Name: improving high viscosity extrusion of microcrystals for time-resolved serial femtosecond crystallography at x-ray lasers
Uploaded: 2019-02-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers at JoVE.com

Мы признаем Гебхард Шертлера, Рафаэль Абела и Крис Milne для поддержки использования высокой вязкости инжекторов в PSI. Ричард Neutze и его команда признаны для обсуждения времени решены Кристаллография и поставки образца с помощью форсунок высокой вязкости. Для финансовой поддержки, мы признаем, Швейцарский Национальный научный фонд для грантов 31003A_141235, 31003A_159558 (для и.с.) и PZ00P3_174169 (для п.н.). Этот проект получил финансирование от Европейского союза Horizon 2020 исследований и инновационной программы под Грант Мари-Склодовская-Кюри соглашение № 701646.

1. белки кристалл пробоподготовки
<ol><li>Около 30 минут, прежде чем образец должен быть введен, нагрузка 50 мкл кристалл Ладена monoolein на основе LCP в 100 мкл шприца.</li>
	<li>Для инъекций при атмосферном давлении: нагрузки 10 мкл жидкий парафин в задней части второго шприца. Держа шприц вертикально, ?...

TR-SFX метод с вязкой экструзии инжектор оказалась жизнеспособной техники для исследования структурной динамики бактериородопсин9,10 и фотосистемы II13 и теперь, похоже, готов для изучения белков, вождение другие биологические процессы фото как ...

Серийный Фемтосекундный кристаллографии (SFX) является структурной биологии техника, которая использует уникальные свойства свободных электронах рентгеновских лазеров (XFEL) для определения структуры комнатной температуре от тысячи микрометра размера кристаллов при опережающего большую часть излучения ущерб «дифракционный до разрушения» принцип1,2,3.
В времени решены расширение SFX (TR-SFX) фемтосекундных импульсов от XFEL используются для изучения структурных изменений в белки4,5. Протеин интереса активируется с оптического излучения (или другого действия триггера) накануне расстрела XFEL в установки насоса зонд. Точно управляя задержку между насоса и датчика импульсов, целевого белка могут быть захвачены в разных государствах. Молекулярные фильмы структурных изменений за одиннадцать порядков в время продемонстрировать мощь новых источников XFEL для изучения динамики нескольких белка цели6,,78,9, 10,11,12,13. Главным образом метод присоединяется к динамической спектроскопические и статические структурные методы в одну, обеспечивая мельком динамики белков в вблизи атомных резолюции.
Простые системы для TR-SFX может содержать эндогенного триггера активации с фото чувствительных компонентов, как сетчатки в бактериородопсин (bR)9,10, хромофоры фотосистемы II12,13, фотоактивного желтый белка (Рур)6,7 обратимо фотопереключаемых флуоресцентный белок11, или окиси углерода photolyzable в миоглобина8. Захватывающие вариации техника все еще в развитии полагаться на смеси и внедрить схемы14,15 для изучения ферментативных реакций или электрического поля используется, чтобы вызвать структурные изменения16. Учитывая, что XFEL источники были доступны лишь на несколько лет и экстраполяции прошлых успехов в будущем, метод показывает потенциал как реальная игра чейнджер в отношении нашего понимания того, как функция белков.
Поскольку биологические образцы уничтожаются путем одного контакта с высокой мощности XFEL пульс, необходимы новые подходы к кристаллография протеина. Среди этих процедур способность расти большое количество единообразных микрокристаллов необходимо развитых17,18,19. Чтобы включить сбор данных на XFEL, эти кристаллы должны доставлено, отбрасываются и затем вновь для каждого импульса XFEL. Учитывая, что XFELs огонь полезная импульсов на 10-120 Гц, поставки образца должны быть быстрой, стабильной и надежной, сохраняя также кристаллы нетронутыми и ограничения потребления. Среди наиболее успешных решений — инжектор микро экструзии высокой вязкости, который обеспечивает непрестанно потокового столбца комнатной температуре кристалл Ладена липидный кубической фазы (LCP) через импульсного рентгеновского луча20. Случайным образом ориентированных кристаллах, внедренной в поток LCP, которые перехватываются XFEL импульсов точечных рентгеновских лучей на детектор, где записывается дифракционный рисунок. LCP был естественным выбором для доставки средних образца, как часто используется как средство роста для мембранных белков кристаллы17,21,22,23, еще других высоковязких перевозчик СМИ 24,25,26,27,28,,2930 и31 растворимые белки также были использованы в инжектор. Во время определения структуры мембранных белков13,32 G белка-рецепторы (GPCR)33,34, в том числе успешно SFX с высокой вязкостью инжектор 35,,3637, с качеством данных, достаточных для родной фазирования38,39 во время как время, так и примеры эффективной. В настоящее время, эти форсунки более регулярно используются для измерения комнатной температуры в синхротрона источников28,30,40,41 , а также в ходе более технически требуя TR-SFX эксперименты в XFELs9,10,13,42.
Сопоставимых TR-SFX эксперименты проводились с использованием других типов инжектор как жидкой фазы доставки в потоке сосредоточены сопла6,7,12, однако, этот метод требует белка суммы не доступны для многих биологически интересных задач. Для определения статического структур с использованием вязких экструзии среднее потребление 0,072 мг белка на 10000 индексированных дифракционные текстуры по сравнению с 9.35 mg для Жидкоструйный насадки были зарегистрированы (то есть, около 130 раз больше образца эффективное)20. Высокая вязкость инжектор было показано, быть жизнеспособными образца доставки устройство для TR-SFX пока только жертвуя некоторые из этого образца эффективности43. В Ногли et al. (2018)10, например, образец потребления был около 1,5 мг на 10000 индексированных шаблонов, который выгодно отличается от аналогичных TR-SFX экспериментов с использованием PYP, где потребление среднего образца была значительно выше, с 74 мг белка на 10 000 индексированные моделей6. Высокая вязкость инжекторов таким образом имеют явные преимущества при ограничении количества белка доступны или когда кристаллы выращивают непосредственно в LCP.
Для TR-SFX с использованием высокой вязкости Инжекторы для получения наиболее достоверных данных несколько технических вопросов необходимо решать: скорость потока должна оставаться выше минимального критического значения; хит ставка должна поддерживаться на уровне, который не отображают медленно сбора данных (например, более чем на 5%); и образец должен быть доставлен без чрезмерных потрясений. В идеале, уже выполнены эти условия задолго до запланированного TR-SFX эксперимент, чтобы максимально эффективно использовать имеющееся время XFEL. Pricipally, замедление в потоке LCP может позволить зондирующего кристаллов, которые были активированы с более чем одной оптической лазерного импульса и результат в смешанных активных государств, или зондирования перекачиваемого материала, когда материал umpumped ожидается в пучке. Дополнительное преимущество инъекций предварительного тестирования, что время простоя во время сбора данных на XFEL свернуто как время отводится для замены засоренные сопла, изменения не прессовать образцы, и другие задачи обслуживания уменьшается.
Здесь мы представляем способ оптимизировать поставки образца для TR-SFX сбора данных с высокой вязкостью микро экструзии инжектор. Для простоты описанных методов не полагайтесь на доступ к источнику рентген, хотя работа Синхротронное излучение29 представит дополнительную информацию на ожидаемые хит ставки и кристалл дифракции. Наши протоколы были разработаны для оптимизации эксперименты для захвата сетчатки изомеризации в Протон насос бактериородопсин10 и осуществляется в два этапа, начиная с подготовки образцов кристалл для экструзии, следуют контроля экструзии с помощью высокоскоростной камеры установки. На первом этапе кристалл Ладена LCP смешивается с дополнительные LCP, низкой перехода температуры липиды или другие добавки, чтобы убедиться, что окончательный смесь подходит для доставки в демонстрационной среде без забивания или замедления. Новый шприц трехходовой стяжку был разработан для улучшить однородность смешивания производительности и образца. Второй этап состоит из теста экструзии, записанная с помощью высокоскоростной камеры непосредственно измерить стабильность скорости экструзии. После анализа видео данных можно внести изменения протокола Подготовка образца для улучшения экспериментальных результатов. Эти процедуры могут быть адаптированы для подготовки других белков TR-SFX сбора данных, с минимальными изменениями и будет способствовать эффективному использованию ограниченных XFEL beamtime. С новой XFEL зал просто начиная44,их эксплуатации45 и передачи последовательных данных, основанных на инжектор методов сбора synchrotrons28,30,40,41 , в ближайшие несколько лет несомненно будет продолжать оказывать захватывающее новое понимание структурной динамики все более широкий спектр белковых мишеней.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="744">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Mosquito LCP Syringe Coupling</td>
			<td style="width:175px;">TTP labtech store</td>
			<td style="width:101px;">3072-01050</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 &#181;l</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td style="width:101px;">HA-81065</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 &#181;l</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td style="width:101px;">HA-81265</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Monoolein</td>
			<td style="width:175px;">Nu-Chek Prep, Inc.</td>
			<td style="width:101px;">M-239</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">7.9 MAG</td>
			<td style="width:175px;">Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td style="width:101px;">850534O</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">50% w/v PEG 2000</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Dimensions</td>
			<td style="width:101px;">MD2-250-7</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Paraffin (liquid)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">1.07162</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">High speed camera</td>
			<td style="width:175px;">Photron</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:224px;">Photron Mini AX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">High magnification lens</td>
			<td style="width:175px;">Navitar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>12X Zoom Lens System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Three axis stage</td>
			<td style="width:175px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:101px;">PT3/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Fiber light</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:101px;">OSL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Fused silica fiber</td>
			<td style="width:175px;">Molex/Polymicro</td>
			<td style="width:101px;">TSP-505375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Lite touch ferrule</td>
			<td style="width:175px;">IDEX</td>
			<td style="width:101px;">LT-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">ASU high viscosity injector</td>
			<td style="width:175px;">Arizona State University</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HPLC pump</td>
			<td style="width:175px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:101px;">LC-20AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Electronic gas regulator</td>
			<td style="width:175px;">Proportion Air</td>
			<td style="width:101px;">GP1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving high viscosity extrusion of microcrystals for time-resolved serial femtosecond crystallography at x-ray lasers

Высокой вязкости микро экструзии инжекторы резко сократили потребление образца в серийный Фемтосекундный кристаллографических экспериментов (SFX) на свободных электронах рентгеновских лазеров (XFELs). Далее ряд экспериментов с использованием света driven протонного насоса бактериородопсин создали эти форсунки в качестве предпочтительного варианта доставить кристаллы для кристаллографии (TR-SFX) время решена серийный Фемтосекундный решить структурные изменения белки, после photoactivation. Чтобы получить несколько структурных снимки высокого качества, важно для сбора больших объемов данных и обеспечить Распродажа кристаллов между каждый насос лазерного импульса. Здесь мы подробно описать, как мы оптимизировали экструзии бактериородопсин микрокристаллов для нашей недавно TR-SFX экспериментов в Linac последовательной источник света (ССК). Цель метода – оптимизировать экструзии для стабильного и непрерывного потока при сохранении высокой плотности кристаллов для увеличения скорости на которых данные могут быть собраны в TR-SFX эксперимент. Мы достичь этой цели путем подготовки липидный кубической фазы с равномерное распределение кристаллов с помощью Роман трехходовой шприца сцепного устройства, затем регулируя состав образец, основанный на инструментальных замерах стабильности экструзии, с высокоскоростной установки камеры. Методология может быть адаптирована для оптимизации потока микрокристаллов других. Установка будет доступна для пользователей данного объекта Новый швейцарский бесплатно электронах.

Высокой плотности микрокристаллов, включены в вязкой перевозчика среднего для инжектора идеальным исходным материалом для выполнения процедур, описанных здесь (рис. 3). Процедура требует около 50 мкл кристалл Ладена перевозчика для каждого приготовлен...

Watch this Scientific Journal Video about Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers at JoVE.com

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Успех эксперимента кристаллографии времени решены серийный Фемтосекундный зависит от эффективного образца доставки. Здесь мы описываем протоколы для оптимизации экструзионных бактериородопсин микрокристаллов от инжектора микро экструзии высокой вязкости. Методология опирается на пример гомогенизации с Роман трехходовой стяжки и визуализации с помощью высокоскоростной камеры.

Улучшение экструзии высокой вязкости микрокристаллов для времени решены серийный Фемтосекундный кристаллографии в рентгеновских лазеров

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Этот протокол был разработан для того, чтобы проблемы, часто встречаемые во время серийных кристаллографических экспериментов, не скомпрометировали качество данных. Одним из основных преимуществ этого метода является его адаптивность к отдельным кристаллическим системам. Высокоскоростной экструзио-тест камеры также позволяет нам непосредственно измерять стабильность экструзии.Во-первых, загрузите 50 микролитров кристаллообразного монолеина на основе LCP в 100 микролитровый шприц примерно за 30 минут до инъекции. Для инъекций в вакуумную среду загрузите пять микролитров MAG 7.9 и пять микролитров жидкого парафина в заднюю часть второго шприца. Держа шприц вертикально, изгнать пузырьки воздуха из шприца.Соедините шприц с MAG 7.9 и парафином со стандартным парой шприцев. И очистить воздух от пары, осторожно нажав на поршень, пока небольшой объем смеси не будет виден на кончике иглы парпера. Подключите образец шприца к шприцу, который берет машину, чтобы не вводить воздух в образец.Смешайте в липид и парафин, передавая образец через пару несколько раз. Затем загрузите 20 микролитров предварительно смешанного LCP в еще 100 микролитровых шприцев. Удалите пустой шприц из парпера и прикрепите предварительно смешанный LCP к кристаллу, содержащем шприц, используя стандартный парой шприцев.Затем, передать образец через пару 100 раз. Чтобы довести образец до кубической фазы, добавьте три микролитров монооляина и смешайте 50 раз. Повторите эту процедуру только до тех пор, пока не сформит прозрачную фазу, чтобы избежать избытка монооляина.В качестве предварительного теста на прочность образца и экструдируемость, отсоединить пустой шприц от шприца парпер, и проведение шприц вертикально, сжать небольшое количество пробоя через парпер. Если экструдированная проба образует вертикальный цилиндр, то образец готов к экструзио-тестированию. Отрегулируйте общий объем выборки до 100 микролитров, добавив больше предварительно смешанных LCP.Прикрепите образец шприца и два пустых шприца к тройке шприца. Смешайте по крайней мере 50 раз, передав половину образца во второй шприц, а затем нажав обе половинки образца в третий шприц одновременно. Поместите шприц, содержащий смешанный образец, под стерео микроскопом, чтобы проверить однородное распределение кристаллов.Очистить насос HPLC и все линии водоснабжения, чтобы обеспечить точность тарифов потока. Затем прочистим гидравлическую стадию инжектора. Затем включите и подключите камеру к поставляемому программному обеспечению.С живым видео работает для визуальной обратной связи, положение сопла кончик в центре кадра и привести его в фокус с трехосевой стадии. Установите частоту кадров на камеру до 1000 кадров в секунду. Затем установите разрешение до 512 на 512 пикселей.Теперь, когда время экспозиции устанавливается частотой кадров, отрегулируйте уровень освещенности до тех пор, пока сопло не будет видно. Перепозиционировать кончик сопла так, чтобы он по центру слева направо и расположен в верхней трети кадра. Настройка камеры в режиме промежуток времени.Установите интервал до 30 секунд и повторы до 40 раз. Установите режим триггера случайным образом. И введите количество кадров для записи до 1000.Теперь загрузите резервуар 20 микролитров испытательного образца и прикрепите сопло капилляров. Прикрепите заполненный резервуар к инжектору. Затем прикрепите газовую линию к порту на сопло и запустите поток газа.После этого одновременно запустите насос и запись камеры. Мониторинг экструзии до тех пор, пока давление насоса резко не возрастет в течение ожидаемого времени окончания. Затем прекратите запись, выключите насос и вывечь давление системы, открыв клапан рельефа.После этого откройте видеоф файл с помощью программного обеспечения для анализа и откалибровайте измерительные инструменты. Найдите кадр в видео, где есть отслеживаемая функция, видимая в экструзии. Завехай номер кадра.Затем переветь видео в кадр, где та же функция видна, но перешла из своего положения на предыдущем этапе. Завехай номер кадра. Используя инструмент измерения прямой линии, измерьте расстояние от начала и точки конца объекта с помощью измерения анализа.Повторите предыдущие шаги несколько раз для каждого сегмента видео. Наконец, сюжет серии данных. Идеальным стартовым материалом для описанной здесь процедуры является высокая плотность микрокристалл, включенных в вязкую носительную среду для инжектора.Кристаллы белка были использованы для сбора данных TRSFX о протонной перекачиваемой бактерии родопсин, который показал ультра быстрые изменения, которые происходят после поглощения фотона. После подготовки образца с использованием трехмерного парпера, визуальный осмотр материала в шприце показывает однородность образца. А изображения микроскопа могут подтвердить плотность кристаллов.Образец находится в кубической фазе, когда среда доставки ясна и вязкая. Turbid смеси являются признаком того, что образец находится в губке или ламеллярд фазы, но не являются окончательными, как высокая плотность кристалла может скрыть ясность LCP. Тест низкого давления для определения фазы губки может быть выполнен путем вытягивания поршеня шприца от образца.Во время испытания струи, образец должен выдавить длинный непрерывный столбец LCP, который движется с почти постоянной скоростью. Образцы, которые работают в режиме капель, указывают на то, что вязкость слишком низка. Данные из образцов, которые образуют столбец, должны показать, что экструзия остается выше минимальной скорости, продиктованной экспериментальными параметрами.После оптимизации с помощью этого протокола разрешение времени серийные кристаллографические данные могут быть собраны в экспертном центре. Это покажет конформациальные изменения в всем белке по мере того как оно выполняет свою функцию.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Подготовка прилипшие клетки для рентгеновской флуоресценции изображений по химической фиксации

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

Рентгеновская дифракция в порошок по сохранению науки: На пути к Обычной кристаллической структуры Определение продуктов коррозии на наследие предметов искусства

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Sediment Core Extrusion Method at Millimeter Resolution Using a Calibrated, Threaded-rod

Отложения сердечника Экструзия Метод на миллиметровых Разрешение с помощью калиброванного, резьбовой стержень

Aquatic sediment core subsampling is commonly performed at cm or half-cm resolution. Depending on the sedimentation rate and depositional environment, ...

High Pressure Single Crystal Diffraction at PX^2

Высокое давление монокристалл дифракция при РХ ^ 2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Количественная оценка рентгеновской флуоресценции данных с использованием карты

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Время решена изучены фотофизические характеристика триплет-сбор органических соединений в бескислородной среде, с использованием iCCD камеры

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

An Experimental Protocol for Femtosecond NIR/UV - XUV Pump-Probe Experiments with Free-Electron Lasers

Экспериментальный протокол для фемтосекундных NIR/УФ - XUV насос зонд эксперименты с лазеры на свободных электронах

This protocol describes key steps in performing and analyzing femtosecond pump-probe experiments that combine a femtosecond optical laser with a ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic чипы для In Situ кристалл рентгеновской дифракции и на месте Динамическое рассеяние света для последовательного кристаллографии

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

Основные металлические поглощения в грамотрицательных бактерий: рентгеновская флюоресценция, радиоизотопов и клеточной фракционирования

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Элементаль чувствительных обнаружение химии в батареи через мягкие рентгеновской спектроскопии поглощения и резонансных неупругого рентгеновского рассеяния

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...