Name: effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door een JSPS KAKENHI verlenen uit hoofde van de vereniging van Japan voor de promotie van wetenschap (nr. 16K 11776 aan H. K., No. 17K 17306 aan K. S., No. 16K 20637 aan K. K., No. 16K 20636 naar M. S., No. 18K 09862 tot I. M.).

Alle dierlijke procedures en verzorging van de dieren werden uitgevoerd volgens Universiteit Tohoku regels en voorschriften.
1. lymfkliertest stuk dissectie en behandeling
<ol><li>Voordat de dissectie, vul een plaat met ongeveer 50 mL α-MEM afhankelijk van de grootte van de container en plaats deze op het ijs. Dit zal dienen als een collectie container totdat de dissectie van alle beenderen voltooid is. Voor deze en latere experimenten, α-MEM met 10% foetale runderserum (FBS), 100 IU/mL pe...

<ol>
	<li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoimmunology:+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss.">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts.">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li><li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF/RANKL-RANK+interaction.">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis.">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li><li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction.">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li><li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor.">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li><li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation.">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis.">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li><li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo.">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li><li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model.">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice.">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement.">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li><li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes.">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li><li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development.">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes &amp; Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li><li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+(op/op)+mouse.">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li><li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis.">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li><li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints.">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li></ol>

In deze studie onderzochten we het effect van anti-c-fms antilichaam RANKL-geïnduceerde osteoclast vorming, TNF-α-geïnduceerde osteoclast vorming en M-CSF-geïnduceerde osteoclast voorloper proliferatie. We vonden dat de effectieve hoeveelheid anti-c-fms antilichaam voor de remming van de osteoclastogenesis tussen RANKL geïnduceerde osteoclast vorming, TNF-α geïnduceerde osteoclast vorming en M-CSF-geïnduceerde proliferatie van osteoclast precursoren anders is.
RANKL bemiddelt osteoclas...

Osteoclasten zijn gespecialiseerde cellen, en ze onderscheiden van hematopoietische stamcellen door de fusie van meerdere osteoclast precursoren. Ze zijn essentieel voor het remodelleren van gezond bot en bijdragen aan de pathologische bot resorptie osteolytic ontstekingsziekten zoals reumatoïde artritis en Parodontitis1is gekoppeld.
Osteoclastogenesis en osteoclast functie worden gemedieerd door twee belangrijke factoren; macrophage kolonie stimulerende factor (M-CSF) en receptor activator van nuclear factor-kappa-B ligand (RANKL). Zowel M-CSF en RANKL zijn belangrijk voor osteoclast differentiatie2. Een andere factor die heeft aangetoond voor het opwekken van osteoclast vorming van beenmerg macrofagen in vitro is Tumornecrosefactor alfa (TNF-α)3,4,5. TNF-α gemedieerde osteoclast vorming is aangetoond dat het van doorslaggevend belang voor osteolyse in destructieve bot ziekten zoals reumatoïde artritis6, parodontitis7en postmenopauzale osteoporose8.
C-fms is de receptor membraan van M-CB en bemiddelt haar optreden. De rol van c-fms is goed gedocumenteerd in de literatuur, zoals het werd aangetoond dat de administratie van een antilichaam tegen c-fms (anti-c-fms antilichaam) volledig osteoclastogenesis in een artritis model gearresteerd, alsook in TNF-α geïnduceerde bot erosies terwijl osteoclastogenesis verre van het ontstoken gewricht was nog steeds robuust9. Toediening van anti-c-fms antilichaam geremd osteoclast vorming en bot resorptie geïnduceerd door lipopolysaccharide (LPS) in muis calvariae10 zo goed zoals in LPS-geïnduceerde parodontitis model11. Bovendien, anti-c-fms antilichaam geremd mechanische stress-geïnduceerde wortel resorptie tijdens orthodontische tand verkeer12, evenals orthodontische tand verkeer en bot resorptie orthodontische tand verkeer13zijn gekoppeld.
M-CSF heeft gemeld dat de andere functies die essentieel voor de immuunrespons van de gastheer zijn. Het ontbreken van M-CB in op/op muizen met bacteriële longontsteking leiden tot de toename van bacteriële belasting en bacteriële verspreiding aan de lever met hepatische necrose14. M-CSF is daarom belangrijk voor immunologische reactie op het gebied van de bescherming tegen infectie.
Deze studie toont het effect van anti-c-fms antilichaam op M-CSF en RANKL of TNF-α geïnduceerde osteoclast vorming in vitro en M-CSF geïnduceerde proliferatie van osteoclast precursoren. Dit protocol toont het isolement van lymfkliertest beenmergcellen van lange beenderen en de stappen voor het genereren van beenmerg macrofagen (BMM), die worden beschouwd als osteoclast precursoren en voor het opwekken van de differentiatie van de BMM in multinuclear osteoclasten door twee methoden; RANKL of TNF-α. Het protocol vergelijkt ook de arrestatie van osteoclastogenesis in beide methoden met behulp van anti-c-fms antilichaam.
Het proces waarbij het beenmerg is geëxtraheerd en vervolgens gebruikt voor het genereren van osteoclast precursoren is betrouwbaar in het produceren van grote hoeveelheden van pure osteoclast culturen die kunnen worden gebruikt in meerdere downstream toepassingen zoals drug testen. Het gebruik van RANKL of TNF-α ertoe osteoclastogenesis in dit protocol onderscheidt osteoclastogenesis als een fysiologische proces (RANKL) van osteoclastogenesis als een pathologische proces (TNF-α), dat op zijn beurt twee alternatieve procedures biedt te begeleiden de beslissing waarvan één is superieur in termen van de reagentia om in downstream toepassingen worden gebruikt. Dit protocol biedt ook een methode waarmee we een geschikte concentratie van anti-c-fms-antilichaam dat veilig kan worden gebruikt voor latere studies deelnemen aan bot resorptie en osteolytic ziekten kunnen bepalen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-c-Fms antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant murine TNF-&#945; prepared in our laboratory. TNF-&#945; cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-&#945; was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-&#945; was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer&#8217;s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-11</td>
			<td>Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14&#8211;12 cell line culture supernatant at 5X106&#160;cells in a 10-cm suspension culture dish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>with L-Glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>s1820-500</td>
			<td>Fetal Bovine Serum French Origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>100 mm x 20 mm style dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nun clon Delta surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting kit-8</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>40 &#956;m Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>50 mL CentriStar cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro

Het remodelleren van het bot is een complex proces en het gaat om perioden van afzetting en resorptie. Bot resorptie is een proces waarbij bot door osteoclasten in reactie op verschillende stimuli afgebroken wordt. Osteoclast precursoren differentiëren in multinuclear osteoclasten in reactie op macrophage kolonie stimulerende factor (M-CSF) en receptor activator van nuclear factor-Kappa-B ligand (RANKL). Onder pathologische omstandigheden, het profiel van cytokine is anders en gaat om een mengsel van inflammatoire cytokines. Tumornecrosefactor alfa (TNF-α) is één van de belangrijkste cytokines zoals het vlindertje gebieden betrokken bij inflammatoire osteolyse in grote hoeveelheden. Het doel van dit protocol is bedoeld als een methode waarmee lymfkliertest beenmerg is geïsoleerd voor het genereren van de osteoclasten door inductie met M-CSF en RANKL of TNF-α, die vervolgens zal worden geremd doordat doses anti-c-fms antilichaam, de receptor voor M-CB. Dit experiment wijst de therapeutische waarde van anti-c-fms antilichaam in ziekten van inflammatoire bot resorptie.

Het doel van dit protocol is te evalueren van het effect van anti-c-fms antilichaam op osteoclast vorming in aanwezigheid van RANKL of TNF-α en voor het bepalen van het effect van M-CSF op osteoclast precursoren proliferatie. In dit protocol, die wij hebben verstrekt een betrouwbaar proces watergasproces waarbij grote hoeveelheden pure osteoclast culturen zijn gegenereerd. Wij hebben ook een manier om te testen de geschikte concentratie anti-c-fms antilichaam voor remming van osteoclast ...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro at JoVE.com

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Dit protocol omvat dissectie van lymfkliertest lange botten en beenmerg isolatie, voor het genereren van beenmerg macrofagen en produceren van de osteoclasten met behulp van macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF) en receptor activator van nuclear factor-Kappa-B ligand (RANKL) of Tumornecrosefactor alfa (TNF-α) en hun arrestatie door anti-c-fms antilichaam, M-CSF receptor.

Effect van Anti-c-fms antilichaam op Osteoclast vorming en verspreiding van Osteoclast voorloper In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Dit experiment benadrukt de therapeutische waarde van Anti-c-fms-antilichaam bij ziekten van ontstekingsbotverstoring, zoals reumatoïde artritis en parodontitis. Het proces waarbij beenmerg wordt geëxtraheerd en gebruikt om osteoclast precursoren te genereren, levert grote hoeveelheden pure osteoclasten op, die kunnen worden gebruikt in meerdere downstreamtoepassingen. Dit protocol biedt twee alternatieve methoden van osteoclastogenese, hetzij met behulp van RANKL ligand of TNF alpha.Daarnaast geeft deze methode inzicht in het effect van Anti-c-fms antilichaam op osteoclastogenese. Visuele demonstratie van deze procedure maakt de onderzoeker vertrouwd met het proces van dissectie en het verkrijgen van beenmergcellen in grote hoeveelheden. Om te beginnen vullen een plaat die zal dienen als een collectie container met ongeveer 50 milliliter van alfa MEM, afhankelijk van de grootte van de container, en plaats het op ijs.Gebruik pinnen te doorboren door de handpalmen en voeten van een geëuthanaseerde muis om het te repareren in supine positie, en spray grondig met 70%ethanol. Gebruik steriele chirurgische schaar en pincet om een huid incisie te maken op het niveau van de heup en uit te breiden tot aan de voeten, het blootstellen van de spieren. Zoek en snijd de pees bevestiging van de quadriceps spier.Pel de spier weg en snijd deze op het niveau van de heup. Zoek dan de pees die de hamstringspier aan het bot bevestigt. Schil de spieren bloot het bot, en de hamstring te bevrijden van de bevestiging, zorg ervoor dat niet te snijden in het bot.Plaats de schaar tussen het hoofd van het dijbeen en de gewrichtsruimte. Snijd in het bevrijden van het dijbeen, maar het houden van het bot intact, die het mogelijk maakt detachement van de botten zonder risico van het blootstellen van het beenmerg. Cutaway de spieren aan het scheenbeen op een soortgelijke manier.Snijd vervolgens het scheenbeen vrij van zijn bevestiging aan het enkelgewricht, terwijl het bot intact blijft om besmetting te voorkomen. Gebruik de schaarbladen en labdoekjes om het resterende zachte weefsel van het dijbeen en scheenbeen te schrapen en leg ze in de geprepareerde plaat met alfa-MEM op ijs. De dissectie moet zorgvuldig worden uitgevoerd om verontreiniging te minimaliseren.Dat is de reden waarom grondige weke delen verwijderen en bot lokalisatie zijn van cruciaal belang. Vul een naaldspuit van 30 meter met alfa-MEM. Koppel het scheenbeen en dijbeen los van het kniegewricht en snijd de uiteinden van het lange bot van beide kanten met een schaar.Gebruik een pincet om het bot uit de schacht te houden. Steek de naald in het merg ruimte aan het bot en langzaam spoelen de inhoud van het merg in een zes centimeter cultuur schotel en herhaal voor alle botten. Het bot wordt wit, wat wijst op de extractie van alle beenmerginhoud.Gebruik een 40 micrometer nylon cel zeef om het beenmerg extract stam in een 50 milliliter conische centrifuge buis. Centrifuge de buis op 300 keer G gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg.Om te wassen, voeg vijf milliliter van alfa MEM aan de pellet. Pipette de cellen om ze los te maken, centrifuge, en herhaal de was voor een totaal van twee keer. Na het tellen van deze geïsoleerde cellen, zoals beschreven in het manuscript, zaad 10 miljoen cellen per 10 milliliter, in een 10 centimeter cultuur schotel, en voeg M-CSF aan de cellen.Broed de cultuur op 37 graden Celsius, 5% kooldioxide gedurende drie dagen. Verwijder het medium na drie dagen en was de cellen twee maal krachtig met 10 milliliter PBS om niet-loodhoudende cellen te verwijderen. Voeg vijf milliliter kamertemperatuur 0,02% trypsin-EDTA en PBS, en incubeer bij 37 graden Celsius, 5%kooldioxide gedurende vijf minuten.Grondig pipette de cellen om ze los te maken. Observeer de cultuur onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen zijn losgemaakt en lijken afgerond en zwevend in de media. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, activeer de reactie door vijf milliliter van het alfa-MEM toe te voegen.Verzamel de cellen in een 50 milliliter conische buis en centrifuge op 300 keer G gedurende vijf minuten. Na het weggooien van de supernatant, wassen met vijf milliliter van alfa MEM, en centrifuge weer op 300 keer G gedurende vijf minuten. Stel de pellet opnieuw op in 10 milliliter alfa-MEM.Zaad 1 miljoen cellen per 10 milliliter in een 10 centimeter cultuur schotel, en voeg M-CSF. Broed de cultuur op 37 graden Celsius, 5% kooldioxide gedurende drie dagen. Oogst de bijgevoegde cellen, die BMMs vertegenwoordigen als osteoclast precursoren na drie dagen, zoals eerder gedaan tijdens de generatie van BMMs.Zaad de BMMs op 50.000 cellen per 200 micro liter alfa-MEM in een 96 putplaat per put. Voeg aan elke bron de gewenste stimuli toe. En voeg dan M-CSF toe voor een laatste concentratie van 100 nanogram per milliliter.Voeg anti-c-fms antilichaam aan elke put. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius, 5%kooldioxide gedurende vier dagen, terwijl het veranderen van media om de andere dag voor vier dagen. En ga dan verder met vlekken en testen, zoals beschreven in het manuscript.De osteoclast vorming in M-CSF en RANKL behandelde cultuur, met Anti-c-fms antilichaam, werd geëvalueerd. Met 101,000 nanogram per milliliter Anti-c-fms antilichaam werd een significante daling van het aantal osteoclasten waargenomen in vergelijking met controle. Terwijl, met een op de 10 nanogram per milliliter Anti-c-fms antilichaam, was er geen significante daling.Vervolgens werd de osteoclastvorming in M-CSF en TNF alpha behandelde cultuur, met Anti-c-fms antilichaam, geëvalueerd. Met 10, 100, 1.000 nanogram per milliliter Anti-c-fms antilichaam werd een significante afname van het aantal osteoclasten waargenomen in vergelijking met controle, zonder significante afname bij één nanogram per milliliter. En de M-CSF cultuur met 1, 10, 100 nanogram per milliliter Anti-c-fms antilichaam, was er geen significante daling van het aantal osteoclast precursoren in vergelijking met controle.Echter, bij 1.000 nanogram per milliliter, was er een significante daling van het aantal osteoclast precursoren, wat aangeeft dat een concentratie zo hoog als 1,000 nanogram per milliliter nodig is om de proliferatie van osteoclast precursoren aanzienlijk te remmen. Zorg ervoor dat de banden vrij te maken, terwijl het bot intact, die de kans op besmetting zal minimaliseren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro biofilmvorming in een 8-well Kamer Dia

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Meting van antilichaam Effecten op cellulaire functie van geïsoleerde cardiomyocyten

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Het synergetische effect van zichtbaar licht en gentamycine op<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Micro-organismen

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Onderzoek naar de effecten van probiotica op Pneumococcal Kolonisatie Met behulp van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Hechting Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Methoden voor de kwantitatieve detectie van antilichaam-geïnduceerde complement activatie op de rode bloedcellen

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrofagen Cholesterol Uitputting en het effect daarvan op de Fagocytose van<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Generatie Lymfatische micropartikels en Detectie van hun proapoptotische Effect op epitheelcellen

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Meting van extracellulaire DNA los en Kwantitatieve NET Formation in menselijke neutrofielen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Ontcijferen en Imaging Pathogenese en Cording van<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In zebravis embryo&#39;s

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylactisch effect van interferonen

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...