Name: improving high viscosity extrusion of microcrystals for time-resolved serial femtosecond crystallography at x-ray lasers
Uploaded: 2019-02-28T14:30:00
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Wir erkennen Gebhard Schertler, Rafael Abela und Chris Milne zur Unterstützung des Einsatzes von hoher Viskosität Injektoren am PSI. Richard Neutze und sein Team sind für Diskussionen über die zeitaufgelöste Kristallographie und Probeneingang mit hoher Viskosität Injektoren anerkannt. Für die finanzielle Unterstützung, wir erkennen den Schweizerischen Nationalfonds für Zuschüsse 31003A_141235, 31003A_159558 (zu j.s.) und PZ00P3_174169 (um P.N.). Dieses Projekt wird finanziell von der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm unter Marie Sklodowska-Curie-Stipendium Vereinbarung Nr. 701646.

(1) Protein Crystal Probenvorbereitung
<ol><li>Ca. 30 min vor die Probe injiziert werden, basieren Last 50 µL Kristall-beladenen Monoolein LCP in einer 100 µL Spritze.</li>
	<li>Für die Injektion bei Atmosphärendruck: Last 10 µL Paraffinöl in die Rückseite einer zweiten Spritze. Vertreiben Sie die Spritze senkrecht halten, die Luftblasen aus der Spritze.<ol>
<li>Für die Injektion in Vakuum: Last 5 µL MAG 7,9 und 5 µL Paraffinöl in die Rückseite einer zweiten Spritze. Vertreiben Sie die Spritze senkrecht hal...

Die TR-SFX-Methode mit dem zähflüssigen Extrusion Injector erweist sich eine praktikable Technik für Strukturdynamik Studien Bakteriorhodopsin9,10 und Photosystem II13 und jetzt scheint bereit, fahren andere Proteine zu studieren Foto biologischen Prozessen wie lichtgetriebenen Ionentransport oder Sinneswahrnehmung5,50. Die oben beschriebenen Protokolle wurden entwickelt, um den...

Serielle Femtosekunden Kristallographie (SFX) ist eine strukturelle Biologie-Technik, die die einzigartigen Eigenschaften des Röntgen-freie-Elektronen-Laser (XFEL) auf Raumtemperatur Strukturen bestimmen nutzt aus Tausenden von Mikrometer große Kristalle während schneller als die meisten die Strahlenschäden durch den "Beugung vor Zerstörung" Prinzip1,2,3.
In einer zeitaufgelösten Verlängerung von SFX (TR-SFX) dienen der Femtosekunden-Impulse aus der XFEL, strukturelle Veränderungen in Proteine4,5zu studieren. Das Protein des Interesses ist mit einem optischen Laser (oder eine andere Aktivität Trigger) kurz vor dem Schuss von XFEL in einem Pumpe-Sonde-Setup aktiviert. Durch die präzise Steuerung die Verzögerung zwischen Pumpe und Sonde Impulsen, kann das Zielprotein in verschiedenen Staaten erfasst werden. Molekulare Filme von strukturellen Veränderungen über elf Größenordnungen in der Zeit demonstrieren die Macht der neuen XFEL-Quellen, die Dynamik von mehreren Protein Ziele6,7,8,9zu studieren, 10,11,12,13. Grundsätzlich schließt sich die Methode der dynamischen spektroskopischen und statische strukturelle Techniken ineinander, bietet einen Einblick in Proteindynamik am in der Nähe von atomarer Auflösung.
Einfache Systeme für TR-SFX enthalten eine endogene Auslöser der Aktivierung mit einer lichtempfindlichen Komponente wie Retinal in Bakteriorhodopsin (bR)9,10, die Chromophore in Photosystem II12,13, photoaktiven gelbe Protein (PYP)6,7 reversibel photoschaltbare fluoreszierendes Protein11oder eine Photolyzable Kohlenmonoxid in Myoglobin8. Spannende Varianten der Technik noch in der Entwicklung setzen auf Mischung und Regelungen14,15 enzymatischer Reaktionen oder ein elektrisches Feld verwendet, um strukturelle Veränderungen16induzieren studieren zu injizieren. Angesichts der Tatsache, dass XFEL Quellen nur ein paar Jahre lang zur Verfügung wurden und Erfolge der Vergangenheit in die Zukunft extrapolieren, die Methode potential wie ein richtiges Spiel-Wechsler in Bezug auf unser Verständnis, wie zeigt Proteine Funktion.
Da biologische Proben von einer einzigen Exposition zu einer high-Power-XFEL Puls zerstört werden, wurden neue Ansätze für die Proteinkristallographie notwendig. Die Fähigkeit, große Mengen an einheitliche Mikrokristalle wachsen musste unter diesen Verfahren entwickelten17,18,19sein. Zur Erfassung der Daten auf einem XFEL zu ermöglichen, müssen diese Kristalle geliefert, verworfen und dann für jede XFEL Puls erneuert. Angesichts der Tatsache, dass XFELs nutzbare Impulse bei 10-120 Hz Feuer, muss Musterlieferung schnell, stabil und zuverlässig, dabei auch die Kristalle intakt und Begrenzung Verbrauch. Unter den erfolgreichsten Lösungen ist ein hohe Viskosität Mikro-Extrusion Injektor, der eine kontinuierlich streaming Spalte Raumtemperatur Kristall-beladenen Lipid-kubische Phase (LCP) über die gepulste Röntgen Strahl20liefert. Zufällig orientierte Kristalle, eingebettet in der LCP-Stream, das sind von der XFEL Impulse Scatter Röntgenstrahlen auf einen Detektor, wo ein Beugungsmuster aufgezeichnet wird, abgefangen. LCP war eine natürliche Wahl für ein Probe-Lieferung-Medium, da es häufig als ein Wachstumsmedium für Membran-Protein Kristalle17,21,22,23, noch andere hohe Viskosität Trägermedien verwendet wird 24,25,26,27,28,29,30 und lösliche Proteine31 auch im Injektor verwendet wurden. SFX mit hoher Viskosität Injektor war erfolgreich bei der Strukturaufklärung von Membran Proteine13,32 einschließlich G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs)33,34, 35,36,37, mit der Datenqualität für native Phasenabgleich38,39 dabei Zeit und Probe effizient ausreichend. Derzeit, diese Injektoren werden mehr routinemäßig für Temperatur-Messungen am Synchrotron Quellen28,30,40,41 sowie während der mehr technisch anspruchsvolle TR-SFX-Experimente am XFELs9,10,13,42.
Vergleichbare TR-SFX-Experimente wurden durchgeführt mit anderen Injektor-Typen wie Flüssigphase Lieferung in einem Fluss Düse6,7,12konzentriert, jedoch erfordert diese Methode Protein Mengen nicht verfügbar für viele biologisch interessante Ziele. Zur Bestimmung der statischen Strukturen mit viskosen Extrusion einen durchschnittlichen Verbrauch von 0,072 mg Protein pro 10.000 indizierten Beugungsmuster im Vergleich zu 9,35 mg für Flüssigkeitsstrahls wurden Düsen (d. h. über 130 Mal mehr Probe gemeldet effiziente)20. Die hohe Viskosität-Injektor hat sich gezeigt, eine tragfähige Probe Abgabegerät für TR-SFX zu sein, während nur einige dieser Probe Effizienz43zu opfern. In Nogly Et Al. (2018)10, z. B. Probe Verbrauch war ca. 1,5 mg pro 10.000 indizierten Muster, die günstig im Vergleich zu ähnlichen TR-SFX-Experimenten mit PYP wo durchschnittliche Probe Verbrauch viel höher bei 74 mg Protein pro 10.000 war indizierte Muster6. Hohe Viskosität Injektoren haben somit klare Vorteile, wenn Begrenzung der Höhe des Proteins zur Verfügung oder Kristalle direkt in LCP angebaut werden.
Für TR-SFX mit hoher Viskosität Injektoren den zuverlässigsten Daten liefern mehrere technische Probleme angegangen werden müssen: die Fließgeschwindigkeit muss weiterhin über kritische Mindestwert; die Hit-Rate sollte beibehalten werden, auf einem Niveau, das nicht langsame Datenerfassung dargestellt wird (z. B. mehr als 5 %); und Probe ohne übermäßige Störungen geliefert werden. Im Idealfall werden diese Bedingungen bereits erfüllt lange vor einer geplanten TR-SFX-Experiment zu XFEL Zeit möglichst effizient zu nutzen. Pricipally, können eine Verlangsamung in der LCP-Stream, sondieren Kristalle, die mit mehreren optischen Laserpuls und Ergebnis in gemischten aktive Zustände aktiviert wurden, oder sondieren gepumpte Material, Umpumped Material in den Strahlengang erwartet wird. Ein weiterer Vorteil der Injection Pre-Tests ist, dass Ausfallzeiten während der Datenerfassung in einem XFEL als Zeit verbannt zu ersetzen verstopfte Düsen, ändern sich nicht Extrudieren Proben minimiert und andere Wartungsaufgaben wird reduziert wird.
Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Optimierung der Musterlieferung für TR-SFX-Datenerfassung mit einer hohen Viskosität Mikro-Extrusion Injektor. Der Einfachheit halber uns die beschriebenen Methoden verlassen nicht auf Zugriff auf eine Röntgenquelle, obwohl Arbeit bei einem Synchrotron Strahlrohr29 weiter über erwartete Trefferquoten und Kristall Beugung informieren würde. Unsere Protokolle wurden entwickelt, um Experimente zur Netzhaut Isomerisierung in den-Protonenpumpe Bakteriorhodopsin10 erfassen zu optimieren und erfolgt in zwei Phasen, beginnend mit Kristall Probenvorbereitung für Extrusion, gefolgt von der Überwachung der extrusion verwenden eine High-Speed-Kamera-Setup. In Phase eins wird der Kristall-beladenen LCP mit zusätzlichen LCP, niedrigen Übergang Temperatur Lipide oder andere Zusatzstoffe, um sicherzustellen, dass die endgültige Mischung für die Lieferung in die Probenumgebung geeignet ist, ohne Verstopfung oder Verlangsamung gemischt. Ein neues drei-weg-Spritze-Koppler wurde entwickelt, um die mischenden Leistungsfähigkeit und Probe Homogenität zu verbessern. Die zweite Phase besteht aus einer Extrusion Test aufgezeichnet von einer Hochgeschwindigkeitskamera der Extrusion Drehzahlstabilität direkt zu messen. Nach der Analyse die Videodaten können Anpassungen des Probe-Vorbereitung-Protokolls vorgenommen werden, um experimentelle Ergebnisse zu verbessern. Diese Verfahren können angepasst werden, um andere Proteine für TR-SFX-Datenerhebung, mit minimalen Änderungen vorzubereiten und werden dazu beitragen, die effiziente Nutzung der begrenzten XFEL Strahlzeit. Mit neuen XFEL-Einrichtungen, die gerade erst ihren Betrieb44,45 und die Übertragung der Injektor-basierte serielle Methoden der Datenerhebung an Synchrotrons28,30,40,41 , die nächsten Jahre werden sicherlich weiterhin spannende neue Einblicke in die strukturelle Dynamik von ein immer breiteres Spektrum an Protein-Targets.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="744">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Mosquito LCP Syringe Coupling</td>
			<td style="width:175px;">TTP labtech store</td>
			<td style="width:101px;">3072-01050</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 &#181;l</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td style="width:101px;">HA-81065</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 &#181;l</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td style="width:101px;">HA-81265</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Monoolein</td>
			<td style="width:175px;">Nu-Chek Prep, Inc.</td>
			<td style="width:101px;">M-239</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">7.9 MAG</td>
			<td style="width:175px;">Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td style="width:101px;">850534O</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">50% w/v PEG 2000</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:101px;">MD2-250-7</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Paraffin (liquid)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">1.07162</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">High speed camera</td>
			<td style="width:175px;">Photron</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:224px;">Photron Mini AX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">High magnification lens</td>
			<td style="width:175px;">Navitar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>12X Zoom Lens System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Three axis stage</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:101px;">PT3/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Fiber light</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:101px;">OSL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Fused silica fiber</td>
			<td style="width:175px;">Molex/Polymicro</td>
			<td style="width:101px;">TSP-505375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Lite touch ferrule</td>
			<td style="width:175px;">IDEX</td>
			<td style="width:101px;">LT-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">ASU high viscosity injector</td>
			<td style="width:175px;">Arizona State University</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HPLC pump</td>
			<td style="width:175px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:101px;">LC-20AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Electronic gas regulator</td>
			<td style="width:175px;">Proportion Air</td>
			<td style="width:101px;">GP1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving high viscosity extrusion of microcrystals for time-resolved serial femtosecond crystallography at x-ray lasers

Hoher Viskosität Mikro-Extrusion Injektoren haben dramatisch Probe in seriellen Femtosekunden kristallographischen Experimente (SFX) auf Röntgen-freie-Elektronen-Laser (XFELs) reduziert. Eine Reihe von Experimenten mit der lichtgetriebenen Proton Pumpe Bakteriorhodopsin haben als bevorzugte Option Kristalle für serielle Femtosekunden zeitaufgelöste Kristallographie (TR-SFX) strukturelle Veränderungen des aufzulösenden liefern diese Injektoren festgestellt Proteine nach Photoaktivierungen. Um mehrere strukturelle Momentaufnahmen von hoher Qualität zu erhalten, ist es wichtig, große Mengen an Daten zu sammeln und Abfertigung der Kristalle zwischen jedem Laserpuls Pumpe zu gewährleisten. Hier beschreiben wir ausführlich, wie wir die Extrusion von Bakteriorhodopsin Mikrokristalle für unsere jüngsten TR-SFX-Experimente an Linac kohärentes Licht Quelle (LCLS) optimiert. Das Ziel der Methode ist es, Extrusion für eine stabile und kontinuierliche Strömung unter Beibehaltung einer hohen Dichte von Kristallen, die Rate zu erhöhen optimieren experimentieren, auf welche Daten in einem TR-SFX aufgefangen werden können. Dieses Ziel erreichen wir durch die Ausarbeitung von Lipid-kubische Phase mit einer homogenen Verteilung der Kristalle mit einer neuartigen Dreiwege Spritze Gerät gefolgt durch Anpassen der Probenzusammensetzung basierend auf Messungen der Extrusion Stabilität genommen mit einer Highspeed-Kupplung Kamera-Setup. Die Methodik kann den Fluss der anderen Mikrokristalle optimieren angepasst werden. Das Setup wird für die Nutzer der neuen Schweizer freie-Elektronen-Laser-Anlage zur Verfügung.

Das ideale Ausgangsmaterial für die hier beschriebenen Verfahren (Abbildung 3) sind hohe Dichten von Mikrokristalle in viskosen Trägermedium für die Einspritzdüse integriert. Das Verfahren erfordert etwa 50 µL Kristall beladenem Träger für jede Zubereitung. Diese können direkt im LCP als mit dem bR-9,-10 diente hier als Beispiel (Abbildung 4), oder Kristalle gewac...

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Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Der Erfolg eines seriellen Femtosekunden zeitaufgelöste Kristallographie Experiments ist effiziente Musterlieferung abhängig. Hier beschreiben wir Protokolle, um die Extrusion von Bakteriorhodopsin Mikrokristalle aus eine hohe Viskosität Mikro-Extrusion Injektor zu optimieren. Die Methodik setzt auf Probe Homogenisierung mit einem neuartigen Dreiwege Kupplung und Visualisierung mit einer Highspeed-Kamera.

Verbesserung der hohen Viskosität Extrusion der Mikrokristalle für zeitaufgelöste serielle Femtosekunden Kristallographie an x-ray Laser

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um sicherzustellen, dass Probleme, die häufig bei zeitaufgelösten seriellen kristallographischen Experimenten auftreten, die Datenqualität nicht beeinträchtigen. Ein großer Vorteil dieser Methode ist ihre Anpassungsfähigkeit an einzelne Kristallsysteme. Der Hochgeschwindigkeitskamera-Extrusionstest ermöglicht es uns auch, die Extrusionsstabilität direkt zu messen.Laden Sie zunächst 50 Mikroliter kristallbeladenes Monoolein-basiertes LCP in eine 100-Mikroliter-Spritze etwa 30 Minuten vor der Injektion. Zur Injektion in eine Vakuumumgebung fünf Mikroliter MAG 7.9 und fünf Mikroliter flüssiges Paraffin in den Rücken einer zweiten Spritze laden. Halten Sie die Spritze vertikal, vertreiben Sie die Luftblasen aus der Spritze.Schließen Sie die Spritze mit MAG 7.9 und Paraffin an einen Standardspritzenkoppler an. Und spülen Sie die Luft aus der Kupplung, indem Sie sanft auf den Kolben drücken, bis ein kleines Volumen der Mischung an der Spitze der Kupplungsnadel sichtbar ist. Schließen Sie die Probenspritze an den Spritzenkoppler an, der das Auto nimmt, um keine Luft in die Probe einzuführen.Mischen Sie das Lipid und Paraffin, indem Sie die Probe durch den Koppler mehrmals. Als nächstes 20 Mikroliter vorgemischtel LCP in eine weitere 100-Mikroliter-Spritze laden. Entfernen Sie die leere Spritze aus der Kupplung und befestigen Sie den vorgemischten LCP mit einem Standardspritzenkoppler an der kristallhaltigen Spritze.Dann passieren Sie die Probe durch die Kupplung 100 Mal. Um die Probe in die kubische Phase zu bringen, fügen Sie drei Mikroliter Monoolein hinzu und mischen Sie 50 Mal. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis sich eine transparente Phase gebildet hat, um einen Überschuss an Monoolein zu vermeiden.Als Vortest für Probensteifigkeit und Extrudierbarkeit, lösen Sie die leere Spritze aus dem Spritzenkoppler, und halten Sie die Spritze vertikal, drücken Sie eine kleine Menge Sampler durch den Koppler. Wenn die extrudierte Probe einen aufrechten Zylinder bildet, ist die Probe für extrusionsreife Tests bereit. Passen Sie das Gesamtvolumen der Probe auf 100 Mikroliter an, indem Sie mehr vorgemischteLCP hinzufügen.Befestigen Sie die Probenspritze und zwei leere Spritzen an der Drei-Wege-Spritzenkupplung. Mindestens 50 Mal mischen, indem Sie die Hälfte der Probe in die zweite Spritze geben und dann beide Hälften der Probe gleichzeitig in die dritte Spritze drücken. Legen Sie die Spritze mit der gemischten Probe unter ein Stereomikroskop, um eine homogene Verteilung der Kristalle zu überprüfen.Reinigen Sie eine HPLC-Pumpe und alle Wasserleitungen, um sicherzustellen, dass die Durchflussmengen genau sind. Reinigen Sie dann die hydraulische Stufe des Injektors. Schalten Sie als Nächstes die Kamera ein, und schließen Sie sie an die mitgelieferte Software an.Mit einem Live-Video, das für visuelles Feedback läuft, positionieren Sie die Düsenspitze in der Mitte des Rahmens und bringen Sie sie mit der dreiachsigen Bühne in den Fokus. Legen Sie die Bildrate auf der Kamera auf 1.000 Bilder pro Sekunde fest. Legen Sie dann die Auflösung auf 512 x 512 Pixel fest.Wenn die Belichtungszeit nun durch die Bildrate eingestellt ist, stellen Sie die Beleuchtungsstärke ein, bis die Düse sichtbar ist. Positionieren Sie die Düsenspitze so, dass sie nach links nach rechts zentriert ist und sich im oberen Drittel des Rahmens befindet. Richten Sie die Kamera im Zeitraffermodus ein.Stellen Sie das Intervall auf 30 Sekunden und die Wiederholungen auf 40 Mal ein. Legen Sie den Triggermodus auf zufällig fest. Geben Sie die Anzahl der aufzuzeichnenden Frames auf 1 000 ein.Laden Sie nun das Reservoir mit 20 Mikrolitern der Testprobe und befestigen Sie die Kapillardüse. Befestigen Sie das gefüllte Reservoir am Injektor. Befestigen Sie dann die Gasleitung am Anschluss an der Düse und starten Sie den Gasstrom.Starten Sie anschließend gleichzeitig die Pumpe und die Kameraaufnahme. Überwachen Sie die Extrusion, bis der Pumpendruck in der Nähe der erwarteten Endzeit stark ansteigt. Beenden Sie dann die Aufnahme, schalten Sie die Pumpe ab, und entlüften Sie den Systemdruck, indem Sie das Entlastungsventil öffnen.Öffnen Sie anschließend die Videodatei mit der Analysesoftware und kalibrieren Sie die Messwerkzeuge. Suchen Sie einen Frame im Video, in dem ein nachvollziehbares Feature in der Extrusion sichtbar ist. Zeichnen Sie die Framenummer auf.Als Nächstes leiten Sie das Video zu einem Frame weiter, in dem dasselbe Feature sichtbar ist, sich aber im vorherigen Schritt von seiner Position verschoben hat. Zeichnen Sie die Framenummer auf. Messen Sie mit dem geraden Messwerkzeug den Abstand vom Start- und Endpunkt des Features mittels Analysemessung.Wiederholen Sie die vorherigen Schritte einige Male für jedes Segment des Videos. Zeichnen Sie schließlich die Datenreihen. Das ideale Ausgangsmaterial für das hier beschriebene Verfahren sind hohe Dichten von Mikrokristallen, die in ein viskoses Trägermedium für den Injektor eingebaut sind.Proteinkristalle wurden verwendet, um TRSFX-Daten über die Protonen gepumptBakterien Rhodopsin zu sammeln, die die ultraschnellen Veränderungen, die nach photonen Absorption auftreten offenbart. Nach der Probenvorbereitung mit einem Drei-Wege-Koppler zeigt die Visuelle Inspektion des Materials in der Spritze die Homogenität der Probe. Und Mikroskopbilder können die Dichte der Kristalle bestätigen.Die Probe befindet sich in der kubischen Phase, wenn das Abgabemedium klar und zähflüssig ist. Trübungsmischungen sind ein Hinweis darauf, dass sich die Probe in einer Schwamm- oder Lamellenphase befindet, sind aber nicht schlüssig, da eine hohe Kristalldichte die Klarheit des LCP verschleiern kann. Ein Niederdrucktest zur Identifizierung der Schwammphase kann durchgeführt werden, indem der Spritzenkolben von der Probe weggezogen wird.Während des Jet-Tests sollte die Probe eine lange kontinuierliche Spalte von LCP extrudieren, die sich mit einer nahezu konstanten Geschwindigkeit bewegt. Proben, die im Tropfmodus ausgeführt werden, zeigen an, dass die Viskosität zu niedrig ist. Daten aus Stichproben, die eine Spalte bilden, sollten zeigen, dass die Extrusion über einer minimalen Geschwindigkeit bleibt, die von den experimentellen Parametern diktiert wird.Nach der Optimierung mit diesem Protokoll können serielle kristallographische Daten in einer Experteneinrichtung gesammelt werden. Dies wird die konformen Veränderungen im gesamten Protein offenbaren, während es seine Funktion erfüllt.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Vorbereitung adhärenter Zellen für die Röntgenfluoreszenzbildgebung durch chemische Fixierung

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Forschung

Chemie

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Auf dem Weg Routine Kristallstrukturbestimmung von Korrosionsprodukten auf Heritage Kunstobjekte

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Sediment Core Extrusion Method at Millimeter Resolution Using a Calibrated, Threaded-rod

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High Pressure Single Crystal Diffraction at PX^2

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Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

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