Name: improving high viscosity extrusion of microcrystals for time-resolved serial femtosecond crystallography at x-ray lasers
Uploaded: 2019-02-28T14:30:00
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Riconosciamo Gebhard Schertler, Rafael Abela e Chris Milne per sostenere l'uso di iniettori ad alta viscosità allo PSI. Richard Neutze e il suo team sono riconosciuti per le discussioni sulla cristallografia risolta in tempo e consegna del campione usando gli iniettori ad alta viscosità. Sostegno finanziario, riconosciamo la Swiss National Science Foundation per sovvenzioni 31003A_141235, 31003A_159558 (a J.S.) e PZ00P3_174169 (a P.N.). Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di innovazione nell'ambito della sovvenzione Marie Sklodowska-Curie accordo No 701646 e ricerca Orizzonte 2020 dell'Unione europea.

1. preparazione del campione di cristallo proteina
<ol><li>Circa 30 min prima il campione deve essere iniettato, carico 50 µ l di monoolein carichi di cristallo base LCP in siringa 100 µ l.</li>
	<li>Per l'iniezione a pressione atmosferica: carico 10 µ l di paraffina liquida nel retro di una seconda siringa. Tenendo la siringa in posizione verticale, espellere le bolle d'aria dalla siringa.<ol>
<li>Per iniezione in ambiente sottovuoto: carico 5 µ l di MAG 7,9 e 5 µ l di paraffina liquida nel retro di una seconda s...

Il metodo di TR-SFX con l'iniettore di estrusione viscoso ha dimostrato di essere una tecnica valida per gli studi di dinamica strutturale di bacteriorhodopsin9,10 e fotosistema II13 e ora sembra pronto a studiare proteine guida altro processi biologici foto ad esempio trasporto di ioni luce-driven o percezione sensoriale5,50. I protocolli descritti sopra sono stati progettati per ...

Seriale a femtosecondi cristallografia (SFX) è una tecnica di biologia strutturale che sfrutta le proprietà uniche dei raggi x laser ad elettroni liberi (XFEL) per determinare le strutture di temperatura ambiente da migliaia di cristalli di dimensioni micrometriche mentre outrunning la maggior parte delle il danno da radiazione della "diffrazione prima distruzione" principio1,2,3.
In un'estensione di tempo-risolta di SFX (TR-SFX), gli impulsi a femtosecondi dal XFEL sono utilizzati per studiare i cambiamenti strutturali in proteine4,5. La proteina di interesse viene attivata con un laser ottico (o un'altra attività trigger) appena prima di essere ripresi da XFEL in un'installazione di pompa-sonda. Controllando con precisione il ritardo tra gli impulsi di pompa e sonda, la proteina dell'obiettivo possa essere catturata in Stati diversi. Film molecolare dei cambiamenti strutturali nel corso di undici ordini di grandezza in tempo dimostrare il potere delle nuove fonti XFEL per studiare la dinamica di diverse proteine target6,7,8,9, 10,11,12,13. Principalmente, il metodo unisce le tecniche strutturali con spettroscopiche e statiche dinamiche in uno, fornendo un assaggio nelle dinamiche di proteina a vicino a risoluzione atomica.
Sistemi semplici per TR-SFX possono contenere un trigger endogeno di attivazione con un componente fotosensibile come retinica bacteriorhodopsin (bR)9,10, i cromofori nel fotosistema II12,13, proteina gialla fotoattivi (PYP)6,7 reversibilmente fotomodulabili proteina fluorescente11, o un monossido di carbonio photolyzable in mioglobina8. Emozionanti varianti della tecnica ancora in fase di sviluppo si basano su mix e iniettare schemi14,15 per studiare le reazioni enzimatiche o un campo elettrico usato per indurre cambiamenti strutturali16. Dato che fonti XFEL sono rese disponibili solo per pochi anni e l'estrapolazione successi del passato verso il futuro, il metodo Mostra il potenziale come un vero e proprio gioco-changer rispetto alla nostra comprensione di come funzione di proteine.
Perché campioni biologici sono distrutti da una singola esposizione a un'ad alta potenza impulso XFEL, nuovi approcci alla cristallografia di proteine erano necessari. Tra queste procedure, la capacità di crescere grandi quantità di microcristalli uniforme doveva essere sviluppato17,18,19. Per abilitare la raccolta di dati a un XFEL, questi cristalli devono essere consegnati, scartati e poi rinnovati per ogni impulso XFEL. Dato che XFELs fuoco utilizzabili impulsi a 10-120 Hz, consegna del campione deve essere veloce, stabile e affidabile, mantenendo anche i cristalli intatto e limitando il consumo. Tra le soluzioni di maggior successo è un iniettore di micro-estrusione ad alta viscosità, che trasporta un continiously colonna della temperatura ambiente crystal-carico lipidico cubi fase (LCP) in streaming attraverso il pulsato di fascio raggi x20. Cristalli orientati casualmente, incorporate nel flusso di LCP, che vengono intercettati dallo spargimento di impulsi XFEL raggi x su un rivelatore dove si è registrato un pattern di diffrazione. LCP è stata una scelta naturale per un mezzo di consegna del campione, poiché viene frequentemente utilizzata come mezzo di crescita per membrana proteina cristalli17,21,22,23, ancora altri supporti informatici di alta viscosità 24,25,26,27,28,29,30 e31 di proteine solubili sono stati utilizzati anche nell'iniettore. SFX con l'iniettore ad alta viscosità è riuscita durante la determinazione della struttura della membrana proteine13,32 compreso il G proteina-ha accoppiato i ricevitori (GPCR)33,34, 36, 35,37, con qualità di dati sufficiente per nativo phasing38,39 pur essendo esempio efficiente e tempo. Attualmente, questi iniettori vengono utilizzati più ordinariamente per misure di temperatura al sincrotrone fonti28,30,40,41 , così come durante il più tecnicamente esigente esperimenti TR-SFX a XFELs9,10,13,42.
Esperimenti di TR-SFX paragonabili sono stati effettuati utilizzando altri tipi di iniettori come fase liquida consegna in un flusso concentrato di ugello6,7,12, tuttavia, questo metodo richiede una quantità di proteina non è disponibile per molti biologicamente interessanti destinazioni. Per la determinazione delle strutture statiche mediante estrusione viscoso un consumo medio di 0,072 mg di proteina per diffrazione 10.000 indicizzate rispetto alle 9,35 mg per il getto di liquido ugelli sono stati segnalati (cioè circa 130 volte più campione efficiente)20. L'iniettore ad alta viscosità ha dimostrato di essere un dispositivo di consegna campione valido per TR-SFX mentre solo sacrificare alcuni di questo esempio efficienza43. In Nogly et al (2018)10, ad esempio, il consumo del campione era circa 1,5 mg per 10.000 modelli indicizzate, che paragona favorevole a simili esperimenti di TR-SFX utilizzando il PYP dove il consumo medio del campione era molto più alto con 74 mg di proteina per 10.000 indicizzata modelli6. Iniettori ad alta viscosità sono così evidenti vantaggi quando sta limitando la quantità di proteina disponibile o quando cristalli sono coltivati direttamente in LCP.
Per TR-SFX utilizzando ad alta viscosità iniettori a cedere i dati più affidabili diversi problemi tecnici devono essere affrontate: la velocità di flusso deve rimanere sopra un minimo valore critico; la hit-rate dovrebbe essere mantenuta ad un livello che non esegue il rendering lento di raccolta di dati (ad es., superiore al 5%); e campione deve essere consegnato senza eccessive interruzioni. Idealmente, questi requisiti sono già soddisfatti molto prima che un esperimento di TR-SFX pianificato per utilizzare il tempo disponibile XFEL efficientemente come possibile. Primis, un rallentamento del flusso di LCP può permettere di cristalli che sono stati attivati con più di un impulso laser ottico e risultato in Stati attivi misti di sondaggio sondaggio materiale pompato quando umpumped materiale è previsto nel fascio. Un ulteriore vantaggio dell'iniezione pre-test è che i tempi di inattività durante la raccolta di dati presso un XFEL è ridotta a icona come tempo relegato alla sostituzione ugelli intasati, cambiando i campioni non-espulsione, e altre attività di manutenzione è ridotto.
Qui, presentiamo un metodo per ottimizzare la consegna del campione per la raccolta di dati di TR-SFX con un iniettore di micro-estrusione ad alta viscosità. Per semplicità, i metodi descritti non si basano sull'accesso ad una sorgente di raggi x, anche se lavoro presso un sincrotrone beamline29 sarebbe fornire ulteriori informazioni sui tassi di successo previsti e diffrazione di cristallo. I nostri protocolli sono stati sviluppati per ottimizzare gli esperimenti per catturare isomerizzazione retinica nella pompa protonica bacteriorhodopsin10 e sono svolte in due fasi a partire con la preparazione dei campioni di cristallo per estrusione seguita monitorando l'estrusione utilizzando un programma di installazione di telecamere ad alta velocità. Nella prima fase, il LCP carichi di cristallo è mescolato con ulteriori LCP, lipidi di transizione bassa temperatura o altri additivi per garantire che la miscela finale è adatta per il recapito nell'ambiente campione senza intasamento o rallentando. Un nuovo coupler siringa a tre vie è stato sviluppato per migliorare la miscelazione omogeneità delle prestazioni e del campione. La seconda fase è costituito da una prova di estrusione registrata da una telecamera ad alta velocità per misurare direttamente la stabilità di velocità di estrusione. In seguito all'analisi dei dati video, possono effettuare regolazioni per il protocollo di preparazione del campione per migliorare i risultati sperimentali. Queste procedure possono essere adattate per preparare altre proteine per la raccolta di dati di TR-SFX, con modifiche minime e contribuiranno all'uso efficiente delle limitate XFEL valutazione. Con nuove strutture XFEL appena iniziando la loro operazione44,45 e il trasferimento dei metodi di raccolta dati seriale basata su iniettore a sincrotroni28,30,40,41 , nei prossimi anni saranno sicuramente continuerà a fornire emozionanti nuove intuizioni le dinamiche strutturali di una gamma sempre più ampia di bersagli proteici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="744">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Mosquito LCP Syringe Coupling</td>
			<td style="width:175px;">TTP labtech store</td>
			<td style="width:101px;">3072-01050</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 &#181;l</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td style="width:101px;">HA-81065</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 &#181;l</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td style="width:101px;">HA-81265</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Monoolein</td>
			<td style="width:175px;">Nu-Chek Prep, Inc.</td>
			<td style="width:101px;">M-239</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">7.9 MAG</td>
			<td style="width:175px;">Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td style="width:101px;">850534O</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">50% w/v PEG 2000</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:101px;">MD2-250-7</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Paraffin (liquid)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">1.07162</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">High speed camera</td>
			<td style="width:175px;">Photron</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:224px;">Photron Mini AX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">High magnification lens</td>
			<td style="width:175px;">Navitar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>12X Zoom Lens System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Three axis stage</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:101px;">PT3/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Fiber light</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:101px;">OSL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Fused silica fiber</td>
			<td style="width:175px;">Molex/Polymicro</td>
			<td style="width:101px;">TSP-505375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Lite touch ferrule</td>
			<td style="width:175px;">IDEX</td>
			<td style="width:101px;">LT-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">ASU high viscosity injector</td>
			<td style="width:175px;">Arizona State University</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HPLC pump</td>
			<td style="width:175px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:101px;">LC-20AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Electronic gas regulator</td>
			<td style="width:175px;">Proportion Air</td>
			<td style="width:101px;">GP1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving high viscosity extrusion of microcrystals for time-resolved serial femtosecond crystallography at x-ray lasers

Iniettori di micro-estrusione ad alta viscosità hanno ridotto drasticamente il consumo del campione nel serial femtosecond cristallografici esperimenti (SFX) al laser a elettroni liberi a raggi x (XFELs). Una serie di esperimenti utilizzando la batteriorodopsina pompa protonica luce-driven ulteriormente hanno stabilito questi iniettori come un'opzione preferita di consegnare cristalli per risolti in tempo ai femtosecondi seriale cristallografia (TR-SFX) risolvere le modifiche strutturali del proteine dopo fotoattivazione. Per ottenere più strutturali istantanee di alta qualità, è essenziale per raccogliere grandi quantità di dati e garantire la liquidazione dei cristalli tra ogni impulso del laser di pompa. Qui, descriviamo in dettaglio come abbiamo ottimizzato l'estrusione di microcristalli bacteriorhodopsin per i nostri esperimenti di TR-SFX risale alle origine Linac della luce coerente (LCL). L'obiettivo del metodo è quello di ottimizzare estrusione per un flusso stabile e continuo, mantenendo un'alta densità di cristalli per aumentare il tasso a cui i dati possono essere raccolti in un TR-SFX sperimentare. Raggiungiamo questo obiettivo attraverso la preparazione di fase lipidica cubico con una distribuzione omogenea dei cristalli utilizzando una siringa di tre vie romanzo dispositivo seguito regolando la composizione del campione sulla base di misurazioni della stabilità dell'estrusione scattate con un'alta velocità di attacco installazione della telecamera. La metodologia può essere adattata per ottimizzare il flusso di altri microcristalli. L'installazione sarà disponibile per gli utenti del nuovo stabilimento svizzero Free Electron Laser.

Il materiale di partenza ideale per le procedure qui descritte (Figura 3) sono alte densità di microcristalli incorporato nel mezzo viscoso dell'elemento portante per l'iniettore. La procedura richiede circa 50 µ l di cristallo laden elemento portante per ogni preparazione. Questi possono essere coltivati direttamente in LCP come con il bR9,10 utilizzato qui, come esempio (Figur...

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Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Il successo di un esperimento di cristallografia risolti in tempo ai femtosecondi seriale dipende dalla consegna efficiente dei campioni. Qui, descriviamo protocolli per ottimizzare l'estrusione di microcristalli bacteriorhodopsin da un iniettore di micro-estrusione ad alta viscosità. La metodologia si basa sull'omogeneizzazione del campione con un romanzo accoppiatore di tre vie e la visualizzazione con una telecamera ad alta velocità.

Miglioramento di estrusione ad alta viscosità di microcristalli per Time-resolved Serial Femtosecond cristallografia a raggi x laser

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Questo protocollo è stato progettato per garantire che i problemi frequentemente riscontrati durante gli esperimenti cristallografici seriali risolti nel tempo non compromettono la qualità dei dati. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è la sua adattabilità ai singoli sistemi cristallini. Il test di estrusione della telecamera ad alta velocità ci consente anche di misurare direttamente la stabilità dell'estrusione.In primo luogo, caricare 50 microlitri di LCP a base di monooleina cristallina in una siringa da 100 microlitri circa 30 minuti prima dell'iniezione. Per l'iniezione in un ambiente sottovuoto, caricare cinque microlitri di MAG 7.9 e cinque microlitri di paraffina liquida nella parte posteriore di una seconda siringa. Tenendo la siringa verticalmente, espellere le bolle d'aria dalla siringa.Collegare la siringa con MAG 7.9 e paraffina a un accoppiatore di siringhe standard. E epurare l'aria dall'accoppiatore premendo delicatamente sullo stantuffo fino a quando un piccolo volume della miscela è visibile sulla punta dell'ago dell'accoppiatore. Collegare la siringa campione all'accoppiatore di siringhe che prende l'auto per non introdurre aria nel campione.Mescolare il lipide e la paraffina passando il campione attraverso l'accoppiatore più volte. Successivamente, caricare 20 microlitri di LCP premiscelato in un'altra siringa da 100 microlitri. Rimuovere la siringa vuota dall'accoppiatore e attaccare l'LCP premiscelato alla siringa contenente cristallo utilizzando un accoppiatore di siringhe standard.Quindi, passare il campione attraverso l'accoppiatore 100 volte. Per portare il campione nella fase cubica, aggiungere tre microlitri di monooleina e mescolare 50 volte. Ripetere questa procedura solo fino a quando non si è formata una fase trasparente per evitare un eccesso di monooleina.Come test preliminare per la rigidità e l'estrusione del campione, staccare la siringa vuota dall'accoppiatore della siringa e tenere la siringa verticalmente, spremere una piccola quantità di campionatore attraverso l'accoppiatore. Se il campione estruso forma un cilindro verticale, il campione è pronto per il test di estrusione. Regolare il volume totale del campione a 100 microlitri aggiungendo un LCP più premiscelato.Attaccare la siringa campione e due siringhe vuote all'accoppiatore a tre siringhe. Mescolare almeno 50 volte passando metà del campione nella seconda siringa e quindi premendo entrambe le metà del campione nella terza siringa contemporaneamente. Posizionare la siringa contenente il campione misto al microscopio stereo per verificare una distribuzione omogenea dei cristalli.Elimina una pompa HPLC e tutte le linee d'acqua per garantire che le portate siano accurate. Quindi, eliminare lo stadio idraulico dell'iniettore. Successivamente, accendere e collegare la fotocamera al software in dotazione.Con un video in diretta in esecuzione per un feedback visivo, posiziona la punta dell'ugello al centro del fotogramma e portalo a fuoco con lo stadio a tre assi. Impostare la frequenza fotogrammi sulla fotocamera su 1.000 fotogrammi al secondo. Quindi, impostare la risoluzione su 512 per 512 pixel.Con il tempo di esposizione ora impostato dalla frequenza fotogrammi, regolare il livello di illuminazione fino a quando l'ugello non è visibile. Riposizionare la punta dell'ugello in modo che sia centrata da sinistra a destra e si trovi nel terzo superiore del telaio. Configurare la fotocamera in modalità time lapse.Impostare l'intervallo su 30 secondi e le ripetizioni su 40 volte. Impostare la modalità trigger su casuale. E immettere il numero di fotogrammi da registrare a 1.000.Ora, caricare il serbatoio con 20 microlitri del campione di prova e attaccare l'ugello capillare. Attaccare il serbatoio riempito all'iniettore. Quindi, collegare la linea del gas alla porta sull'ugello e avviare il flusso di gas.In seguito, avviare contemporaneamente la pompa e la registrazione della fotocamera. Monitorare l'estrusione fino a quando la pressione della pompa non aumenta bruscamente verso l'ora di fine prevista. Quindi, interrompere la registrazione, spegnere la pompa e sfogare la pressione del sistema aprendo la valvola di scarico.In seguito, aprire il file video con il software di analisi e calibrare gli strumenti di misurazione. Trova un fotogramma nel video in cui è visibile una feature tracciabile nell'estrusione. Registrare il numero di fotogramma.Quindi, sposta il video su un fotogramma in cui la stessa funzione è visibile ma si è spostata dalla sua posizione nel passaggio precedente. Registrare il numero di fotogramma. Utilizzando lo strumento di misurazione della linea retta, misurare la distanza dal punto iniziale e finale della feature tramite la misura di analisi.Ripeti i passaggi precedenti alcune volte per ogni segmento del video. Infine, tracciare la serie di dati. Il materiale di partenza ideale per la procedura qui descritta sono le alte densità di microcristalli incorporati in un mezzo portante viscoso per l'iniettore.I cristalli proteici sono stati utilizzati per raccogliere i dati TRSFX sulla rodopsina dei batteri pompati protonicamente, che hanno rivelato i cambiamenti ultra veloci che si verificano dopo l'assorbimento del fotone. Dopo la preparazione del campione con un accoppiatore a tre, l'ispezione visiva del materiale nella siringa mostra omogeneità del campione. E le immagini al microscopio possono confermare la densità dei cristalli.Il campione è in fase cubica quando il mezzo di erogazione è chiaro e viscoso. Le miscele torbidi sono un'indicazione che il campione si trova in una spugna o in una fase lamellare, ma non sono conclusive in quanto un'alta densità cristallina può oscurare la chiarezza dell'LCP. Un test a bassa pressione per identificare la fase della spugna può essere eseguito allontanando lo stantuffo della siringa dal campione.Durante il test del getto, il campione dovrebbe estrudere una lunga colonna continua di LCP che si muove a una velocità quasi costante. I campioni eseguiti in modalità gocciolante indicano che la viscosità è troppo bassa. I dati provenienti da campioni che formano una colonna devono mostrare che l'estrusione rimane al di sopra di una velocità minima dettata dai parametri sperimentali.Dopo l'ottimizzazione utilizzando questo protocollo, i dati cristallografici seriali di risoluzione del tempo possono essere raccolti presso una struttura esperta. Ciò rivelerà i cambiamenti conformazionali nell'intera proteina mentre svolge la sua funzione.

Research

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