Name: improving high viscosity extrusion of microcrystals for time-resolved serial femtosecond crystallography at x-ray lasers
Uploaded: 2019-02-28T14:30:00
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Reconhecemos a Gebhard Schertler, Rafael Abela e Chris Milne para apoiar o uso de injetores de alta viscosidade para o PSI. Richard Neutze e sua equipe são reconhecidos por discussões sobre tempo-resolvido cristalografia e entrega de amostra usando injetores de alta viscosidade. Apoio financeiro, reconhecemos o Swiss National Science Foundation para subsídios 31003A_141235, 31003A_159558 (de J.S.) e PZ00P3_174169 (para referência). Este projeto recebeu financiamento do União Europeia, Horizonte 2020 programa de pesquisa e inovação sob a concessão de Marie Sklodowska-Curie acordo n 701646.

1. preparação da amostra de cristal da proteína
<ol><li>Cerca de 30 min antes que a amostra deve ser injetado, carga 50 µ l de cristal-carregado monoleína baseado LCP em uma seringa de 100 µ l.</li>
	<li>Para injeção à pressão atmosférica: carga de 10 µ l de parafina líquida na parte de trás de uma segunda seringa. Segurando a seringa verticalmente, expulse as bolhas de ar da seringa.<ol>
<li>Para injeção em ambiente de vácuo: carga 5 µ l de MAG 7.9 e 5 µ l de parafina líquida na parte de trás de u...

O método de TR-SFX com o injector de extrusão viscoso tem provado para ser uma técnica viável para estudos de dinâmica estrutural da Bacteriorrodopsina9,10 e o fotossistema II13 e agora parece pronto para estudar proteínas dirigindo outros processos biológicos de foto como transporte de iões orientado a luz ou percepção sensorial5,50. Os protocolos descritos acima foram p...

Femtosecond serial cristalografia (SFX) é uma técnica de biologia estrutural que explora as propriedades únicas de lasers de raio-x elétron livre (XFEL) para determinar a temperatura ambiente de estruturas de milhares de cristais de tamanho micrométrico enquanto correr mais que a maioria dos os danos de radiação pela "difração antes da destruição" princípio1,2,3.
Em uma extensão de tempo-resolvido de SFX (TR-SFX), os femtosecond pulsos da XFEL são usados para estudar as alterações estruturais em proteínas4,5. A proteína de interesse é ativada com um laser óptico (ou outra atividade trigger) antes de ser baleado pelo XFEL em uma instalação de bomba-sonda. Controlando precisamente o atraso entre os pulsos de bomba e sonda, a proteína do alvo pode ser capturada em diferentes Estados. Filmes moleculares de alterações estruturais ao longo de onze ordens de grandeza no tempo demonstram o poder das novas fontes XFEL para estudar a dinâmica de várias proteínas alvos6,7,8,9, 10,11,12,13. Principalmente, o método junta-se as técnicas de estruturais dinâmicas espectroscópicas e estáticas em um só, fornecendo um vislumbre na dinâmica da proteína em perto de resolução atômica.
Sistemas simples para TR-SFX podem conter um gatilho endógeno de ativação com uma componente de foto-sensível como retinal em Bacteriorrodopsina (bR)9,10, os cromóforos no fotossistema II12,13, fotoativa proteína amarelo (PYP)6,7 photoswitchable reversível de proteína fluorescente11, ou um photolyzable monóxido de carbono em mioglobina8. Excitantes variações da técnica ainda em desenvolvimento dependem de mistura e injetam esquemas14,15 para estudar reações enzimáticas ou um campo elétrico usado para induzir mudanças estruturais16. Dado que fontes XFEL somente estão disponíveis há alguns anos e extrapolando passado sucessos no futuro, o método mostra potencial como uma real mudança de jogo no que diz respeito a nossa compreensão de como função de proteínas.
Porque amostras biológicas são destruídas por uma única exposição a uma alta potência pulso XFEL, novas abordagens de cristalografia de proteínas eram necessárias. Entre esses procedimentos, a habilidade de crescer grandes quantidades de uniforme microcristais precisava ser desenvolvidos17,18,19. Para habilitar a coleta de dados em um XFEL, estes cristais devem ser entregue, descartados e então renovados para cada pulso XFEL. Dado que XFELs fogo utilizáveis pulsos de 10 a 120 Hz, entrega de amostra deve ser rápido, estável e confiável, mantendo também os cristais intacto e limitador de consumo. Entre as soluções mais bem sucedidas é um injector de microextrusão de alta viscosidade, que proporciona um continuamente streaming de coluna de temperatura cristal-carregado lipídico fase cúbica (LCP) através de raio-x feixe pulsado20. Cristais aleatoriamente orientados, incorporadas no fluxo de LCP, que são interceptadas por dispersão de pulsos a XFEL raios-x sobre um detetor onde um padrão de difração é gravado. LCP foi uma escolha natural para um meio de entrega de amostra, como é frequentemente usado como um meio de crescimento de membrana proteínas cristais17,21,22,23, ainda outros suportes de alta viscosidade 24,25,26,,27,28,29,30 e proteínas solúveis31 também têm sido usados no injector. SFX com o injetor de alta viscosidade tem sido bem sucedido durante a determinação de estrutura de membrana proteínas13,32 incluindo G receptores (GPCRs)33,34, 36, 35,37, com qualidade de dados suficiente para nativo progressiva38,39 estando tanto tempo e amostra eficiente. Atualmente, estes injetores estão sendo usados mais rotineiramente para medições de temperatura em síncrotron fontes28,30,40,41 , bem como durante a mais tecnicamente exigindo a experiências e TR-SFX XFELs9,10,13,42.
Experimentos de TR-SFX comparáveis foram realizados usando outros tipos de injector como fase líquida entrega em um fluxo concentrado bocal6,7,12, no entanto, esse método requer quantidades de proteína não está disponíveis para muitos biologicamente interessantes destinos. Para a determinação de estruturas estáticas usando extrusão viscoso um consumo médio de 0,072 mg de proteína por padrões de difração indexado 10.000 em comparação com 9,35 mg para o jato de líquido bocais têm sido relatados (ou seja, cerca de 130 vezes mais amostra eficiente)20. O injetor de alta viscosidade tem demonstrado ser um dispositivo de entrega de amostra viável para TR-SFX enquanto apenas sacrificando algumas das de eficiência desta amostra43. Em Nogly et al. (2018)10, por exemplo, o consumo de amostra foi cerca de 1,5 mg por 10.000 padrões indexados, que compara-se favoravelmente aos experimentos de TR-SFX semelhantes usando o PYP onde o consumo médio da amostra foi muito maior com 74 mg de proteína por 10.000 padrões indexado6. Injetores de alta viscosidade, portanto, têm vantagens evidentes quando é limitar a quantidade de proteína disponível ou quando cristais são cultivadas diretamente no LCP.
Para TR-SFX utilizando alta viscosidade injetores para produzir os dados mais confiáveis várias questões técnicas devem ser abordadas: a velocidade de fluxo deve manter-se acima de um valor crítico mínimo; a taxa de sucesso deve ser mantida a um nível que não processa lento de coleta de dados (por exemplo, superior a 5%); e a amostra tem que ser entregue sem interrupções excessivas. Idealmente, estes já condições muito antes de um experimento de TR-SFX agendado para usar tempo XFEL disponível de forma mais eficiente possível. Pricipally, uma diminuição no fluxo de LCP pode permitir sondagem cristais que foram ativados com mais de um pulso de laser óptico e resultado em Estados mistos de ativos, ou sondagem material bombeado quando umpumped material é esperado no feixe. Um benefício adicional de injeção pre-teste é que o tempo de inatividade durante a coleta de dados em um XFEL é minimizado como tempo relegado para substituir bicos entupidos, mudando amostras não-expulsando, e outras tarefas de manutenção é reduzido.
Aqui, apresentamos um método para otimizar a entrega de amostra para coleta de dados TR-SFX com um injector de microextrusão de alta viscosidade. Para simplificar, os métodos descritos não contam com acesso a uma fonte de raios-x, apesar de trabalho em uma trajetória de síncrotron29 iria fornecer informações adicionais sobre as taxas de sucesso esperadas e difração de cristal. Nossos protocolos foram desenvolvidos para otimizar as experiências para capturar isomerização da retina da bomba de protões Bacteriorrodopsina10 e são realizados em duas fases, começando com a preparação de amostras de cristal para extrusão, seguida de acompanhamento a extrusão usando uma configuração de câmera de alta velocidade. Na primeira fase, o LCP cristal-carregado é misturado com o LCP adicional, lipídios de transição de baixa temperatura ou outros aditivos para garantir que a mistura final é adequada para entrega para o ambiente de amostra sem entupimento ou abrandar. Um novo acoplador de três vias seringa foi desenvolvido para melhorar a homogeneidade mistura de desempenho e amostra. A segunda fase consiste em um teste de extrusão, gravado por uma câmera de alta velocidade para medir diretamente a estabilidade de velocidade de extrusão. Após a análise dos dados de vídeo, podem ser feitos ajustes ao protocolo de preparação de amostra para melhorar os resultados experimentais. Estes procedimentos podem ser adaptados para preparar outras proteínas para coleta de dados TR-SFX, com modificações mínimas e contribuirão para a utilização eficiente dos limitados XFEL beamtime. Com novas instalações XFEL, começando sua operação44,45 e a transferência de métodos de recolha de dados de série baseado no injector para os síncrotrons28,30,40,41 , nos próximos anos certamente continuará a fornecer excitantes novos insights sobre a dinâmica estrutural de uma nunca mais ampla gama de alvos de proteína.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="744">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Mosquito LCP Syringe Coupling</td>
			<td style="width:175px;">TTP labtech store</td>
			<td style="width:101px;">3072-01050</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 &#181;l</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td style="width:101px;">HA-81065</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 &#181;l</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td style="width:101px;">HA-81265</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Monoolein</td>
			<td style="width:175px;">Nu-Chek Prep, Inc.</td>
			<td style="width:101px;">M-239</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">7.9 MAG</td>
			<td style="width:175px;">Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td style="width:101px;">850534O</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">50% w/v PEG 2000</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:101px;">MD2-250-7</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Paraffin (liquid)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">1.07162</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">High speed camera</td>
			<td style="width:175px;">Photron</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:224px;">Photron Mini AX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">High magnification lens</td>
			<td style="width:175px;">Navitar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>12X Zoom Lens System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Three axis stage</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:101px;">PT3/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Fiber light</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:101px;">OSL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Fused silica fiber</td>
			<td style="width:175px;">Molex/Polymicro</td>
			<td style="width:101px;">TSP-505375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Lite touch ferrule</td>
			<td style="width:175px;">IDEX</td>
			<td style="width:101px;">LT-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">ASU high viscosity injector</td>
			<td style="width:175px;">Arizona State University</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HPLC pump</td>
			<td style="width:175px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:101px;">LC-20AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Electronic gas regulator</td>
			<td style="width:175px;">Proportion Air</td>
			<td style="width:101px;">GP1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving high viscosity extrusion of microcrystals for time-resolved serial femtosecond crystallography at x-ray lasers

Injetores de microextrusão de alta viscosidade têm reduziu drasticamente o consumo de amostra em femtosecond serial cristalográficas experimentos (SFX) em lasers de raio-x elétron livre (XFELs). Uma série de experimentos usando a Bacteriorrodopsina de bomba de próton orientado a luz estabeleceram ainda mais estes injectores como uma opção preferencial para entregar cristais para tempo-resolvido serial femtosecond cristalografia (TR-SFX) resolver as alterações estruturais da proteínas após fotoativação. Para obter vários snapshots estruturais de alta qualidade, é essencial para coletar grandes quantidades de dados e garantir o apuramento dos cristais entre cada pulso de laser da bomba. Aqui, descrevemos em detalhe como nós aperfeiçoamos a extrusão de microcristais Bacteriorrodopsina para nossos experimentos recentes TR-SFX na fonte de luz coerente o Linac (LCLS). O objetivo do método é otimizar a extrusão para um fluxo estável e contínuo, mantendo uma elevada densidade de cristais para aumentar a taxa na qual os dados podem ser coletados em um TR-SFX experimentar. Podemos atingir este objetivo, preparando a fase cúbica lipídico com uma distribuição homogénea de cristais usando uma seringa de três vias novel dispositivo seguido ajustando a composição da amostra com base em medições da estabilidade da extrusão, tiradas com uma alta velocidade de acoplamento configuração da câmera. A metodologia pode ser adaptada para otimizar o fluxo de outros microcristais. A instalação estará disponível para usuários do novo recurso suíço Free Electron Laser.

A matéria-prima ideal para os procedimentos descritos aqui (Figura 3) são altas densidades de microcristais incorporada viscoso suporte informático para o injector. O procedimento chama-se para cerca de 50 µ l de carga transportadora de cristal para cada preparação. Estas podem ser cultivadas diretamente em LCP como com o bR9,10 usado aqui, como exemplo (Figura 4), ...

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Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

O sucesso de um experimento de cristalografia de tempo-resolvido serial femtosecond é dependente da entrega de amostra eficiente. Aqui, descrevemos os protocolos para otimizar a extrusão de Bacteriorrodopsina microcristais de um injector de microextrusão de alta viscosidade. A metodologia baseia-se na homogeneização da amostra com um romance acoplador de três vias e visualização com uma câmera de alta velocidade.

Melhorando a extrusão de alta viscosidade de microcristais de tempo-resolvido Serial Femtosecond cristalografia em Lasers de raio-x

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Este protocolo foi projetado para garantir que os problemas frequentemente encontrados durante experimentos cristalográficos em série resolvidos no tempo não comprometam a qualidade dos dados. Uma grande vantagem deste método é sua adaptabilidade aos sistemas de cristal individuais. O teste de extrusão da câmera de alta velocidade também nos permite medir diretamente a estabilidade da extrusão.Primeiro, carregue 50 microliters de monooleína cristalina baseada lCP em uma seringa de 100 microliteres cerca de 30 minutos antes da injeção. Para injeção em um ambiente de vácuo, carregue cinco microliters de MAG 7.9 e cinco microliters de parafina líquida na parte de trás de uma segunda seringa. Segurando a seringa verticalmente, expulse as bolhas de ar da seringa.Conecte a seringa com MAG 7.9 e a parafina a um acoesteador padrão de seringa. E purgar o ar do acoelhador pressionando suavemente o êmbolo até que um pequeno volume da mistura seja visível na ponta da agulha do acoelhista. Conecte a seringa amostra à seringa que leva o carro para não introduzir ar na amostra.Misture o lipídio e a parafina passando a amostra através do acoalador várias vezes. Em seguida, carregue 20 microliters de LCP pré-xado em outra seringa de 100 microliteres. Remova a seringa vazia do acoedador e conecte o LCP pré-xizado ao cristal contendo seringa usando um acoedador de seringa padrão.Então, passe a amostra pelo acoalador 100 vezes. Para trazer a amostra para a fase cúbica, adicione três microliters de monooleína e misture 50 vezes. Repita este procedimento apenas até que uma fase transparente tenha se formado para evitar um excesso de monooleína.Como um teste preliminar para rigidez e extrudabilidade da amostra, desprende a seringa vazia do acoalador de seringa, e segurando a seringa verticalmente, esprema uma pequena quantidade de amostrador através do acoalador. Se a amostra extrudada formar um cilindro vertical, então a amostra está pronta para testes de extrusão. Ajuste o volume total da amostra para 100 microliters adicionando LCP mais pré-misturada.Conecte a seringa de amostra e duas seringas vazias ao acoestrador de seringa de três vias. Misture pelo menos 50 vezes passando metade da amostra para a segunda seringa e, em seguida, pressionando ambas as metades da amostra para a terceira seringa simultaneamente. Coloque a seringa contendo a amostra mista sob um microscópio estéreo para verificar uma distribuição homogênea de cristais.Purigue uma bomba HPLC e todas as linhas de água para garantir que as taxas de fluxo sejam precisas. Em seguida, purgar o estágio hidráulico do injetor. Em seguida, ligue e conecte a câmera ao software fornecido.Com um vídeo ao vivo rodando para feedback visual, posicione a ponta do bocal no centro do quadro e coloque-a em foco com o estágio de três eixos. Defina a taxa de quadros na câmera para 1.000 quadros por segundo. Em seguida, defina a resolução para 512 por 512 pixels.Com o tempo de exposição agora definido pela taxa de quadros, ajuste o nível de iluminação até que o bocal esteja visível. Reposicione a ponta do bocal para que se centralize para a esquerda para a direita e esteja localizada no terço superior do quadro. Configure a câmera no modo lapso de tempo.Defina o intervalo para 30 segundos e as repetições para 40 vezes. Ajuste o modo de gatilho como aleatório. E digite o número de quadros para gravar para 1.000.Agora, carregue o reservatório com 20 microliters da amostra de teste e anexe o bocal capilar. Conecte o reservatório preenchido ao injetor. Em seguida, conecte a linha de gás à porta no bocal e inicie o fluxo de gás.Depois disso, inicie simultaneamente a bomba e a gravação da câmera. Monitore a extrusão até que a pressão da bomba aumente bruscamente perto do tempo final esperado. Em seguida, pare de gravar, desligue a bomba e desligue a pressão do sistema abrindo a válvula de alívio.A seguir, abra o arquivo de vídeo com o software de análise e calibrar as ferramentas de medição. Encontre um quadro no vídeo onde há um recurso rastreável visível na extrusão. Grave o número do quadro.Em seguida, avance o vídeo para um quadro onde o mesmo recurso é visível, mas mudou de sua posição na etapa anterior. Grave o número do quadro. Usando a ferramenta de medição em linha reta, meça a distância do ponto inicial e final do recurso através da medida de análise.Repita os passos anteriores algumas vezes para cada segmento do vídeo. Finalmente, plote a série de dados. O material inicial ideal para o procedimento descrito aqui são altas densidades de microcristais incorporados em um meio portador viscoso para o injetor.Cristais proteicos foram usados para coletar dados TRSFX sobre a bactéria bombeada de prótons rhodopsin, que revelou as alterações ultra rápidas que ocorrem após a absorção de fótons. Após a preparação da amostra utilizando um acotrador de três vias, a inspeção visual do material na seringa mostra homogeneidade amostral. E imagens de microscópio podem confirmar a densidade dos cristais.A amostra está na fase cúbica quando o meio de entrega é claro e viscoso. Misturas turvas são uma indicação de que a amostra está em uma fase esponja ou lamelar, mas não são conclusivas, pois a alta densidade cristalina pode obscurecer a clareza do LCP. Um teste de baixa pressão para identificar a fase da esponja pode ser realizado puxando o êmbolo da seringa para longe da amostra.Durante o teste do jato, a amostra deve extrusir uma longa coluna contínua de LCP que se move a uma velocidade quase constante. Amostras que são executadas em um modo gotejamento indicam que a viscosidade é muito baixa. Dados de amostras que formam uma coluna devem mostrar que a extrusão permanece acima de uma velocidade mínima ditada pelos parâmetros experimentais.Após a otimização usando este protocolo, os dados cristalográficos serial de resolução de tempo podem ser coletados em uma instalação especializada. Isso revelará as mudanças conformais em toda a proteína à medida que executa sua função.

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