Name: effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet i en del af en JSPS KAKENHI tilskud fra Japan-samfund til fremme af videnskab (nr. 16K 11776 for at H. K., No. 17K 17306 til K. S., nr. 16K 20637 til K. K., No. 16K 20636 til M. S., nr. 18K 09862 til I. M.).

Alle dyr procedurer og pasning af dyr blev udført ifølge Tohoku Universitet regler og forordninger.
1. murine Hindlimb dissektion og håndtering
<ol><li>Før dissektion, fylde en tallerken med ca. 50 mL af α-MEM afhængigt af størrelsen af containeren og placere den på is. Dette vil tjene som en samling beholder indtil dissektion af alle knogler er fuldført. For dette og efterfølgende bruge eksperimenter, α-MEM indeholdende 10% føtal bovint serum (FBS), 100 IE/mL penicillin G, og 10...

<ol>
	<li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoimmunology:+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss.">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts.">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li><li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF/RANKL-RANK+interaction.">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis.">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li><li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction.">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li><li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor.">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li><li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation.">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis.">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li><li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo.">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li><li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model.">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice.">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement.">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li><li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes.">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li><li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development.">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes &amp; Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li><li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+(op/op)+mouse.">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li><li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis.">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li><li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints.">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li></ol>

I denne undersøgelse undersøgte vi effekten af anti-c-fms antistof på RANKL-induceret osteoklast dannelse, TNF-α-induceret osteoklast dannelse og M-CSF-induceret osteoklast forløber spredning. Vi fandt, at den effektive anti-c-fms antistof til hæmning af osteoclastogenesis blandt RANKL-induceret osteoklast dannelse, TNF-α induceret osteoklast dannelse og M-CSF-induceret spredning af osteoklast prækursorer er forskellige.
RANKL medierer osteoclastogenesis i nærværelse af M-CSF in vitr...

Osteoklaster er højt specialiserede celler, og de differentiere fra hæmatopoietisk stamceller via fusion af flere osteoklast prækursorer. De er afgørende for sund knogle remodellering og bidrage til patologiske knogleresorption associeret med inflammatorisk osteolytiske sygdomme som leddegigt og paradentose1.
Osteoclastogenesis og osteoklast funktion er medieret af to centrale faktorer; makrofag koloni stimulerende faktor (M-CSF) og receptor aktivator af nuclear factor kappa B ligand (RANKL). Både M-CSF og RANKL er vigtigt, at osteoklast differentiering2. En anden faktor, som har vist sig at fremkalde osteoklast dannelse fra knoglemarven makrofager in vitro-er tumor nekrose faktor alfa (TNF-α)3,4,5. TNF-α medieret osteoklast dannelse har vist sig at være afgørende for osteolyse i destruktive bone sygdomme som leddegigt6, paradentose7og postmenopausale osteoporose8.
C-fms er membran receptor af M-CSF og medierer sin indsats. Rollen som c-fms er veldokumenteret i litteraturen som det blev påvist, at administrationen af et antistof mod c-fms (anti-c-fms antistof) helt anholdt osteoclastogenesis i en arthritis model samt i TNF-α induceret knogle erosioner mens osteoclastogenesis fjernt fra det betændte fælles var stadig robust9. Administration af anti-c-fms antistof hæmmede osteoklast dannelse og knogle resorption induceret af LPS (LPS) i mus calvariae10 såvel som i LPS-induceret parodontitis model11. Derudover hæmmede anti-c-fms antistof mekanisk stress-induceret root resorption under Ortodontisk tand bevægelse12, som Ortodontisk tand bevægelse og knogleresorption forbundet med tandregulering tand bevægelse13.
M-CSF er blevet rapporteret at have andre funktioner, som er afgørende for at vært immunrespons. Fravær af M-CSF i op/op mus med bakteriel lungebetændelse føre til øget bakteriel byrde og bakteriel spredning til leveren med levernekrose14. Derfor, M-CSF er vigtigt for immunologisk respons i beskyttelse mod infektion.
Denne undersøgelse viser effekten af anti-c-fms antistof på M-CSF og RANKL eller TNF-α induceret osteoklast formation in vitro- og M-CSF induceret spredning af osteoklast prækursorer. Denne protokol viser isolering af murine knoglemarv celler fra lange knogler, og de skridt til at generere knoglemarv makrofager (BMM), der betragtes som osteoklast prækursorer og at inducere differentiering af BMM i multinuclear osteoklaster af to metoder; enten RANKL eller TNF-α. Protokollen sammenligner også anholdelsen af osteoclastogenesis i begge metoder, anti-c-fms antistof.
Den proces som knoglemarven er udvundet og efterfølgende bruges til at generere osteoklast prækursorer er pålidelige i producerer store mængder af ren osteoklast kulturer, som kan bruges i flere downstream applikationer som dopingkontrol. Brug af enten RANKL eller TNF-α til at fremkalde osteoclastogenesis i denne protokol adskiller osteoclastogenesis som en fysiologisk proces (RANKL) fra osteoclastogenesis som patologiske proces (TNF-α), som igen indeholder to alternative procedurer til at guide den beslutning, hvoraf én er overlegen med hensyn til reagenser skal bruges i efterfølgende ansøgninger. Denne protokol indeholder også en metode, hvorved vi kan bestemme en passende koncentration af anti-c-fms-antistof, der kan anvendes sikkert for senere studier involverede i knogleresorption og osteolytiske sygdomme.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-c-Fms antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant murine TNF-&#945; prepared in our laboratory. TNF-&#945; cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-&#945; was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-&#945; was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer&#8217;s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-11</td>
			<td>Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14&#8211;12 cell line culture supernatant at 5X106&#160;cells in a 10-cm suspension culture dish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>with L-Glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>s1820-500</td>
			<td>Fetal Bovine Serum French Origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>100 mm x 20 mm style dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nun clon Delta surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting kit-8</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>40 &#956;m Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>50 mL CentriStar cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro

Knogle remodellering er en kompleks proces, og det indebærer perioder med deposition og resorption. Knogleresorption er en proces, hvormed knogle er opdelt efter osteoklaster i respons på forskellige stimuli. Osteoklast prækursorer differentiere i multinuclear osteoklaster svar på makrofag koloni stimulerende faktor (M-CSF) og receptor aktivator af nuclear factor Kappa B ligand (RANKL). Patologiske betingelser, cytokin-profil er forskellige og omfatter en blanding af inflammatoriske cytokiner. Tumor nekrose faktor alfa (TNF-α) er en af de vigtigste cytokiner som det findes i store mængder i områder, der indgår med inflammatoriske osteolyse. Formålet med denne protokol er at tilvejebringe en metode, hvorved murine knoglemarven er isoleret for at generere osteoklaster gennem induktion med M-CSF og enten RANKL eller TNF-α, som efterfølgende blive hæmmet af stigende doser af anti-c-fms antistof, receptoren for M-CSF. Dette eksperiment fremhæver den terapeutiske værdi af anti-c-fms antistof i sygdomme i inflammatoriske knogleresorption.

Formålet med denne protokol er at vurdere effekten af anti-c-fms antistof på osteoklast dannelse RANKL eller TNF-α, og at fastlægge effekten af M-CSF på osteoklast prækursorer spredning. I denne protokol, har vi leveret en pålidelig proces, hvor store mængder af ren osteoklast kulturer er genereret. Vi leverer også en måde at teste anti-c-fms antistof passende koncentration for hæmme osteoklast dannelse under forskellige kultur betingelser.
<p class="jove_content" fo:keep-t...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro at JoVE.com

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Denne protokol omfatter dissektion af murine lange knogler og knoglemarv isolation, at generere knoglemarv makrofager og producere osteoklaster ved hjælp af makrofag koloni stimulerende faktor (M-CSF) og receptor aktivator af nuclear factor Kappa B ligand (RANKL) eller tumor nekrose faktor alfa (TNF-α) og deres anholdelse af anti-c-fms antistof, M-CSF receptor.

Effekten af Anti-c-fms antistof på osteoklast dannelse og spredning af osteoklast forløber In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Dette eksperiment fremhæver den terapeutiske værdi af Anti-c-fms antistof i sygdomme af inflammatorisk knogle forstyrrelser, såsom leddegigt og parodontitis. Den proces, hvorefter knoglemarven udvindes og anvendes til at generere osteoklastprækursorer, giver store mængder af ren osteoklast, som kan anvendes i flere downstream applikationer. Denne protokol giver to alternative metoder til osteoklastogenese, enten ved hjælp af RANKL ligand eller TNF alpha.Derudover giver denne metode indsigt i virkningen af anti-c-fms antistof på osteoklastogenese. Visuel demonstration af denne procedure gør forskeren bekendt med processen med dissektion og opnåelse af knoglemarvsceller i store mængder. Til at begynde at fylde en plade, der vil tjene som en samling beholder med ca 50 milliliter alfa MEM, afhængigt af størrelsen af beholderen, og læg den på is.Brug stifter til at gennembore håndfladerne og fødderne af en aflivet mus til at ordne det i liggende position, og spray grundigt med 70% ethanol. Brug steril kirurgisk saks og pincet til at lave en hud snit på niveau med hoften og udvide den ned til fødderne, udsætter musklerne. Find og skær senen fastgørelse af quadriceps musklen.Skræl musklen væk og skær den på niveau med hoften. Derefter finde senen fastgørelse af forstrækning muskel til knoglen. Skræl væk musklerne udsætter knoglen, og frigør forstrækning fra sin tilknytning, og sørg for ikke at skære ind i knoglen.Placer saksen mellem lårbenets hoved og det fælles rum. Skær i det frigøre lårbenet, men at holde knoglen intakt, hvilket vil gøre det muligt løsrivelse af knoglerne uden risiko for at udsætte knoglemarven. Cutaway musklerne knyttet til skinnebenet på en lignende måde.Skær derefter skinnebenet fri fra sin tilknytning ved ankelleddet, samtidig med at knoglen holdes intakt for at undgå forurening. Brug sakseblade og laboratorieservietter til at skrabe eventuelle resterende blødt væv fra lårbenet og skinnebenet og læg dem i den forberedte plade med alpha MEM placeret på is. Dissektionen skal udføres omhyggeligt for at minimere kontaminering.Derfor er grundig bløddelsfjernelse og knogle lokalisering er afgørende. Fyld en 30 gauge kanylesprøjte med alfa MEM. Afbryd skinnebenet og lårbenet væk fra knæleddet, og skær enderne af den lange knogle fra begge sider ved hjælp af en saks.Brug en pincet til at holde knoglen fra akslen. Sæt nålen i marv rummet til knoglen og langsomt skylle indholdet af marv i en seks centimeter kultur parabol og gentag for alle knogler. Knoglen bliver hvid, hvilket indikerer udvinding af alt knoglemarvsindhold.Brug en 40 mikrometer nyloncelles si til at belaste knoglemarvsekstraktet til et 50 milliliter konisk centrifugerør. Centrifuge røret ved 300 gange G i fem minutter. Kassér supernatanten.For at vaske, tilsættes fem milliliter alfa MEM til pellet. Pipette cellerne til at frigøre dem, centrifuge, og gentag vask i alt to gange. Efter optælling af disse isolerede celler, som beskrevet i manuskriptet, frø 10 millioner celler pr 10 milliliter, i en 10 centimeter kultur parabol, og tilsæt M-CSF til cellerne.Inkuber kulturen ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid i tre dage. Fjern mediet efter tre dage, og vask cellerne to gange kraftigt med 10 milliliter PBS for at fjerne ikke-vedhæftige celler. Tilføj fem milliliter stuetemperatur 0,02% trypsin-EDTA og PBS, og inkubere ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid i fem minutter.Pipette cellerne grundigt for at frigøre dem. Overhold kulturen under et mikroskop for at sikre, at cellerne er blevet afmonteret og fremstår afrundet og flydende i medier. Når cellerne er blevet løsrevet, inaktiveres reaktionen ved at tilføje fem milliliter alfa-MEM.Cellerne opsamls i et konisk rør med 50 milliliter og centrifugeres ved 300 gange G i fem minutter. Efter udsmid af supernatanten vaskes med fem milliliter alfaMEMM og centrifugeres igen ved 300 gange G i fem minutter. Re-suspendere pellet i 10 milliliter alfa MEM.Seed 1 million celler pr 10 milliliter i en 10 centimeter kultur parabol, og tilsæt M-CSF. Inkuber kulturen ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid i tre dage. Høst de tilknyttede celler, som repræsenterer BMMs som osteoklast prækursorer efter tre dage, som gjort tidligere under generation af BMMs.Frø BMMs på 50, 000 celler pr 200 mikro liter alfa MEM i en 96 godt plade per brønd. Til hver brønd, tilføje ønskede stimuli. Og derefter tilføje M-CSF for en endelig koncentration på 100 nanogram per milliliter.Tilføj Anti-c-fms antistof til hver brønd. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid i fire dage, mens skiftende medier hver anden dag i fire dage. Og derefter gå videre med farvning og analyser, som beskrevet i manuskriptet.Osteoklastdannelsen i M-CSF og RANKL-behandlet kultur med anti-c-fm-antistof blev evalueret. Med 101, 000 nanogram pr. milliliter anti-c-fms antistof blev der observeret et betydeligt fald i antallet af osteoklaster sammenlignet med kontrol. Mens der, med en ud af 10 nanogram pr milliliter Anti-c-fms antistof, der var ingen signifikant fald.Derefter blev osteoklastdannelsen i M-CSF og TNF alfabehandlet kultur med anti-c-fms antistof evalueret. Med 10, 100, 1.000 nanogram pr. milliliter anti-c-fm-antistof blev der observeret et betydeligt fald i antallet af osteoklaster sammenlignet med kontrol, uden signifikant fald ved et nanogram pr. milliliter. Og M-CSF kultur med 1, 10, 100 nanogram pr milliliter Anti-c-fms antistof, var der ingen signifikant nedgang i antallet af osteoklast prækursorer i forhold til kontrol.Ved 1.000 nanogram pr. milliliter var der imidlertid et betydeligt fald i antallet af osteoklastprækursorer, hvilket indikerer, at en koncentration helt op til 1.000 nanogram pr. milliliter er nødvendig for at hæmme spredningen af osteoklastprækursorer betydeligt. Sørg for at frigøre bindingerne og samtidig holde knoglen intakt, hvilket vil minimere risikoen for forurening.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Måling af antistof Virkninger på cellulær funktion af isolerede cardiomyocytes

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Den synergistiske virkning af synligt lys og Gentamycin på<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Mikroorganismer

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Undersøge effekterne af probiotika på Pneumokok Colonization Brug af en<em&gt; In Vitro</em&gt; Adhærenceprøven

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Metoder til kvantitativ påvisning af antistof-induceret komplement aktivering på de røde blodlegemer

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Makrofag Kolesterol Udtømmelse og dens indflydelse på fagocytose af<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Generation af lymfatisk mikropartikler og påvisning af deres proapoptotiske Påvirkning af luftvejsepitelceller

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Måling af ekstracellulær DNA udledning og kvantitativ NET Formation i humane neutrofiler<em&gt; In vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Dechifrere og Imaging Patogenese og Cording af<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; I zebrafisk embryoner

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infektiøs Cell Culture System og<em&gt; In vitro</em&gt; Profylaktiske virkning af interferoner

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...