Name: effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro at JoVE.com

עבודה זו נתמך בחלקה על ידי KAKENHI JSPS מענק של האגודה יפן קידום של מדע (מס 16K 11776 ל ה ק, מס 17K 17306 ל ק. ס., מס 16 קיי 20637 ל ק ק, מס 16 קיי 20636 כדי טרום וסת, מס 18 קאראט 09862 ל מ ט.).

כל ההליכים בבעלי חיים, טיפול בבעלי חיים בוצעו על פי אוניברסיטת Tohoku חוקים ותקנות.
1. מאתר Hindlimb ניתוח וטיפול
<ol><li>לפני ניתוח, למלא צלחת עם-50 מ של α-מ בהתאם לגודל המכולה ומניחים אותו על קרח. זה ישמש כגורם מכיל אוסף עד להשלמת ניתוח שכל העצמות. בשביל זה ובעקבות ניסויים, השתמש α-מ המכ?...

<ol>
	<li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoimmunology:+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss.">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts.">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li><li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF/RANKL-RANK+interaction.">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis.">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li><li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction.">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li><li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor.">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li><li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation.">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis.">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li><li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo.">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li><li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model.">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice.">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement.">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li><li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes.">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li><li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development.">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes &amp; Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li><li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+(op/op)+mouse.">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li><li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis.">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li><li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints.">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li></ol>

במחקר זה, חקרנו את ההשפעה של נוגדן anti-c-fms על היווצרות אוסטאוקלסט רנקל-induced, TNF-α-induced אוסטאוקלסט היווצרות והתפשטות קודמן אוסטאוקלסט M-CSF-induced. מצאנו כי כמות נוגדנים anti-c-fms עבור עיכוב של osteoclastogenesis בין היווצרות אוסטאוקלסט רנקל-induced, TNF-α המושרה אוסטאוקלסט היווצרות ו- M-CSF-induced התפשטות אוסטאוקלסט מב?...

Osteoclasts הם תאים מאוד מיוחדים, הם להבדיל מתאי גזע hematopoietic באמצעות היתוך גרעיני של מבשרי אוסטאוקלסט מרובים. הם חיוניים עבור עצם בריאה שיפוץ ולתרום ספיגת עצם פיפטות הקשורים במחלות דלקתיות osteolytic כגון דלקת מפרקים שגרונית, מחלת חניכיים1.
Osteoclastogenesis ואוסטאוקלסט הם מתווכת על-ידי שני גורמים מרכזיים; מקרופאג המושבה מגרה פקטור (M-CSF), מפעיל קולטן של גרעיני גורם kappa-B ליגנד (רנקל). M-CSF והן רנקל חשובים עבור אוסטאוקלסט בידול2. גורם נוסף אשר הוכח לגרום אוסטאוקלסט היווצרות של מח העצם מקרופאגים במבחנה הוא הגידול נקרוזה מקדם אלפא (TNF-α)3,4,5. TNF-α אוסטאוקלסט בתיווך היווצרות הוכח להיות קריטי עבור osteolysis עצם הרסני מחלות כגון דלקת מפרקים שגרונית6, מחלת חניכיים7באוסטיאופורוזיס בגיל המעבר8.
C-fms הקולטן ממברנה של M-CSF, ומתווך הפעולה שלה. התפקיד של c-fms מתועד היטב בספרות כפי הוכח כי הממשל של נוגדן נגד c-fms (נוגדן anti-c-fms) לחלוטין נעצר osteoclastogenesis במודל דלקת מפרקים, כמו גם ב- TNF-α המושרה ארוזיות העצם בזמן osteoclastogenesis מרוחק מן המפרק מודלק היה עדיין חזקים9. ניהול של נוגדן anti-c-fms עכבות היווצרות אוסטאוקלסט ספיגת עצם המושרה על ידי ליפופוליסכריד (LPS) העכבר calvariae10 באותה מידה כמו חניכיים LPS-induced דגם11. יתר על כן, נוגדן anti-c-fms עכבות ספיגת השורש מפגינות מכני במהלך התנועה השן אורתודונטי12, כמו גם תנועת השן אורתודונטי, ספיגת עצם המזוהים עם תנועת השן אורתודונטי13.
M-CSF דווח שיש פונקציות אחרות החיוניות על התגובה החיסונית של המארח. העדר של M-CSF בעכברים op/המבצע עם דלקת ריאות חיידקית להוביל והגדלת הנטל חיידקי והפצה בקטריאלי בכבד עם נמק בכבד14. לכן, M-CSF הוא חשוב עבור תגובה חיסונית בהגנה מפני הידבקות.
מחקר זה מדגים ההשפעה של נוגדן anti-c-fms על M-CSF ו רנקל או TNF-α המושרה אוסטאוקלסט היווצרות במבחנה ו M-CSF המושרה התפשטות אוסטאוקלסט סימנים מקדימים. פרוטוקול זה מדגים את ניתוקה של תאים במח העצם מאתר עצמות ארוכות, ואת השלבים ליצירת מח עצם מקרופאגים (BMM) אשר נחשבים אוסטאוקלסט מבשרי, כדי לעודד את הבידול של BMM לתוך multinuclear osteoclasts על ידי שניים שיטות; רנקל או TNF-α. הפרוטוקול משווה גם מעצרו של osteoclastogenesis של שתי השיטות באמצעות נוגדן anti-c-fms.
התהליך שבאמצעותו הוא במח העצם חילוצם ואופן השימוש בהם לאחר מכן ליצור סימנים מקדימים אוסטאוקלסט הוא אמין לייצר כמויות גדולות של תרבויות אוסטאוקלסט טהור, אשר ניתן להשתמש ביישומים במורד הזרם מרובות כגון בדיקות סמים. השימוש רנקל או TNF-α כדי לגרום osteoclastogenesis של פרוטוקול זה מבדיל osteoclastogenesis כתהליך הפיזיולוגיות (רנקל) מ- osteoclastogenesis כתהליך פיפטות (TNF-α), אשר בתורו מספק שני הליכים חלופיים כדי להנחות ההחלטה אשר אחד עדיפה מבחינת ריאגנטים ביישומים במורד הזרם. פרוטוקול זה מספק גם שיטה שבאמצעותה אנו יכולים לקבוע ריכוז מתאים של נוגדן anti-c-fms שיכול לשמש בבטחה ללימודים מאוחר יותר מעורב ספיגת עצם ומחלות osteolytic.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-c-Fms antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant murine TNF-&#945; prepared in our laboratory. TNF-&#945; cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-&#945; was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-&#945; was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer&#8217;s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-11</td>
			<td>Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14&#8211;12 cell line culture supernatant at 5X106&#160;cells in a 10-cm suspension culture dish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>with L-Glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>s1820-500</td>
			<td>Fetal Bovine Serum French Origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>100 mm x 20 mm style dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nun clon Delta surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting kit-8</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>40 &#956;m Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>50 mL CentriStar cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro

עצם שיפוץ הוא תהליך מורכב, זה כולל תקופות של התצהיר, ספיגת. ספיגת עצם הוא תהליך שבו עצם מתפרק על ידי osteoclasts בתגובה לגירויים שונים. אוסטאוקלסט מבשרי להתמיין osteoclasts multinuclear בתגובה המושבה מקרופאג מגרה פקטור (M-CSF), מפעיל קולטן של גרעיני גורם Kappa-B ליגנד (רנקל). בתנאים פיפטות, לפרופיל ציטוקינים שונים, כולל תערובת של ציטוקינים דלקתיים. הגידול נקרוזה מקדם אלפא (TNF-α) הוא אחד ציטוקינים החשוב ביותר כאשר הוא נמצא בכמויות גדולות באזורים מעורבים עם osteolysis דלקתיות. המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לספק שיטה שבאמצעותה מח עצם מאתר מבודד כדי להפיק osteoclasts דרך אינדוקציה עם M-CSF רנקל או TNF-α אשר להיות מעוכבים לאחר מכן על ידי הגדלת מינון של נוגדן anti-c-fms, הקולטן עבור M-CSF. ניסוי זה מדגיש את הערך הטיפולי של נוגדן anti-c-fms במחלות של ספיגת עצם דלקתיות.

המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך את ההשפעה של נוגדן anti-c-fms על היווצרות אוסטאוקלסט בנוכחות רנקל או TNF-α, וכדי לקבוע את ההשפעה של M-CSF על התפשטות מבשרי אוסטאוקלסט. ב פרוטוקול זה, סיפקנו אמין תהליך שבו נוצרות כמויות גדולות של תרבויות אוסטאוקלסט טהור. גם סיפקנו דרך לבדוק נוגדן anti-...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro at JoVE.com

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

פרוטוקול זה כולל ניתוח של עצמות ארוכות מאתר ובידוד מח עצם, ליצור מקרופאגים מח העצם ולייצר osteoclasts באמצעות המושבה מקרופאג מגרה פקטור (M-CSF), מפעיל קולטן של גרעיני גורם Kappa-B ליגנד (רנקל) או הגידול נקרוזה מקדם אלפא (TNF-α) ועל המעצר על ידי נוגדנים anti-c-fms, קולטן M-CSF.

ההשפעה של נוגדן Anti-c-fms על היווצרות אוסטאוקלסט והתפשטות של קודמן אוסטאוקלסט במבחנה

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

ניסוי זה מדגיש את הערך הטיפולי של נוגדן Anti-c-fms במחלות של הפרעה דלקתית בעצמות, כגון דלקת מפרקים שגרונית ודלקת קרום המוח. התהליך שבו מח עצם מופק המשמש לייצור מבשרי osteoclast, מניב כמויות גדולות של osteoclasts טהור, אשר ניתן להשתמש ביישומים מרובים במורד הזרם. פרוטוקול זה מספק שתי שיטות חלופיות של osteoclastogenesis, או באמצעות ליגנד RANKL או אלפא TNF.בנוסף לכך, שיטה זו מספקת תובנה לגבי ההשפעה של נוגדן נגד c-fms על osteoclastogenesis. הדגמה חזותית של הליך זה מכירה את החוקר עם תהליך הניתוח וקבלת תאי מח עצם בכמויות גדולות. כדי להתחיל למלא צלחת שתשמש מיכל איסוף עם כ 50 מיליליטר של אלפא MEM, בהתאם לגודל של המיכל, ולה מניחים אותו על קרח.השתמש סיכות לנקב דרך כפות הידיים והרגליים של עכבר המתת דם כדי לתקן את זה במצב סופי, לרסס ביסודיות עם 70% אתנול. השתמש מספריים כירורגיים סטריליים פינצטה לעשות חתך בעור ברמה של הירך ולהרחיב אותו אל הרגליים, חשיפת השרירים. לאתר לחתוך את הגיד חיבור שריר הארבע ראשי.לקלף את השריר לחתוך אותו ברמה של הירך. לאחר מכן לאתר את הגיד חיבור שריר הברך לעצם. מקלפים את השרירים החושפים את העצם, ומשחררים את מיתר הברך מההחזקה שלו, ומוודאים לא לחתוך לתוך העצם.מקם את המספריים בין ראש עצם הירך לבין המרחב המשותף. חותכים לתוכו לשחרר את עצם הירך, אבל שמירה על העצם שלם, אשר יאפשר ניתוק העצמות ללא סיכון של חשיפת מח העצם. חותכים את השרירים המחוברים השוקה באופן דומה.ואז לחתוך את השוקה ללא ההחזקה שלה במפרק הקרסול, תוך שמירה על העצם שלם, כדי למנוע זיהום. השתמשו בליבי המספריים ומגבוני המעבדה כדי לגרד את כל הרקמה הרכה שנותרה מעצם הירך ומהטיביה ולהניח אותם בצלחת המוכנה עם אלפא MEM המונח על קרח. הניתוח צריך להתבצע בזהירות כדי למזער את הזיהום.לכן הסרת רקמות רכות יסודית לוקליזציה העצם הם קריטיים. מלא מזרק מחט 30 מד עם אלפא MEM. נתק את השוקה ועצם הירך ממפרק הברך, וגזור את קצות העצם הארוכה משני הצדדים באמצעות מספריים.השתמש פינצטה להחזיק את העצם מהפיר. הכנס את המחט לחלל מח העצם ושטף באיטיות את תוכן מח העצם לתוך צלחת תרבות של שישה סנטימטרים וחזור על עצמות. העצם תהפוך ללבן, מה שמצביע על החילוץ של כל תוכן מח העצם.השתמש מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר כדי לאמץ את תמצית מח העצם לתוך צינור צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי.כדי לשטוף, להוסיף חמישה מיליליטר של אלפא MEM לכדור. פיפטה התאים כדי לנתק אותם, צנטריפוגה, ולחזור על לשטוף במשך סך של פעמיים. לאחר ספירת תאים מבודדים אלה, כמתואר בכתב היד, זרע 10 מיליון תאים לכל 10 מיליליטר, בצלחת תרבות של 10 ס"מ, והוסף M-CSF לתאים.דגירה התרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים. הסר את המדיום לאחר שלושה ימים, ולשטוף את התאים פעמיים במרץ עם 10 מיליליטר של PBS כדי להסיר תאים לא עקביים. מוסיפים חמישה מיליליטר של טמפרטורת החדר 0.02% טריפסין-EDTA ו- PBS, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני במשך חמש דקות.ביסודיות pipette התאים לנתק אותם. שים לב לתרבות תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים נותקו והופיעו מעוגל וצף במדיה. כאשר התאים נותקו, בטל את התגובה על-ידי הוספת חמישה מיליליטר של אלפא MEM.לאסוף את התאים לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר השלכת supernatant, לשטוף עם חמישה מיליליטר של אלפא MEM, ו צנטריפוגה שוב ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. להשעות מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של אלפא MEM.זרעים 1 מיליון תאים לכל 10 מיליליטר בצלחת תרבות 10 ס"מ, ולהוסיף M-CSF. דגירה התרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים. לקצור את התאים המצורפים, המייצגים BMMs כמבשרי osteoclast לאחר שלושה ימים, כפי שנעשה בעבר במהלך הדור של BMMs.זרע את BMMs ב 50, 000 תאים לכל 200 מיקרו ליטרים של אלפא MEM בצלחת 96 גם ל הבאר. לכל באר, מוסיפים את הגירויים הרצויים. ולאחר מכן להוסיף M-CSF לריכוז סופי של 100 ננוגרם למיליליטר.מוסיפים נוגדן נגד c-fms לכל באר. הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני במשך ארבעה ימים, תוך החלפת מדיה כל יומיים במשך ארבעה ימים. ואז להמשיך עם כתמים וראיות, כמתואר בכתב היד.היווצרות osteoclast בתרבות M-CSF ו RANKL מטופלים, עם נוגדן נגד c-fms, הוערך. עם 101, 000 ננוגרם למיליליטר נוגדן נגד c-fms, ירידה משמעותית במספר osteoclasts נצפתה בהשוואה לשליטה. בעוד שעם אחד מכל 10 ננוגרם לנוגדן אנטי-c-fms מיליליטר, לא הייתה ירידה משמעותית.לאחר מכן, הוערך היווצרות האוסטאוקלסט בתרבות M-CSF ו- TNF אלפא, עם נוגדן אנטי-c-fms. עם 10, 100, 1, 000 ננוגרם לנוגדן נגד c-fms מיליליטר, ירידה משמעותית במספר osteoclasts נצפתה בהשוואה לשליטה, ללא ירידה משמעותית בננוגרם אחד למיליליטר. ותרבות M-CSF עם 1, 10, 100 ננוגרם לנוגדן אנטי-c-fms מיליליטר, לא הייתה ירידה משמעותית במספר מבשרי osteoclast בהשוואה לשליטה.עם זאת, ב 1, 000 ננוגרם למיליליטר, חלה ירידה משמעותית במספר מבשרי osteoclast, המציין כי ריכוז גבוה ככל 1, 000 ננוגרם למיליליטר יש צורך לעכב באופן משמעותי התפשטות של מבשרי osteoclast. הקפד לשחרר את הקשרים תוך שמירה על העצם ללא פגע, אשר ימזער את הסיכוי לזיהום.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

מדידה של אפקטי נוגדנים על תפקוד תאי של cardiomyocytes המבודד

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

האפקט סינרגיסטי של אור וgentamycin הגלויים על<em&gt; Aeruginosa Pseudomona</em&gt; מיקרואורגניזמים

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay דבקות

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

דור של Lymphocytic microparticles וזיהוי של Proapoptotic השפיעו על תאי אפיתל Airway

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש<em&gt; במבחנה</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

פענוח ופתוגנזה הדמיה והשתרגות<em&gt; Abscessus Mycobacterium</em&gt; בעוברי דג הזברה

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...