Name: improving high viscosity extrusion of microcrystals for time-resolved serial femtosecond crystallography at x-ray lasers
Uploaded: 2019-02-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers at JoVE.com

אנו להכיר Gebhard Schertler, רפאל אבלה, כריס מילן לתמיכה השימוש צמיגות גבוהה מרססים בבית PSI. ריצ'רד Neutze והצוות שלו הם הכירו לדיונים על זמן לפתור קריסטלוגרפיה ומשלוח הדגימה באמצעות מרססים צמיגות גבוהה. עבור תמיכה כספית, אנו להכיר הקרן השוויצרית הלאומית למדע עבור מענקים 31003A_141235, 31003A_159558 (ל. י. ס), PZ00P3_174169 (כדי P.N.). הפרויקט זכה למימון המחקר של האיחוד האירופי אופק 2020 ותוכנית חדשנות תחת המענק מארי-Sklodowska-קירי הסכם לא 701646.

1. חלבון הכנת הדוגמא קריסטל
<ol><li>כ 30 דקות לפני המדגם הוא כדי להיות מוזרק, טען 50 µL של monoolein עמוסי קריסטל מבוססת LCP מזרק µL 100.</li>
	<li>עבור הזרקה בלחץ אטמוספרי: עומס 10 µL של שמן פראפין לחלק האחורי של מזרק השני. מחזיק את המזרק אנכית, לגרש את בועות האוויר של המזרק.<ol>
<li>להזרקה לתוך סביבת ואקום: 5 טען µL ש?...

שיטת TR-SFX עם מזרק ההבלטה צמיגה הוכיחה להיות טכניקה מעשית ללימודי dynamics מבנית של bacteriorhodopsin9,10 ו- photosystem II13 , עכשיו נראה מוכן ללמוד חלבונים נהיגה השני תהליכים ביולוגיים תמונה כגון מונחי-אור יון תחבורה או חושית5,50. הפרו?...

קריסטלוגרפיה בפמטושניות טורי (SFX) היא טכניקה ביולוגיה מבנית המנצלת את תכונותיו הייחודיות של רנטגן לייזר אלקטרונים חופשיים (XFEL) כדי לקבוע את טמפרטורת החדר מבנים מתוך אלפי גבישים בגודל מיקרומטר תוך לעומת רוב הנזק קרינה ע י2,31,עקרון "עקיפה לפני החורבן".
סיומת זמן לפתור של SFX (TR-SFX), הפולסים הפמטו-שנייה מ XFEL משמשים ללמוד שינויים מבניים חלבונים4,5. החלבון עניין מופעל עם לייזר אופטי (או מפעיל פעילות אחרת) רגע לפני שנורה על ידי XFEL בתוך מלכודת משאבת-בדיקה. על ידי שליטה בדיוק העיכוב בין פולסים משאבת, בדיקה, ניתן ללכוד את חלבון המטרה במצבים שונים. סרטים מולקולרית של שינויים מבניים מעל 11 סדרי גודל בזמן להדגים את הכוח של מקורות XFEL חדש ללמוד את הדינמיקה של מספר חלבונים מטרות6,7,8,9, 10,11,12,13. ב־1995, השיטה מצטרף הטכניקות מבניים ספקטרוסקופיות וסטטיים דינמי לתוך אחד, המספק הצצה לתוך הדינמיקה חלבון-ליד ברזולוציה אטומית.
מערכות פשוטות עבור TR-SFX עשויים להכיל בגורם מפעיל אנדוגני של הפעלת עם מרכיב צילום רגיש כמו רשתית תוך9,bacteriorhodopsin (bR)10, הן את photosystem השנייה12,13, חלבון photoactive צהוב (PYP)6,7 הפיכה photoswitchable חלבון פלואורסצנטי11, או של חד-תחמוצת הפחמן photolyzable מיוגלובין8. וריאציות מרגש של הטכניקה עדיין בפיתוח להסתמך על תמהיל ולהזריק14,ערכות15 ללמוד אנזימטיות או שדה חשמלי המשמש לזירוז שינויים מבניים16. בהתחשב בכך מקורות XFEL היו זמינים רק במשך כמה שנים, חיוץ אחרי הצלחות לעתיד, השיטה מראה פוטנציאל אמיתי למשחקים לגבי הבנתנו כיצד הפונקציה חלבונים.
כי דגימות ביולוגיות נהרסים על ידי החשיפה יחיד בחזקה גבוהה XFEL הדופק, גישות חדשות חלבון קריסטלוגרפיה היו נחוצים. בין הניתוחים, היכולת לגדל כמויות גדולות של microcrystals אחיד צריך להיות מפותח17,18,19. כדי לאפשר איסוף נתונים-XFEL, גבישים אלו חייב להיות מסר, שנמחקו, חידש אז לכל פעימה XFEL. בהתחשב בכך XFELs אש פולסים שמישים ב- 10-120 הרץ, משלוח הדגימה חייב להיות מהיר, יציב ואמין, תוך כדי שמירה גם הקריסטלים שלמים ולא הגבלת הצריכה. בין הפתרונות המוצלחים ביותר הוא מזרק מיקרו-הבלטה צמיגות גבוהה, אשר מספק של continiously הזרמת עמודה של טמפרטורת החדר עמוסי קריסטל lipidic מעוקבים שלב (LCP) על פני קרן רנטגן פעמו20. קריסטלים מונחה באופן אקראי, מוטבע נחל כזיב LCP, נקלטים הפיזור פולסים XFEL רנטגן על גבי גלאי שבו נרשם תבנית עקיפה. LCP היה בחירה טבעית עבור מדיום משלוח הדגימה כפי הוא משמש לעתים קרובות כאמצעי לצמיחה עבור ממברנה חלבון קריסטלים17,21,22,23, מדיה נושאת עדיין אחרים צמיגות גבוהה 24,25,26,27,28,29,30 ו חלבונים מסיסים31 גם שימשו את מזרק. SFX עם מזרק צמיגות גבוהה הצליחה במהלך קביעת מבנה הממברנה חלבונים13,32 כולל G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs)33,34, 35,36,37, עם איכות הנתונים מספיק עבור ילידי בהדרגה38,39 בעת היותו בזמן והן מדגם יעיל. כיום, מרססים אלה משמשות באופן שגרתי יותר עבור מדידות טמפרטורת החדר-סינכרוטרון מקורות28,30,40,41 , כמו גם יותר טכנית בדרישה TR-SFX ניסויים ב XFELs9,10,13,42.
ניסויים TR-SFX דומות בוצעו באמצעות סוגים אחרים מזרק נוזל שלב משלוח זרם ממוקד זרבובית6,7,12, עם זאת, שיטה זו דורשת כמויות חלבון אינו זמין עבור רבים מטרות מעניינות מבחינה ביולוגית. מצפני מבנים סטטי באמצעות ההבלטה צמיגה הצריכה הממוצעת של 0.072 מ"ג חלבון לכל 10,000 עקיפה אינדקס דפוסי בהשוואה 9.35 מ"ג עבור המטוס נוזלי חרירי דווחו (קרי, על פי 130 יותר מדגם יעיל)20. מזרק צמיגות גבוהה הוכח להיות מכשיר משלוח הדגימה קיימא TR-SFX בלבד ללא צורך להקריב חלק זו הדגימה יעילות43. ב- Nogly et al. (2018)10, לדוגמה, דוגמת צריכת היה בערך 1.5 מ"ג לכל 10,000 דפוסים סדורים באינדקס, אשר משווה לטובה כדי ניסויים TR-SFX דומים באמצעות את PYP איפה צריכת ממוצע המדגם היה גבוה בהרבה עם-74 מ ג חלבון לכל 10,000 נפש דפוסים סדורים באינדקס6. מרססים צמיגות גבוהה ולכן יש יתרונות ברורים כאשר מגבילה כמות חלבון זמין או כאשר גבישים גדלים ישירות LCP.
TR-SFX באמצעות צמיגות גבוהה מרססים להניב הנתונים הכי אמין מספר בעיות טכניות צריך להתייחס: מהירות הזרימה צריך להישאר מעל ערך קריטי מינימלי; hit-הקצב צריך להישמר ברמה כזו אינה מציגה את איסוף הנתונים איטית (למשל, גדול מ- 5%); מדגם חייב להינתן ללא שיבושים מוגזמת. באופן אידיאלי, תנאים אלה מתקיימים כבר זמן רב לפני ניסוי TR-SFX מתוזמן לשימוש זמין XFEL זמן בצורה יעילה ככל האפשר. Pricipally, האטה בזרם LCP עשוי לאפשר חיטוט קריסטלים הופעלו עם פולס לייזר אופטי אחד או יותר, התוצאה במצבים מעורבים פעילים, או לחטט חומר שאוב כאשר החומר umpumped צפויה הקרן. יתרון נוסף של הזרקת מראש בדיקה היא השבתה בעת איסוף הנתונים ב- XFEL הוא ממוזער כזמן הועבר החלפת חרירים סתומים, שינוי החוצה ללא הבלטת ממד דגימות, משימות תחזוקה אחרות מצטמצם.
כאן, אנו מציגים שיטה כדי למטב את משלוח מדגם TR-SFX איסוף הנתונים עם מזרק מיקרו-הבלטה צמיגות גבוהה. פשטות, השיטות המתואר אינם סומכים על גישה למקור רנטגן, למרות העבודה הפרעות לקרן החלקיקים סינכרוטרון29 לספק מידע נוסף אודות המחירים הכה צפוי ואת קריסטל עקיפה. הפרוטוקולים שלנו פותחו כדי למטב את הניסויים כדי ללכוד isomerization רשתית במשאבות פרוטונים bacteriorhodopsin10 , מתבצעת בשני שלבים החל בהכנת הדגימות קריסטל לשחול ואחריו ניטור ההבלטה באמצעות התקנה מצלמה במהירות גבוהה. בשלב אחד, LCP עמוסי קריסטל מעורב עם LCP נוספים, מעבר נמוכה טמפרטורת שומנים או תוספים אחרים כדי להבטיח שהתערובת הסופית מתאימה עבור משלוח לסביבה מדגם ללא סתימת או האטה. מצמד-כיוונית מזרק חדש פותחה על מנת לשפר ערבוב ביצועים ודגימת הומוגניות. השלב השני מורכב מבחן ההבלטה שהוקלט על ידי מצלמה מהירה למדוד ישירות את יציבות מהירות ההבלטה. לאחר הניתוח של נתוני וידאו, התאמות שניתן יהיה בפרוטוקול הכנה הדגימה כדי לשפר את תוצאות הניסוי. הליכים אלה ניתן להתאים להתכונן לחלבונים אחרים TR-SFX איסוף נתונים, עם שינויים מינימליים, ויתרום בשימוש היעיל beamtime XFEL מוגבל. עם מתקנים XFEL חדשים רק מתחיל שלהם44,מבצע45 , ומעבר של שיטות איסוף נתונים טורי מבוססי מזרק synchrotrons28,30,40,41 , בשנים הקרובות ימשיכו בוודאי לספק תובנות חדשות מרגשות דינמיקת פעם-מגוון רחב יותר של מטרות חלבונים מבניים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="744">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Mosquito LCP Syringe Coupling</td>
			<td style="width:175px;">TTP labtech store</td>
			<td style="width:101px;">3072-01050</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 &#181;l</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td style="width:101px;">HA-81065</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 &#181;l</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td style="width:101px;">HA-81265</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Monoolein</td>
			<td style="width:175px;">Nu-Chek Prep, Inc.</td>
			<td style="width:101px;">M-239</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">7.9 MAG</td>
			<td style="width:175px;">Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td style="width:101px;">850534O</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">50% w/v PEG 2000</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:101px;">MD2-250-7</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Paraffin (liquid)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">1.07162</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">High speed camera</td>
			<td style="width:175px;">Photron</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:224px;">Photron Mini AX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">High magnification lens</td>
			<td style="width:175px;">Navitar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>12X Zoom Lens System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Three axis stage</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:101px;">PT3/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Fiber light</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:101px;">OSL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Fused silica fiber</td>
			<td style="width:175px;">Molex/Polymicro</td>
			<td style="width:101px;">TSP-505375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Lite touch ferrule</td>
			<td style="width:175px;">IDEX</td>
			<td style="width:101px;">LT-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">ASU high viscosity injector</td>
			<td style="width:175px;">Arizona State University</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HPLC pump</td>
			<td style="width:175px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:101px;">LC-20AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Electronic gas regulator</td>
			<td style="width:175px;">Proportion Air</td>
			<td style="width:101px;">GP1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving high viscosity extrusion of microcrystals for time-resolved serial femtosecond crystallography at x-ray lasers

צמיגות גבוהה מיקרו-הבלטה מרססים באופן דרמטי הפחיתו צריכת מדגם בניסויים לחקר הגבישים בפמטושניות טורי (SFX)-רנטגן לייזר אלקטרונים חופשיים (XFELs). סדרה של ניסויים באמצעות את bacteriorhodopsin משאבת הפרוטונים מונחה אור נוסף הקמנו מרססים אלה כאפשרות המועדפת לספק קריסטלים עבור קריסטלוגרפיה זמן לפתור בפמטושניות טורי (TR-SFX) לפתור את השינויים המבניים של חלבונים לאחר photoactivation. כדי לקבל מספר מבניים תמונות באיכות גבוהה, זה חיוני כדי לאסוף כמויות גדולות של נתונים ולהבטיח סיווג של הגבישים בין כל פולס לייזר המשאבה. כאן, אנו מתארים בפרוטרוט איך אנחנו אופטימיזציה ההבלטה של bacteriorhodopsin microcrystals עבור ניסויים TR-SFX האחרונה שלנו-Linac קוהרנטי אור מקור (LCLS). מטרת השיטה היא לייעל את ההבלטה זרימה יציבה ורציפה תוך שמירה על צפיפות גבוהה של גבישים כדי להגביר את הקצב-אילו נתונים ניתן לאסוף ב- TR-SFX הניסוי. אנו להשיג מטרה זו על-ידי הכנת שלב מעוקבים lipidic עם התפלגות הומוגנית של גבישים באמצעות מזרק 3 חלקים הרומן צימוד המכשיר ואחריו התאמת הרכב הדגימה על סמך מדידות של יציבות ההבלטה עם למהירויות גבוהות כיוונון המצלמה. המתודולוגיה ניתן להתאים כדי לייעל את זרימת microcrystals אחרים. ההתקנה תהיה זמינה עבור משתמשים של המתקן החדש שוויצרי לייזר אלקטרונים בחינם.

חומר המוצא האידיאלי ההליכים המתוארים כאן (איור 3) הינם צפיפות גבוהה של microcrystals שולבו המוביל צמיגה בינונית עבור מזרק. ההליך דורש כ-50 µL קריסטל נושאת לאדן עבור כל הכנה. אלה יכולים להיות גדל ישירות LCP כמו עם bR9,10 משמש כאן, כדוגמה (<s...

Watch this Scientific Journal Video about Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers at JoVE.com

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

ההצלחה של ניסוי קריסטלוגרפיה הפמטו-זמן לפתור שנייה טורי תלויה משלוח הדגימה היעילה. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים כדי למטב את ההבלטה של bacteriorhodopsin microcrystals של מזרק מיקרו-הבלטה צמיגות גבוהה. המתודולוגיה מתבססת על מדגם המגון עם מצמד-כיוונית הרומן והדמיה עם מצלמה במהירות גבוהה.

שיפור ההבלטה צמיגות גבוהה של Microcrystals עבור זמן לפתור את טורי קריסטלוגרפיה הפמטו-שנייה-רנטגן לייזרים

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

פרוטוקול זה תוכנן כדי להבטיח שבעיות בהן נתקלים לעתים קרובות במהלך ניסויים קריסטלוגרפיים סדרתיים שנפתרו בזמן לא יפגעו באיכות הנתונים. אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו הוא הסתגלותה למערכות גבישים בודדות. בדיקת שבלט המצלמה במהירות גבוהה גם מאפשרת לנו למדוד ישירות יציבות שאקסטרוס.ראשית, לטעון 50 microliters של מונולין גבישי מבוסס LCP במזרק 100 מיקרוליטר כ 30 דקות לפני הזריקה. להזרקה לתוך סביבת ואקום, לטעון חמישה microliters של MAG 7.9 וחמישה microliters של פרפין נוזלי לתוך החלק האחורי של מזרק שני. מחזיק את המזרק אנכית, לגרש את בועות האוויר מהמזרק.חבר את המזרק עם MAG 7.9 ופרפין למחבר מזרק סטנדרטי. וטיהור האוויר מן המזוג על ידי לחיצה בעדינות על הבוכנה עד נפח קטן של התערובת גלוי בקצה המחט מזוג. חבר את מזרק המדגם מדר המזרק לוקח מכונית לא להכניס כל אוויר לתוך המדגם.מערבבים את השומנים ופרפין על ידי העברת המדגם דרך מפוסל מספר פעמים. לאחר מכן, לטעון 20 microliters של LCP premixed במזרק נוסף 100 microliter. מוציאים את המזרק הריק מהמצמד ומצמידים את ה-LCP המהוקדם לקריסטל המכיל מזרק באמצעות מצמד מזרק סטנדרטי.לאחר מכן, להעביר את המדגם דרך מזוג 100 פעמים. כדי להביא את המדגם לשלב מעוקב, להוסיף שלושה microliters של מונולין ומערבבים 50 פעמים. חזור על הליך זה רק עד שלב שקוף נוצר כדי למנוע עודף של מונולין.כבדיקה ראשונית עבור נוקשות מדגם extrudability, לנתק את המזרק הריק מן מוביגם המזרק, והחזקת המזרק אנכית, לסחוט כמות קטנה של סמפלר דרך מובייר. אם המדגם שבלט יוצר גליל זקוף, אז המדגם מוכן לבדיקת שבלט. כוונן את עוצמת הקול הכוללת של המדגם ל- 100 מיקרוליטרים על-ידי הוספת LCP נוסף.חבר את מזרק הדגימה ושני מזרקים ריקים למצמד המזרקים תלת-כיוון. מערבבים לפחות 50 פעמים על ידי העברת מחצית המדגם לתוך המזרק השני ולאחר מכן לחיצה על שני חצאי המדגם לתוך המזרק השלישי בו זמנית. מניחים את המזרק המכיל את הדגימה המעורבת תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לאמת התפלגות הומוגנית של גבישים.נקו משאבת HPLC ואת כל קווי המים כדי להבטיח שתעריפי הזרימה מדויקים. לאחר מכן, לטהר את השלב ההידראולי של המזרק. לאחר מכן, הפעל וחבר את המצלמה לתוכנה שסופקה.כאשר סרטון בשידור חי פועל לקבלת משוב חזותי, מקם את קצה הזרבובית במרכז המסגרת והבא אותו לפוקוס עם שלב שלושת הצירים. הגדר את קצב המסגרות במצלמה ל- 1,000 מסגרות לשנייה. לאחר מכן, הגדר את הרזולוציה ל- 512 על 512 פיקסלים.כאשר זמן החשיפה מוגדר כעת לפי קצב הפריימים, התאם את רמת התאורה עד שהזורם יהיה גלוי. ממקם מחדש את קצה הזרבובית כך שהוא ירכז משמאל לימין וימוקם בשליש העליון של המסגרת. הגדר את המצלמה במצב זמן לשגות.הגדר את המרווח ל- 30 שניות ואת החוזר ל- 40 פעמים. הגדר את מצב הגורם המפעיל לאקראי. והזן את מספר המסגרות לתיעוד ל- 1,000.עכשיו, לטעון את המאגר עם 20 microliters של דגימת הבדיקה ולצרף את הזרבובית נימי. חבר את המאגר המלא למזרק. לאחר מכן, לחבר את צינור הגז לנמל על הזרבובית ולהתחיל את זרימת הגז.לאחר מכן, הפעל בו זמנית את המשאבה ואת הקלטת המצלמה. לפקח על ההבלטה עד לחץ המשאבה בחדות משתוללת ליד זמן הסיום הצפוי. לאחר מכן, להפסיק להקליט, לכבות את המשאבה, ול לפרוק את לחץ המערכת על ידי פתיחת שסתום ההקלה.לאחר מכן, פתח את קובץ הווידאו עם תוכנת הניתוח וכייל את כלי המדידה. מצא מסגרת בסרטון שבו יש תכונה הניתנת למעקב גלויה בהבלטה. רשום את מספר המסגרת.לאחר מכן, קדם את הווידאו למסגרת שבה אותה תכונה גלויה אך עברה ממקומתו בשלב הקודם. רשום את מספר המסגרת. בעזרת כלי מדידת הקו הישר, למדוד את המרחק מנקודת ההתחלה והסיום של התכונה באמצעות מדידת ניתוח.חזור על השלבים הקודמים מספר פעמים עבור כל מקטע בסרטון. לבסוף, התווה את סידרת הנתונים. חומר ההתחלה האידיאלי עבור ההליך המתואר כאן הוא צפיפות גבוהה של microcrystals משולב לתוך מדיום נושא צמיג עבור המזרק.גבישי חלבון שימשו לאיסוף נתוני TRSFX על החיידק השאוב פרוטון rhodopsin, אשר חשף את השינויים המהירים במיוחד המתרחשים לאחר ספיגת פוטון. לאחר הכנת מדגם באמצעות מזוג תלת-אופן, בדיקה חזותית של החומר במזרק מראה הומוגניות מדגם. ותמונות מיקרוסקופ יכולות לאשר את צפיפות הגבישים.המדגם נמצא בשלב מעוקב כאשר מדיום המסירה ברור וצמיג. תערובות טורביות הן אינדיקציה לכך שהדגימה נמצאת בשלב ספוג או למלולר, אך אינן חד משמעיות מכיוון שצפיפות גביש גבוהה עלולה לטשטש את בהירות ה- LCP. בדיקת לחץ נמוך לזיהוי שלב הספוג יכולה להתבצע על ידי משיכת בוכנה המזרק הרחק מהדגימה.במהלך בדיקת הסילון, המדגם צריך להחדיר עמודה רציפה ארוכה של LCP שזז במהירות כמעט קבועה. דגימות פועלות במצב טפטוף מציינות כי צמיגות נמוכה מדי. נתונים מדוגמאות יוצרות עמודה צריכים להראות שההבלטה נשארת מעל למהירות מינימלית המוכתבת על-ידי הפרמטרים הניסיוניים.לאחר אופטימיזציה באמצעות פרוטוקול זה ניתן לאסוף נתונים גבישיים טוריים בפתרון זמן במתקן מומחה. זה יחשוף את השינויים הקונפורמיים בחלבון כולו כפי שהוא מבצע את תפקידו.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

הכנת תאים חסידים הדמיה הקרינה רנטגן על ידי קיבוע כימי

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

השתברות אבקת רנטגן שימור מדע: לקראת קביעת מבנה שיגרתית קריסטל של מוצרי קורוזיה על יצירות אמנות מורשה

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Sediment Core Extrusion Method at Millimeter Resolution Using a Calibrated, Threaded-rod

משקעי Core שחול שיטה ברזולוצית המילימטר בעזרת מכויל, הברגה-מוט

Aquatic sediment core subsampling is commonly performed at cm or half-cm resolution. Depending on the sedimentation rate and depositional environment, ...

High Pressure Single Crystal Diffraction at PX^2

בלחץ גבוה השתברות גביש יחיד ב PX ^ 2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

לכימות רנטגן פלורסצנטיות נתונים באמצעות מפות

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

זמן לפתור Photophysical אפיון של שלישיה-קציר תרכובות אורגניות ללא חמצן-הסביבה שימוש iCCD המצלמה

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

An Experimental Protocol for Femtosecond NIR/UV - XUV Pump-Probe Experiments with Free-Electron Lasers

טיפול נסיוני עבור הפמטו-שנייה ניר/UV - XUV ניסויים משאבת-בדיקה עם לייזר אלקטרונים חופשיים

This protocol describes key steps in performing and analyzing femtosecond pump-probe experiments that combine a femtosecond optical laser with a ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic שבבים עבור בחיי עיר קריסטל רנטגן עקיפה ו בחיי עיר פיזור אור דינאמי עבור קריסטלוגרפיה טורי

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

ספיגת מתכת חיוני של חיידקים גראם שליליים: רנטגן פלורסצנטיות, רדיואיזוטופים, ותא Fractionation

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

זיהוי רגיש היסודות של הכימיה בסוללות דרך בליעה רכה רנטגן, רנטגן פלסטית תהודה פיזור

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...