Name: effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro at JoVE.com

Diese Arbeit wurde teilweise durch eine JSPS KAKENHI unterstützt von der Japan Society for Promotion of Science (Nr. 16K 11776, H. K., Nr. 17K 17306, K. S., Nr. 16K 20637 K. K., Nr. 16K 20636, M. S., Nr. 18K 09862 I. m.) zu gewähren.

Alle tierischen Verfahren und Pflege der Tiere wurden nach Tohoku Universität Regeln und Vorschriften durchgeführt.
(1) murinen Megalosauridae Dissektion und Handling
<ol><li>Füllen Sie vor Dissektion eine Platte mit etwa 50 mL der α-MEM abhängig von der Größe des Behälters und legen Sie ihn auf Eis. Dies wird als ein Auffangbehälter dienen, bis das Sezieren von allen Knochen abgeschlossen ist. Für diese und die folgenden verwenden Experimente, Sie α-MEM mit 10 % fetalen bovine Se...

<ol>
	<li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoimmunology:+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss.">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts.">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li><li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF/RANKL-RANK+interaction.">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis.">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li><li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction.">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li><li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor.">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li><li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation.">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis.">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li><li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo.">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li><li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model.">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice.">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement.">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li><li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes.">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li><li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development.">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes &amp; Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li><li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+(op/op)+mouse.">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li><li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis.">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li><li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints.">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li></ol>

In dieser Studie untersuchten wir die Wirkung des Antikörpers Anti-c-Fms auf Osteoklasten RANKL-induzierte Bildung, Bildung von TNF-α-induzierte Osteoklasten und M-CSF-induzierte Osteoklasten Vorläufer Verbreitung. Wir fanden, dass die wirksame Menge des Antikörpers Anti-c-Fms für die Hemmung des Osteoclastogenesis zwischen Osteoklasten RANKL-induzierte Bildung, TNF-α induzierte Osteoklasten Bildung und M-CSF-induzierte Proliferation von Osteoklasten-Vorläufer unterscheidet.
RANKL vermi...

Osteoklasten sind hoch spezialisierte Zellen, und sie unterscheiden von hämatopoetischen Stammzellen durch die Verschmelzung von mehreren Osteoklasten-Vorläufer. Sie sind unerlässlich für gesunden Knochenaufbau und tragen zur pathologischen Knochenabbau osteolytischen Entzündungskrankheiten wie rheumatoide Arthritis und Parodontitis1zugeordnet.
Osteoclastogenesis und Osteoklasten Funktion sind durch zwei Schlüsselfaktoren vermittelt; Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor Kappa B Ligand (RANKL). M-CSF und RANKL sind wichtig für die Osteoklasten Differenzierung2. Ein weiterer Faktor, das gezeigt worden ist, induzieren Osteoklasten-Formation von in-vitro-Knochenmark Makrophagen ist Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α)3,4,5. TNF-α vermittelten Osteoklasten Bildung kritisch für Osteolyse in destruktiver Knochenerkrankungen wie rheumatoider Arthritis6, Parodontitis7und postmenopausalen Osteoporose8gezeigt wurde.
C-Fms ist die Membran-Rezeptor von M-CSF und vermittelt seine Wirkung. Die Rolle des c-Fms ist in der Literatur gut dokumentiert, wie nachgewiesen wurde, dass die Verwaltung eines Antikörpers gegen c-Fms (Antikörper Anti-c-Fms) komplett verhaftet Osteoclastogenesis in einem Modell Arthritis sowie in TNF-α induzierte Knochen Erosionen während Osteoclastogenesis entfernte aus dem entzündeten Gelenk war noch robuste9. Verwaltung von Anti-c-Fms Antikörper gehemmt Osteoklasten Bildung und Knochen Resorption induziert durch Lipopolysaccharid (LPS) in Maus Calvariae10 ebenso wie LPS-induzierte Parodontitis Modell11. Darüber hinaus gehemmt Antikörper Anti-c-Fms mechanische stressinduzierte Wurzelresorption während der kieferorthopädischen Zahn Bewegung12sowie kieferorthopädische Zahnbewegungen und Knochenabbau kieferorthopädischen Zahn Bewegung13zugeordnet.
M-CSF wurde berichtet, um andere Funktionen haben, die für die Host-Immunantwort unabdingbar sind. Das Fehlen von M-CSF bei Op/Op-Mäusen mit bakterieller Lungenentzündung führen zur Steigerung der bakteriellen Belastung und bakterielle Verbreitung in der Leber mit hepatischen Nekrose14. M-CSF ist daher wichtig für immunologische Reaktion beim Schutz vor Infektionen.
Diese Studie zeigt die Wirkung der Antikörper Anti-c-Fms auf M-CSF und RANKL oder TNF-α induzierte Osteoklasten Bildung in-vitro- und M-CSF induzierte Proliferation von Osteoklasten-Vorläufer. Dieses Protokoll zeigt die Isolation der murinen Knochenmarkzellen von Röhrenknochen, und die Schritte des Knochenmarks Makrophagen (BMM) generiert, die als Osteoklasten-Vorläufer gelten und induzieren die Differenzierung der BMM in Multikern Osteoklasten durch zwei Methoden; RANKL oder TNF-α. Das Protokoll wird auch die Verhaftung von Osteoclastogenesis bei beiden Methoden mit Anti-c-Fms Antikörper verglichen.
Der Prozess mit dem Knochenmark extrahiert und anschließend zur Erzeugung von Osteoklasten-Vorläufer ist zuverlässig in der Herstellung von großen Mengen des reinen Osteoklasten-Kulturen, die in mehrere downstream-Anwendungen wie Drogentests verwendet werden können. Die Verwendung von RANKL oder TNF-α induzieren Osteoclastogenesis in diesem Protokoll unterscheidet Osteoclastogenesis als physiologische Prozess (RANKL) von Osteoclastogenesis als pathologische Prozess (TNF-α), was wiederum zwei alternative Verfahren führen die Entscheidung ist eine überlegene in Bezug auf die Reagenzien in downstream-Anwendungen verwendet werden. Dieses Protokoll bietet auch eine Methode, mit der wir eine geeignete Konzentration des Antikörpers Anti-c-Fms feststellen können, die für das spätere Studium Knochenabbau und osteolytischen Krankheiten beteiligt sicher verwendet werden kann.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-c-Fms antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant murine TNF-&#945; prepared in our laboratory. TNF-&#945; cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-&#945; was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-&#945; was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer&#8217;s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-11</td>
			<td>Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14&#8211;12 cell line culture supernatant at 5X106&#160;cells in a 10-cm suspension culture dish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>with L-Glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>s1820-500</td>
			<td>Fetal Bovine Serum French Origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>100 mm x 20 mm style dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nun clon Delta surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting kit-8</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>40 &#956;m Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>50 mL CentriStar cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro

Knochenaufbau ist ein komplexer Prozess, und es handelt sich um Zeiträume von Ablagerung und Resorption. Knochenabbau ist ein Prozess, durch den Knochen durch Osteoklasten in Reaktion auf verschiedene Reize abgebaut wird. Osteoklasten-Vorläufer differenzieren Multikern Osteoklasten in Reaktion auf Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor Kappa B Ligand (RANKL). Unter pathologischen Bedingungen das Zytokin-Profil ist anders und beinhaltet eine Mischung von inflammatorischen Zytokinen. Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF-α) ist eines der wichtigsten Zytokine wie es in großen Mengen in den Bereichen mit entzündlichen Osteolyse gefunden wird. Der Zweck dieses Protokolls ist, ein Verfahren bereitzustellen, mit denen murinen Knochenmark isoliert ist, um Osteoklasten durch Induktion mit M-CSF und RANKL oder TNF-α, anschließend gehemmt wird, durch steigende Dosen des Antikörpers Anti-c-Fms, den Rezeptor, zu generieren für M-CSF. Dieses Experiment zeigt den therapeutischen Wert des Antikörpers Anti-c-Fms bei Erkrankungen des entzündliche Knochenabbau.

Dieses Protokoll dient zur Bewertung der Wirkung der Anti-c-Fms-Antikörper auf Osteoklasten Bildung in Gegenwart von RANKL oder TNF-α und die Wirkung von M-CSF auf Osteoklasten-Vorläufer-Verbreitung zu bestimmen. In diesem Protokoll haben wir einen zuverlässigen Prozess bereitgestellt, mit dem große Mengen von reinem Osteoklasten Kulturen entstehen. Wir haben auch eine Möglichkeit, Anti-c-Fms Antikörperkonzentration geeignet für Hemmung der Osteoklasten Formation unter verschieden...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro at JoVE.com

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Dieses Protokoll enthält Dissektion der murinen langen Knochen und Knochenmark isoliert, Knochenmark Makrophagen zu generieren und produzieren Osteoklasten mit Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor Kappa B Ligand (RANKL) oder Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF-α) und ihre Verhaftung durch Anti-c-Fms Antikörper, M-CSF Rezeptor.

Wirkung von Anti-c-Fms-Antikörper auf Osteoklasten Bildung und Verbreitung von Osteoklasten-Vorläufer In-vitro-

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Dieses Experiment unterstreicht den therapeutischen Wert von Anti-c-fms Antikörpern bei Erkrankungen entzündlicher Knochenstörungen wie rheumatoider Arthritis und Parodontitis. Das Verfahren, durch das Knochenmark extrahiert und zur Erzeugung von Osteoklastvorläufern verwendet wird, ergibt große Mengen reiner Osteoklasten, die in mehreren nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden können. Dieses Protokoll bietet zwei alternative Methoden der Osteoclastogenese, entweder mit RANKL Ligand oder TNF alpha.Darüber hinaus bietet diese Methode Einblick in die Wirkung von Anti-c-fms-Antikörpern auf die Osteoclastogenese. Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens macht den Forscher mit dem Prozess der Zerlegung und der Gewinnung von Knochenmarkzellen in großen Mengen vertraut. Um eine Platte zu füllen, die als Sammelbehälter mit ca. 50 Milliliter alpha MEM dienen wird, abhängig von der Größe des Behälters, und legen Sie sie auf Eis.Verwenden Sie Stifte, um durch die Handflächen und Füße einer eingeschläferten Maus zu durchdringen, um sie in Supine-Position zu fixieren, und sprühen Sie gründlich mit 70% Ethanol. Verwenden Sie sterile chirurgische Schere und Pinzette, um einen Hautschnitt auf der Ebene der Hüfte zu machen und sie bis zu den Füßen zu erweitern, die Muskeln freizulegen. Suchen und schneiden Sie die Sehne, die den Quadrizepsmuskel befestigt.Den Muskel abziehen und auf hüfthöhe schneiden. Dann lokalisieren Sie die Sehne, die den Hamstring-Muskel am Knochen befestigt. Schälen Sie die Muskeln, die den Knochen freisetzen, und befreien Sie die Sehne von ihrer Befestigung, um sicherzustellen, dass sie nicht in den Knochen geschnitten wird.Positionieren Sie die Schere zwischen dem Kopf des Oberschenkelknochens und dem Gelenkraum. Schneiden Sie in sie befreien den Oberschenkelknochen, aber halten Sie den Knochen intakt, die Ablösung der Knochen ermöglicht, ohne das Risiko der Exposition des Knochenmarks. Schneiden Sie die Muskeln an der Tibia in ähnlicher Weise befestigt.Dann schneiden Sie die Tibia frei von seiner Befestigung am Sprunggelenk, während sie den Knochen intakt hält, um eine Kontamination zu vermeiden. Verwenden Sie die Scherenklingen und Labortücher, um das verbleibende Weichgewebe aus dem Oberschenkelknochen und der Tibia zu kratzen und legen Sie es in die vorbereitete Platte mit Alpha MEM auf Eis gelegt. Die Sezierung sollte sorgfältig durchgeführt werden, um die Kontamination zu minimieren.Deshalb sind eine gründliche Weichteilentfernung und Knochenlokalisierung von entscheidender Bedeutung. Füllen Sie eine 30-Spur-Nadelspritze mit alpha MEM. Trennen Sie die Tibia und Oberschenkel von der Kniegelenk, und schneiden Sie die Enden des langen Knochens von beiden Seiten mit einer Schere.Verwenden Sie eine Pinzette, um den Knochen aus der Welle zu halten. Setzen Sie die Nadel in den Knochendesmarkeinraum ein und spülen Sie den Inhalt des Marks langsam in eine sechs Zentimeter große Kulturschale und wiederholen Sie ihn für alle Knochen. Der Knochen wird weiß, was auf die Extraktion des gesamten Knochenmarkgehalts hinweist.Verwenden Sie ein 40 Mikrometer Nylon-Zellsieb, um den Knochenmarkextrakt in ein 50 Milliliter konisches Zentrifugenrohr zu sanieren. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 300 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand.Zum Waschen fünf Milliliter Alpha MEM in das Pellet geben. Pipette die Zellen, um sie zu lösen, Zentrifuge, und wiederholen Sie die Wäsche für insgesamt zwei Mal. Nach dem Zählen dieser isolierten Zellen, wie im Manuskript beschrieben, säen Sie 10 Millionen Zellen pro 10 Milliliter in einer 10-Zentimeter-Kulturschale aus und fügen M-CSF zu den Zellen hinzu.Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid für drei Tage. Entfernen Sie das Medium nach drei Tagen, und waschen Sie die Zellen zweimal kräftig mit 10 Milliliter PBS, um nicht haftende Zellen zu entfernen. Fügen Sie fünf Milliliter Raumtemperatur 0,02%Trypsin-EDTA und PBS hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid für fünf Minuten.Gründlich Pipette die Zellen, um sie zu lösen. Beobachten Sie die Kultur unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen getrennt wurden und gerundet und in den Medien schwebend erscheinen. Wenn die Zellen abgetrennt wurden, inaktivieren Sie die Reaktion, indem Sie fünf Milliliter des Alpha-MEM hinzufügen.Sammeln Sie die Zellen in einem 50 Milliliter konischen Rohr und Zentrifuge bei 300 mal G für fünf Minuten. Nach dem Wegwerfen des Überstandes mit fünf Milliliteralpha MEM waschen und fünf Minuten lang wieder bei 300 mal G zentrieren. Das Pellet in 10 Milliliter Alpha MEM wieder aufhängen.Samen 1 Million Zellen pro 10 Milliliter in einem 10-Zentimeter-Kulturgericht, und fügen Sie M-CSF. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid für drei Tage. Ernten Sie die angeschlossenen Zellen, die BMMs als Osteoklast-Vorstufen nach drei Tagen darstellen, wie es zuvor bei der Erzeugung von BMMs geschehen ist.Säen Sie die BMMs bei 50.000 Zellen pro 200 Mikroliter alpha MEM in einer 96-Well-Platte pro Brunnen. Zu jedem Brunnen, fügen Sie gewünschte Reize. Und dann M-CSF für eine endige Konzentration von 100 Nanogramm pro Milliliter hinzufügen.Fügen Sie Anti-c-fms Antikörper zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid für vier Tage, während medienwechseln jeden zweiten Tag für vier Tage. Und dann gehen Sie mit Färbung und Assays, wie in der Handschrift beschrieben.Die Osteoklastbildung in m-CSF und RANKL behandelten Kultur, mit Anti-c-fms Antikörper, wurde bewertet. Mit 101.000 Nanogramm pro Milliliter Anti-c-fms-Antikörper wurde im Vergleich zur Kontrolle eine signifikante Abnahme der Anzahl von Osteoklasten beobachtet. Während bei einem von 10 Nanogramm pro Milliliter Anti-c-fms Antikörper, gab es keine signifikante Abnahme.Anschließend wurde die Osteoklastbildung in der Alpha-behandelten M-CSF- und TNF-Alphakultur mit Anti-c-fms-Antikörper bewertet. Mit 10, 100, 1 000 Nanogramm pro Milliliter Anti-c-fms Antikörper wurde eine signifikante Abnahme der Anzahl der Osteoklasten im Vergleich zur Kontrolle beobachtet, ohne signifikante Abnahme bei einem Nanogramm pro Milliliter. Und die M-CSF-Kultur mit 1, 10, 100 Nanogramm pro Milliliter Anti-c-fms Antikörper, gab es keine signifikante Abnahme der Anzahl der Osteoklast-Vorstufen im Vergleich zur Kontrolle.Bei 1 000 Nanogramm pro Milliliter war jedoch eine signifikante Abnahme der Anzahl der Osteoklast-Vorläufer zu verzeichnen, was darauf hindeutet, dass eine Konzentration von bis zu 1.000 Nanogramm pro Milliliter erforderlich ist, um die Proliferation von Osteoklast-Vorstufen signifikant zu hemmen. Achten Sie darauf, die Bindungen zu befreien, während Sie den Knochen intakt halten, was die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination minimiert.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In-vitro-Bildung von Biofilmen in einem 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Die Messung der Antikörper Auswirkungen auf zelluläre Funktion von isolierten Kardiomyozyten

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Die synergistische Wirkung von sichtbarem Licht und Gentamycin auf<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Mikroorganismen

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Methoden für die quantitative Bestimmung von Antikörper-induzierte Komplementaktivierung auf Red Blood Cells

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Generierung von lymphatische Mikropartikel und Nachweis ihrer pro-apoptotische Wirkung auf die Epithelzellen der Atemwege

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Entschlüsselung und Imaging Pathogenese und Cording von<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In Zebrafischembryonen

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die<em&gt; In Vitro</em&gt; Prophylaktische Wirkung von Interferonen

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...