Name: improving high viscosity extrusion of microcrystals for time-resolved serial femtosecond crystallography at x-ray lasers
Uploaded: 2019-02-28T14:30:00
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हम gebhard schertler, राफेल abela और साई में उच्च चिपचिपापन इंजेक्टर के उपयोग का समर्थन करने के लिए क्रिस milne स्वीकार करते हैं । रिचर्ड neutze और उनकी टीम समय पर विचार विमर्श के लिए स्वीकार कर रहे है-का समाधान किया क्रि और नमूना वितरण उच्च चिपचिपापन इंजेक्टर का उपयोग कर । वित्तीय सहायता के लिए, हम स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन को अनुदान 31003a_141235, 31003a_141235 (जे. एस.) और PZ00P3_174169 (पीएनएस) के लिए स्वीकार करते हैं । इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम मैरी-sklodowska-क्यूरी ग्रांट समझौता नहीं ७०१६४६ के तहत से धन प्राप्त हुआ है ।

1. प्रोटीन क्रिस्टल नमूना तैयारी
<ol><li>के बारे में 30 मिनट पहले नमूना इंजेक्शन किया जा करने के लिए है, लोड ५० μl के क्रिस्टल-लादेन monoolein आधारित lcp में एक १०० μl सिरिंज.</li>
	<li>वायुमंडलीय दबाव में इंजेक्शन के लिए: एक दू...

चिपचिपा बाहर निकालना इंटैक्टर के साथ टी. आर.-sfx विधि बैक्टीरियोरोहोडोसिन9,10 और photosystem द्वितीय13 के संरचनात्मक गतिशीलता अध्ययन के लिए एक व्यवहार्य तकनीक साबित हो गया है और अब ?...

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="744">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Mosquito LCP Syringe Coupling</td>
			<td style="width:175px;">TTP labtech store</td>
			<td style="width:101px;">3072-01050</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 &#181;l</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td style="width:101px;">HA-81065</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 &#181;l</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td style="width:101px;">HA-81265</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Monoolein</td>
			<td style="width:175px;">Nu-Chek Prep, Inc.</td>
			<td style="width:101px;">M-239</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">7.9 MAG</td>
			<td style="width:175px;">Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td style="width:101px;">850534O</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">50% w/v PEG 2000</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:101px;">MD2-250-7</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Paraffin (liquid)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">1.07162</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">High speed camera</td>
			<td style="width:175px;">Photron</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:224px;">Photron Mini AX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">High magnification lens</td>
			<td style="width:175px;">Navitar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>12X Zoom Lens System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Three axis stage</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:101px;">PT3/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Fiber light</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:101px;">OSL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Fused silica fiber</td>
			<td style="width:175px;">Molex/Polymicro</td>
			<td style="width:101px;">TSP-505375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Lite touch ferrule</td>
			<td style="width:175px;">IDEX</td>
			<td style="width:101px;">LT-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">ASU high viscosity injector</td>
			<td style="width:175px;">Arizona State University</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HPLC pump</td>
			<td style="width:175px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:101px;">LC-20AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Electronic gas regulator</td>
			<td style="width:175px;">Proportion Air</td>
			<td style="width:101px;">GP1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving high viscosity extrusion of microcrystals for time-resolved serial femtosecond crystallography at x-ray lasers

उच्च चिपचिपापन माइक्रो-बाहर निकालना इंजेक्टर नाटकीय रूप से एक्स-रे मुक्त इलेक्ट्रॉन लेसरों (xfels) में सीरियल femtosecond क्रिस्टलीय प्रयोगों (sfx) में नमूना खपत कम कर दिया है । प्रकाश चालित प्रोटॉन पम्प बैक्टीरियोर्होडोसिन का उपयोग करके प्रयोगों की एक श्रृंखला ने इन इंजेक्टर को समय के लिए क्रिस्टल देने के लिए एक पसंदीदा विकल्प के रूप में स्थापित किया है-हल किए गए सीरियल femtosecond क्रि (TR-sfx) के संरचनात्मक परिवर्तन को हल करने के लिए photoactivation के बाद प्रोटीन । उच्च गुणवत्ता के कई संरचनात्मक स्नैपशॉट प्राप्त करने के लिए, यह डेटा की बड़ी मात्रा में इकट्ठा करने और हर पंप लेजर पल्स के बीच क्रिस्टल की मंजूरी सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । यहाँ, हम विस्तार से वर्णन कैसे हम हमारे हाल ही में TR-sfx प्रयोगों के लिए बैक्टीरियोरोहोडोसिन माइक्रोक्रिस्टल के बाहर निकालना अनुकूलित linac सुसंगत प्रकाश स्रोत (lcls). इस विधि का लक्ष्य एक स्थिर और सतत प्रवाह के लिए बाहर निकालना का अनुकूलन है, जबकि क्रिस्टल की एक उच्च घनत्व को बनाए रखने के लिए दर जिस पर डेटा एक टी. आर. sfx प्रयोग में एकत्र किया जा सकता है बढ़ाने के लिए है । हम एक उपंयास तीन तरह सिरिंज युग्मन डिवाइस का उपयोग कर एक उच्च गति के साथ लिया बाहर निकालना स्थिरता की माप के आधार पर नमूना संरचना समायोजन द्वारा पीछा किया क्रिस्टल का एक समरूप वितरण के साथ lipidic घन चरण की तैयारी करके इस लक्ष्य को प्राप्त कैमरा सेटअप । कार्यप्रणाली को अन्य माइक्रोक्रिस्टल के प्रवाह को अनुकूलित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । सेटअप नए स्विस मुक्त इलेक्ट्रॉन लेजर सुविधा के उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध हो जाएगा ।

यहां वर्णित प्रक्रियाओं के लिए आदर्श प्रारंभिक सामग्री (चित्रा 3) सुई लगानेवाला के लिए चिपचिपा वाहक माध्यम में शामिल माइक्रोक्रिस्टल के उच्च घनत्व हैं । प्रक्रिया प्रत्येक तै?...

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Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

एक समय की सफलता का हल सीरियल femtosecond क्रि प्रयोग कुशल नमूना वितरण पर निर्भर है । यहाँ, हम प्रोटोकॉल का वर्णन एक उच्च चिपचिपापन माइक्रो-एक्सट्रूज़न इंटैक्टर से बैक्टीरियोरोहोडोसिन माइक्रोक्रिस्टल के बाहर निकालना का अनुकूलन करने के लिए । कार्यप्रणाली एक उपंयास तीन तरह युग्मक और एक उच्च गति कैमरे के साथ दृश्य के साथ नमूना एकरूपता पर निर्भर करता है ।

एक्स-रे लेसरों में समय-हल सीरियल femtosecond crystallography के लिए माइक्रोक्रिस्टल की उच्च चिपचिपापन बाहर निकालना में सुधार

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

इस प्रोटोकॉल को यह सुनिश्चित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है कि समय-हल किए गए धारावाहिक क्रिस्टलीय प्रयोगों के दौरान अक्सर सामना करने वाली समस्याएं डेटा गुणवत्ता से समझौता नहीं करेंगे। इस विधि का एक प्रमुख लाभ व्यक्तिगत क्रिस्टल सिस्टम के लिए इसकी अनुकूलनशीलता है। हाई स्पीड कैमरा एक्सट्रूशन टेस्ट भी हमें सीधे एक्सट्रूशन स्टेबिलिटी को मापने की अनुमति देता है ।सबसे पहले, इंजेक्शन से लगभग 30 मिनट पहले 100 माइक्रोलीटर सिरिंज में क्रिस्टललेड मोनोओलिन आधारित एलसीपी के 50 माइक्रोलीटर लोड करें। एक वैक्यूम वातावरण में इंजेक्शन के लिए, एक दूसरे सिरिंज के पीछे में एमएजी 7.9 के पांच माइक्रोलीटर और तरल पैराफिन के पांच माइक्रोलीटर लोड करें। सिरिंज को खड़ी पकड़कर, सिरिंज से हवा के बुलबुले को निष्कासित करें।एक मानक सिरिंज कपलर के लिए एमएजी 7.9 और पैराफिन के साथ सिरिंज कनेक्ट करें। और कपलर से हवा को धीरे-धीरे प्लंजर पर दबाकर शुद्ध करें जब तक कि कपलर सुई की नोक पर मिश्रण की एक छोटी मात्रा दिखाई न दे। नमूना सिरिंज को कार लेने वाले सिरिंज कपलर से कनेक्ट करें ताकि नमूने में कोई हवा न लगे।कई बार कपलर के माध्यम से नमूना पारित करके लिपिड और पैराफिन में मिलाएं। इसके बाद, अन्य 100 माइक्रोलीटर सिरिंज में प्रीमिक्स्ड एलसीपी के 20 माइक्रोलीटर लोड करें। कपलर से खाली सिरिंज निकालें और एक मानक सिरिंज कपलर का उपयोग करके क्रिस्टल युक्त सिरिंज के लिए प्रीमिक्स्ड एलसीपी संलग्न करें।इसके बाद 100 बार कपलर के जरिए सैंपल पास करें। नमूने को घन चरण में लाने के लिए, मोनोोलिन के तीन माइक्रोलीटर जोड़ें और 50 बार मिलाएं। मोनोोलिन की अधिकता से बचने के लिए एक पारदर्शी चरण बनने तक इस प्रक्रिया को दोहराएं।नमूना कठोरता और बाहर निकालने की क्षमता के लिए एक प्रारंभिक परीक्षण के रूप में, सिरिंज कपलर से खाली सिरिंज अलग, और सिरिंज खड़ी पकड़, कपलर के माध्यम से पारखी की एक छोटी राशि निचोड़ । यदि निकाला गया नमूना एक सीधा सिलेंडर बनाता है, तो नमूना निष्कासन परीक्षण के लिए तैयार है। अधिक प्रीमिक्स्ड एलसीपी जोड़कर नमूने की कुल मात्रा को 100 माइक्रोलीटर में समायोजित करें।तीन तरह की सिरिंज कपलर के सैंपल सिरिंज और दो खाली सीरिंज अटैच करें। दूसरी सिरिंज में नमूने के आधे पास करके कम से कम 50 बार मिलाएं और फिर नमूने के दोनों हिस्सों को एक साथ तीसरी सिरिंज में दबाएं। क्रिस्टल के समरूप वितरण को सत्यापित करने के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत मिश्रित नमूने युक्त सिरिंज रखें।प्रवाह दरों को सुनिश्चित करने के लिए एक एचपीएलसी पंप और सभी पानी की लाइनों को शुद्ध करें सटीक हैं। इसके बाद इंजेक्टर के हाइड्रोलिक स्टेज को शुद्ध करें। इसके बाद, कैमरे को चालू करें और कैमरे को आपूर्ति किए गए सॉफ्टवेयर से कनेक्ट करें।दृश्य प्रतिक्रिया के लिए चलने वाले लाइव वीडियो के साथ, फ्रेम के केंद्र में नोजल टिप की स्थिति और इसे तीन-अक्ष चरण के साथ ध्यान में लाएं। कैमरे पर 1, 000 फ्रेम प्रति सेकंड के लिए फ्रेम दर सेट करें। इसके बाद 512 पिक्सल करके रेजोल्यूशन 512 तक सेट करें।अब फ्रेम दर द्वारा निर्धारित एक्सपोजर समय के साथ, रोशनी के स्तर को तब तक समायोजित करें जब तक कि नोजल दिखाई न दे। नोजल टिप को फिर से स्थान दें ताकि यह बाएं से दाएं केंद्रित हो और फ्रेम के शीर्ष तीसरे में स्थित हो। समय चूक मोड में कैमरा सेट करें।अंतराल को 30 सेकंड तक सेट करें और दोहराता है 40 बार। ट्रिगर मोड को यादृच्छिक रूप से सेट करें। और 1, 000 को रिकॉर्ड करने के लिए फ्रेम की संख्या दर्ज करें।अब, परीक्षण नमूने के 20 माइक्रोलीटर के साथ जलाशय लोड करें और केशिका नोजल संलग्न करें। भरे हुए जलाशय को इंजेक्टर से अटैच करें। इसके बाद नोजल पर पोर्ट पर गैस लाइन लगाकर गैस का बहाव शुरू कर दें।इसके बाद, एक साथ पंप और कैमरा रिकॉर्डिंग शुरू करें। जब तक पंप दबाव तेजी से अपेक्षित अंत समय के पास रैंप पर नहीं जाता तब तक एक्सट्रूज़न की निगरानी करें। फिर, रिकॉर्डिंग बंद करो, पंप बंद करो, और राहत वाल्व खोलने के द्वारा प्रणाली के दबाव वेंट ।इसके बाद, वीडियो फ़ाइल को विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ खोलें और माप उपकरणों को कैलिब्रेट करें। वीडियो में एक फ्रेम खोजें जहां एक्सट्रूज़न में एक ट्रैक करने योग्य सुविधा दिखाई दे रही है। फ्रेम नंबर रिकॉर्ड करें।इसके बाद, वीडियो को एक फ्रेम में आगे बढ़ाएं जहां एक ही सुविधा दिखाई दे रही है लेकिन पिछले चरण में अपनी स्थिति से आगे बढ़ गई है। फ्रेम नंबर रिकॉर्ड करें। सीधी रेखा माप उपकरण का उपयोग करके, विश्लेषण उपाय के माध्यम से सुविधा की शुरुआत और अंत बिंदु से दूरी को मापें।वीडियो के हर सेगमेंट के लिए पिछले चरणों को कई बार दोहराएं। अंत में, डेटा श्रृंखला की साजिश करें। यहां वर्णित प्रक्रिया के लिए आदर्श प्रारंभिक सामग्री इंजेक्टर के लिए एक चिपचिपा वाहक माध्यम में शामिल माइक्रोक्रिस्टल की उच्च घनत्व है।प्रोटीन क्रिस्टल का उपयोग प्रोटॉन पंप बैक्टीरिया रोडोप्सिन पर टीआरएसएफएक्स डेटा एकत्र करने के लिए किया जाता था, जिससे फोटॉन अवशोषण के बाद होने वाले अल्ट्रा फास्ट परिवर्तनों का पता चला। तीन तरह के कपलर का उपयोग करके नमूना तैयार करने के बाद, सिरिंज में सामग्री का दृश्य निरीक्षण नमूना एकरूपता दिखाता है। और माइक्रोस्कोप छवियां क्रिस्टल के घनत्व की पुष्टि कर सकती हैं।डिलीवरी माध्यम स्पष्ट और चिपचिपा होने पर नमूना घन चरण में होता है। टर्बिड मिश्रण एक संकेत है कि नमूना स्पंज या लैमेलर चरण में है, लेकिन निर्णायक नहीं हैं क्योंकि उच्च क्रिस्टल घनत्व एलसीपी की स्पष्टता को अस्पष्ट कर सकता है। स्पंज चरण की पहचान करने के लिए एक कम दबाव परीक्षण सिरिंज प्लंजर को नमूने से दूर खींचकर किया जा सकता है।जेट परीक्षण के दौरान, नमूने को एलसीपी के एक लंबे निरंतर स्तंभ को बाहर निकालना चाहिए जो लगभग निरंतर वेग पर चलता है। टपकने वाले मोड में चलने वाले नमूनों से पता चलता है कि चिपचिपाहट बहुत कम है। एक कॉलम बनाने वाले नमूनों से डेटा से पता चलता है कि एक्सट्रूशन प्रायोगिक मापदंडों द्वारा तय न्यूनतम गति से ऊपर रहता है।इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर अनुकूलन के बाद समय-संकल्प धारावाहिक क्रिस्टलीय डेटा एक विशेषज्ञ सुविधा पर एकत्र किया जा सकता है । यह पूरे प्रोटीन में अनुरूप परिवर्तन प्रकट करेगा क्योंकि यह अपना कार्य करता है।

Research

JoVE Journal

Chemistry

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