</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">7.9 MAG</td>
			<td style="width:175px;">Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td style="width:101px;">850534O</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">50% w/v PEG 2000</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:101px;">MD2-250-7</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Paraffin (liquid)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">1.07162</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">High speed camera</td>
			<td style="width:175px;">Photron</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:224px;">Photron Mini AX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">High magnification lens</td>
			<td style="width:175px;">Navitar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>12X Zoom Lens System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Three axis stage</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:101px;">PT3/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Fiber light</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:101px;">OSL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Fused silica fiber</td>
			<td style="width:175px;">Molex/Polymicro</td>
			<td style="width:101px;">TSP-505375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Lite touch ferrule</td>
			<td style="width:175px;">IDEX</td>
			<td style="width:101px;">LT-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">ASU high viscosity injector</td>
			<td style="width:175px;">Arizona State University</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HPLC pump</td>
			<td style="width:175px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:101px;">LC-20AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Electronic gas regulator</td>
			<td style="width:175px;">Proportion Air</td>
			<td style="width:101px;">GP1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving high viscosity extrusion of microcrystals for time-resolved serial femtosecond crystallography at x-ray lasers

Haute viscosité micro-extrusion injecteurs ont considérablement réduit la consommation d’échantillon de série femtoseconde cristallographique expériences (SFX) à rayons x lasers à électrons libres (XFELs). Une série d’expériences à l’aide de la bactériorhodopsine de pompe de proton axée sur la lumière ont créé davantage ces injecteurs comme une option privilégiée pour fournir des cristaux pour femtoseconde série temporelle de cristallographie (TR-SFX) résoudre les changements structurels de protéines après photoactivation. Pour obtenir plusieurs instantanés structurels de haute qualité, il est essentiel de recueillir de grandes quantités de données et d’assurer le dégagement de cristaux entre chaque impulsion de laser de pompe. Ici, nous décrivons en détail comment nous avons optimisé l’extrusion de microcristaux de bactériorhodopsine pour nos récentes expériences de TR-SFX à la Source de lumière cohérente Linac (L.I.C.). L’objectif de la méthode consiste à optimiser l’extrusion pour un débit stable et continue tout en conservant une forte densité de cristaux pour augmenter le taux à laquelle les données peuvent être collectées dans un TR-SFX expérimenter. Nous atteindre cet objectif en préparation lipidique phase cubique avec une répartition homogène des cristaux avec une seringue trois voies roman périphérique suivie d’ajuster la composition de l’échantillon basée sur la mesure de la stabilité de l’extrusion prise avec une haute vitesse de couplage configuration de la caméra. La méthode peut être adaptée pour optimiser le flux des autres microcristaux. Le programme d’installation sera disponible pour les utilisateurs de la nouvelle installation Suisse Laser à électrons libres.

Le produit de départ idéal pour les procédures décrites ici (Figure 3) sont des densités élevées de microcristaux incorporé dans le milieu visqueux porteur pour l’injecteur. La procédure nécessite environ 50 µL du transporteur en charge de cristal pour chaque préparation. Ceux-ci peuvent être cultivés directement en LCP comme avec le bR9,10 utilisé ici, à titre d’exemple (<strong c...

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Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Le succès d’une expérience de cristallographie femtoseconde série temporelle est tributaire de la livraison d’échantillon efficace. Nous décrivons ici les protocoles afin d’optimiser l’extrusion de microcristaux de bactériorhodopsine par un injecteur de micro-extrusion de haute viscosité. La méthodologie s’appuie sur l’homogénéisation des échantillons avec un coupleur de trois voies nouvel et de visualisation avec une caméra à haute vitesse.

Amélioration d’Extrusion de haute viscosité de microcristaux de Time-resolved série femtoseconde cristallographie à rayons x Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Ce protocole a été conçu pour s’assurer que les problèmes fréquemment rencontrés lors d’expériences cristallographiques en série résolues dans le temps ne compromettent pas la qualité des données. Un avantage majeur de cette méthode est son adaptabilité aux systèmes de cristal individuels. Le test d’extrusion de caméra à grande vitesse nous permet également de mesurer directement la stabilité de l’extrusion.Tout d’abord, chargez 50 microlitres de LCP à base de monoléine cristalladen dans une seringue de 100 microlitres environ 30 minutes avant l’injection. Pour l’injection dans un environnement de vide, chargez cinq microlitres de MAG 7.9 et cinq microlitres de paraffine liquide dans le dos d’une deuxième seringue. En tenant la seringue verticalement, expulser les bulles d’air de la seringue.Connectez la seringue avec MAG 7.9 et la paraffine à un coupler standard de seringues. Et purger l’air du coupler en appuyant doucement sur le piston jusqu’à ce qu’un petit volume du mélange soit visible à l’extrémité de l’aiguille du coupler. Connectez la seringue de l’échantillon au coupler seringue prenant la voiture pour ne pas introduire d’air dans l’échantillon.Incorporer le lipide et la paraffine en passant l’échantillon à travers le coupler plusieurs fois. Ensuite, chargez 20 microlitres de LCP préméxé dans une autre seringue de 100 microlitres. Retirez la seringue vide du coupler et attachez le LCP préméxé au cristal contenant de la seringue à l’aide d’un coupler standard de seringues.Ensuite, passez l’échantillon à travers le coupler 100 fois. Pour amener l’échantillon dans la phase cubique, ajouter trois microlitres de monoléine et mélanger 50 fois. Répétez cette procédure jusqu’à ce qu’une phase transparente se soit formée pour éviter un excès de monoléine.Comme test préliminaire pour la rigidité et l’extrudabilité de l’échantillon, détachez la seringue vide du coupler de seringues et maintenez la seringue verticalement, pressez une petite quantité d’échantillonneur à travers le coupler. Si l’échantillon extrudé forme un cylindre droit, alors l’échantillon est prêt pour le test d’extrusion. Ajustez le volume total de l’échantillon à 100 microlitres en ajoutant plus de LCP préméxé.Attachez la seringue de l’échantillon et deux seringues vides au coupler à seringues à trois sens. Mélanger au moins 50 fois en passant la moitié de l’échantillon dans la deuxième seringue, puis en appuyant simultanément sur les deux moitiés de l’échantillon dans la troisième seringue. Placez la seringue contenant l’échantillon mixte sous un microscope stéréo pour vérifier une distribution homogène de cristaux.Purgez une pompe HPLC et toutes les conduites d’eau pour vous assurer que les débits sont exacts. Ensuite, purgez le stade hydraulique de l’injecteur. Ensuite, allumez et connectez la caméra au logiciel fourni.Avec une vidéo en direct en cours d’exécution pour la rétroaction visuelle, placez la pointe de la buse au centre du cadre et mettre au point avec l’étape à trois axes. Réglez la vitesse d’image sur la caméra à 1000 images par seconde. Ensuite, réglez la résolution à 512 par 512 pixels.Avec le temps d’exposition maintenant défini par le taux d’image, ajustez le niveau d’éclairage jusqu’à ce que la buse soit visible. Repositionnez la pointe de la buse de sorte qu’elle soit centrée de gauche à droite et qu’elle soit située dans le tiers supérieur du cadre. Configurez la caméra en mode time lapse.Réglez l’intervalle à 30 secondes et les répétitions à 40 fois. Réglez le mode déclencheur au hasard. Et entrez le nombre d’images pour enregistrer à 1000.Maintenant, chargez le réservoir avec 20 microlitres de l’échantillon d’essai et fixez la buse capillaire. Fixez le réservoir rempli à l’injecteur. Ensuite, fixez la conduite de gaz au port sur la buse et démarrez le flux de gaz.Par la suite, démarrez simultanément la pompe et l’enregistrement de la caméra. Surveillez l’extrusion jusqu’à ce que la pression de la pompe monte brusquement près de l’heure de fin prévue. Ensuite, arrêtez d’enregistrer, éteignez la pompe et évacuez la pression du système en ouvrant la soupape de secours.Par la suite, ouvrez le fichier vidéo avec le logiciel d’analyse et calibrez les outils de mesure. Trouvez un cadre dans la vidéo où il y a une fonction trackable visible dans l’extrusion. Enregistrez le numéro du cadre.Ensuite, avancez la vidéo vers un cadre où la même fonctionnalité est visible, mais a déménagé de sa position dans l’étape précédente. Enregistrez le numéro du cadre. À l’aide de l’outil de mesure en ligne droite, mesurez la distance entre le point de départ et de fin de la fonctionnalité par mesure d’analyse.Répétez les étapes précédentes plusieurs fois pour chaque segment de la vidéo. Enfin, tracez la série de données. Le matériau de départ idéal pour la procédure décrite ici est une densité élevée de microcrystals incorporés dans un support visqueux pour l’injecteur.Des cristaux de protéine ont été utilisés pour recueillir des données trsfx sur la rhodopsine de bactéries pompées de proton, qui a indiqué les changements ultra rapides qui se produisent après absorption de photons. Après la préparation de l’échantillon à l’aide d’un coupler à trois, l’inspection visuelle du matériau dans la seringue montre l’homogénéité de l’échantillon. Et les images au microscope peuvent confirmer la densité des cristaux.L’échantillon est en phase cubique lorsque le milieu de livraison est clair et visqueux. Les mélanges turbides sont une indication que l’échantillon est en phase éponge ou lamelle, mais ne sont pas concluants car une forte densité cristalline peut obscurcir la clarté du LCP. Un test de basse pression pour identifier la phase de l’éponge peut être effectué en tirant le piston de seringue loin de l’échantillon.Pendant l’essai de jet, l’échantillon devrait extruder une longue colonne continue de LCP qui se déplace à une vitesse presque constante. Les échantillons qui s’exécutent en mode goutte à goutte indiquent que la viscosité est trop faible. Les données des échantillons qui forment une colonne doivent montrer que l’extrusion reste au-dessus d’une vitesse minimale dictée par les paramètres expérimentaux.Après optimisation à l’aide de ce protocole, les données cristallographiques en série résolvant le temps peuvent être collectées dans une installation spécialisée. Ceci révélera les changements conformationnels dans la protéine entière pendant qu’elle exécute sa fonction.

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