Name: effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro at JoVE.com

इस कार्य को जापान सोसाइटी से विज्ञान (सं. सं.) के संवर्धन हेतु एक जेएसपीएस काकेनही अनुदान द्वारा अंशतः समर्थित किया गया । 16K11776 को एच. के., नहीं, 17K17306 के लिए के. एस., नहीं, 16K11776 के लिए के. के., no. 16K11776 से एम. एस., no. 18K09862 से आई. एम.) ।

सभी पशु प्रक्रियाओं और पशु देखभाल Tohoku विश्वविद्यालय के नियमों और विनियमों के अनुसार प्रदर्शन किया गया ।
1. म्यूरिन हिंदलिंब विच्छेदन और हैंडलिंग
<ol><li>विच्छेदन से पहले, कंटेनर के आकार के आधार प...

<ol>
	<li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoimmunology:+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss.">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts.">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li><li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF/RANKL-RANK+interaction.">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis.">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li><li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction.">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li><li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor.">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li><li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation.">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis.">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li><li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo.">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li><li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model.">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice.">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement.">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li><li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes.">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li><li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development.">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes &amp; Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li><li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+(op/op)+mouse.">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li><li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis.">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li><li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints.">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li></ol>

इस अध्ययन में, हम विरोधी के प्रभाव की जांच-सी-एफएमएस एंटीबॉडी पर RANKL-प्रेरित अस्थिशोषक गठन, TNF-α-प्रेरित अस्थिप्रसू गठन और एम-सीएसएफ प्रेरित अस्थिकलास्ट अग्रदूत प्रसार । हमने पाया कि विरोधी की प्रभावी रा?...

अस्थिकोशिकाएँ अत्यधिक विशेषीकृत कोशिकाएं होती हैं, और वे कई अस्थिशोषक पूर्ववर्ती के संलयन के माध्यम से टेम स्टेम कोशिकाओं से अंतर करते हैं । वे स्वस्थ अस्थि remodeling के लिए आवश्यक है और रोगग्रस्त अस्थि अवशोषण के लिए योगदान ऐसे रुमेटी गठिया और periodontal रोग के रूप में भड़काऊ अस्थिबहुलक रोगों के साथ जुड़े1।
अस्थिकजनन और अस्थिशोषक फलन दो प्रमुख कारकों द्वारा मध्यस्थता किया जाता है; मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और नाभिकीय कारक कापा-ब लिगल (RANKL) के रिसेप्टर उत्प्रेरक । दोनों एम-सीएसएफ और RANKL अस्थिशोषक भेदभाव2के लिए महत्वपूर्ण हैं । एक अन्य कारक जो अस्थि मज्जा मैक्रोफेज से अस्थिशोषक गठन को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है विट्रो में ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (tnf-α)3,4,5है । tnf-α मध्यस्थता अस्थिप्रसू गठन के लिए हानिकारक अस्थि रोगों में अस्थिलयन के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है जैसे रुमेटी गठिया6, periodontal रोग7, और रजोनिवृत्ति उपरांत ऑस्टियोपोरोसिस8.
सी-एफएमएस एम-सीएसएफ की झिल्ली रिसेप्टर है और इसकी कार्रवाई मध्यस्थता करता है । सी-एफएमएस की भूमिका अच्छी तरह से साहित्य में प्रलेखित है के रूप में यह प्रदर्शन किया गया है कि सी के खिलाफ एक एंटीबॉडी के प्रशासन-fms (विरोधी सी-fms एंटीबॉडी) पूरी तरह से एक गठिया मॉडल में osteoclastogenesis के रूप में अच्छी तरह से TNF में गिरफ्तार-α प्रेरित अस्थि कटाव जबकि ऑस्टियोकनोजेनेसिस सूजन संयुक्त से दूर अभी भी मजबूत9था । विरोधी के प्रशासन-सी-एफएमएस एंटीबॉडी हिचकी ऑस्क्लेस्ट गठन और अस्थि अवशोषण के लिए लिपोपॉलीसैकेराइड (LPS) में माउस calvariae10 के रूप में अच्छी तरह के रूप में lps प्रेरित periodontitis मॉडल11. इसके अलावा, विरोधी सी-एफएमएस एंटीबॉडी के लिए यांत्रिक तनाव प्रेरित जड़ अवशोषण के दौरान ऑर्थोडोंटिक दांत आंदोलन12, साथ ही ऑर्थोडोंटिक दांत आंदोलन और हड्डी orthodontic दांत आंदोलन के साथ जुड़े अवशोषण13।
एम-सीएसएफ को अन्य कार्यों के लिए सूचित किया गया है जो मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं. बैक्टीरियल निमोनिया के साथ सेशन/सेशन चूहों में एम-सीएसएफ की अनुपस्थिति यकृत परिगलन14के साथ बैक्टीरिया के बोझ और बैक्टीरिया के प्रसार को बढ़ाने के लिए नेतृत्व । इसलिए, M-csf संक्रमण से सुरक्षा में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है ।
इस अध्ययन के प्रभाव को दर्शाता है एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी पर एम-सीएसएफ और RANKL या TNF-α विट्रो और M-सीएसएफ में विकलांग अस्थिशोषक गठन के साथ ही अस्थिशोषक व्यापारियों के प्रसार प्रेरित । यह प्रोटोकॉल लंबी हड्डियों से म्यूरिन अस्थि मज्जा कोशिकाओं के अलगाव को दर्शाता है, और कदम अस्थि मज्जा मैक्रोफेज (bmm) जो अस्थिशोषक पूर्ववर्ती के रूप में माना जाता है और दो द्वारा मल्टीयूक्लियर ऑस्टेक्स्टस में bmm के भेदभाव को प्रेरित उत्पंन करने के लिए विधियों या तो RANKL या TNF-α । प्रोटोकॉल भी दोनों विरोधी सी-एफएमएस एंटीबॉडी का उपयोग करने के तरीकों में अस्थिसंजनन की गिरफ्तारी की तुलना ।
वह प्रक्रिया जिसके द्वारा अस्थि मज्जा निकाला जाता है और बाद में अस्थिशोषक पूर्ववर्ती उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है, शुद्ध अस्थिप्रसू संस्कृतियों की बड़ी मात्रा का उत्पादन करने में विश्वसनीय होता है, जो कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों जैसे औषध परीक्षण में उपयोग किया जा सकता है । या तो RANKL या TNF-α के उपयोग के इस प्रोटोकॉल में अस्थिकपटनजनन को प्रेरित करने के लिए एक रोगजनक प्रक्रिया (TNF-α), जो बारी में दो वैकल्पिक प्रक्रियाओं प्रदान करता है के रूप में एक फिजियोलॉजिकल प्रक्रिया (RANKL) के रूप में osteoclastogenesis अलग है गाइड वह निर्णय जिसमें से एक अभिकर्मक के संदर्भ में श्रेष्ठ है, अनुप्रवाह अनुप्रयोगों में उपयोग किया जाना । इस प्रोटोकॉल को भी एक तरीका है जिसके द्वारा हम विरोधी के एक उपयुक्त एकाग्रता सी-fms एंटीबॉडी है कि सुरक्षित रूप से बाद में अस्थि अवशोषण और osteolytic रोगों में शामिल अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का निर्धारण कर सकते है प्रदान करता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-c-Fms antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant murine TNF-&#945; prepared in our laboratory. TNF-&#945; cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-&#945; was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-&#945; was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer&#8217;s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-11</td>
			<td>Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14&#8211;12 cell line culture supernatant at 5X106&#160;cells in a 10-cm suspension culture dish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>with L-Glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>s1820-500</td>
			<td>Fetal Bovine Serum French Origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>100 mm x 20 mm style dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nun clon Delta surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting kit-8</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>40 &#956;m Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>50 mL CentriStar cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro

अस्थि remodeling एक जटिल प्रक्रिया है और यह जमाव और अवशोषण की अवधि शामिल है । अस्थि अवशोषण एक प्रक्रिया है जिसके द्वारा अस्थि अस्थिभंग विभिन्न उत्तेकणों के प्रत्युत्तर में हड्डी के नीचे टूट जाती है । अस्थिशोषक पुरोगामी मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और नाभिकीय कारक कापा-बी लिग्ड (RANKL) के रिसेप्टर उत्प्रेरक के जवाब में मल्टीन्यूक्लियर ऑस्क्लेस्ट में अंतर । रोगविज्ञान की स्थिति के तहत, cytokine प्रोफ़ाइल अलग है और भड़काऊ cytokines का एक मिश्रण शामिल है । ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (tnf-α) सबसे महत्वपूर्ण साइटोकिंस में से एक के रूप में यह सूजन osteolysis के साथ शामिल क्षेत्रों में बड़ी मात्रा में पाया जाता है । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक विधि प्रदान करना है जिसके द्वारा म्यूरिन बोन मैरो को एम-सीएसएफ के साथ प्रेरण के माध्यम से अस्थिकलाएँ उत्पन्न करने के लिए अलग किया जाता है और या तो RANKL या TNF-α जो बाद में विरोधी की खुराक बढ़ाने से हिचकते हैं-सी-एफएमएस एंटीबॉडी, रिसेप्टर एम-सीएसएफ के लिए । यह प्रयोग भड़काऊ अस्थि अवशोषण के रोगों में एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी के चिकित्सीय मूल्य पर प्रकाश डालता है ।

इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए है एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी की उपस्थिति में अस्थिशोषक गठन पर RANKL या TNF-α, और के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए अस्थिशोषक पुरोगामी प्?...

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Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

इस प्रोटोकॉल में म्यूरिन लांग हड्डियों और अस्थि मज्जा अलगाव का विच्छेदन, अस्थि मज्जा मैक्रोफेज उत्पन्न करने के लिए और मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और परमाणु कारक के रिसेप्टर उत्प्रेरक का उपयोग करने वाले अस्थिकोशीय उत्पादन कापा-बी लिगेद (RANKL) या ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNF-α) और विरोधी के द्वारा उनकी गिरफ्तारी सी-एफएमएस एंटीबॉडी, एम-सीएसएफ रिसेप्टर ।

गैर-सी-एफएमएस एंटीबॉडी के ओटिओक्लास्ट गठन पर प्रभाव और विट्रो में अस्थिकलास्ट प्रणेता के प्रसार

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

इस प्रयोग में भड़काऊ हड्डी व्यवधान, जैसे रूमेटॉयड गठिया और पीरियोडोन्टाइटिस के रोगों में एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी के चिकित्सीय मूल्य पर प्रकाश डाला गया है । वह प्रक्रिया जिसके द्वारा अस्थि मज्जा निकाला जाता है और ऑस्टियोक्लास्ट अग्रदूत उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है, बड़ी मात्रा में शुद्ध ऑस्टियोप्लास्ट की पैदावार करता है, जिसका उपयोग कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल ऑस्टियोसास्टोटोजेनेसिस के दो वैकल्पिक तरीके प्रदान करता है, या तो रैंकल लिगांड या टीएनएफ अल्फा का उपयोग करके।इसके अलावा, यह विधि ऑस्टियोप्लास्टोजेनेसिस पर एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी के प्रभाव में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। इस प्रक्रिया का दृश्य प्रदर्शन शोधकर्ता को विच्छेदन की प्रक्रिया से परिचित करता है और बड़ी मात्रा में अस्थि मज्जा कोशिकाओं को प्राप्त करता है। एक प्लेट को भरना शुरू करने के लिए जो कंटेनर के आकार के आधार पर अल्फा एमईएम के लगभग 50 मिलीलीटर के साथ संग्रह कंटेनर के रूप में काम करेगा, और इसे बर्फ पर रखें।हथेलियों और एक इच्छामृत्यु माउस के पैरों के माध्यम से छेद करने के लिए पिन का उपयोग करें इसे रीढ़ की स्थिति में ठीक करने के लिए, और ७०% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से स्प्रे । कूल्हे के स्तर पर त्वचा का चीरा लगाने के लिए बाँझ सर्जिकल कैंची और चिमटी का उपयोग करें और मांसपेशियों को उजागर करते हुए इसे पैरों तक बढ़ाएं। क्वाड्रिसेप्स मांसपेशी को संलग्न करने वाले कण्डरा का पता लगाएं और काट लें।मांसपेशियों को छील कर कूल्हे के स्तर पर काट लें। फिर हड्डी के लिए हैमस्ट्रिंग मांसपेशी संलग्न कण्डरा का पता लगाएं। हड्डी को उजागर करने वाली मांसपेशियों को छील दें, और अपने लगाव से हैमस्ट्रिंग को मुक्त करें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि हड्डी में कटौती न हो।फीमर के सिर और संयुक्त अंतरिक्ष के बीच कैंची की स्थिति। इसे फीमर मुक्त करने में कटौती, लेकिन हड्डी बरकरार रखते हुए, जो अस्थि मज्जा को उजागर करने के जोखिम के बिना हड्डियों की टुकड़ी सक्षम हो जाएगा । कटवे एक समान फैशन में टिबिया से जुड़ी मांसपेशियों।फिर प्रदूषण से बचने के लिए हड्डी को बरकरार रखते हुए टखने के जोड़ पर अपने लगाव से टिबिया मुक्त काट लें। फीमर और टिबिया से किसी भी शेष नरम ऊतक को कुरेदने के लिए कैंची ब्लेड और लैब वाइप्स का उपयोग करें और उन्हें बर्फ पर रखे अल्फा एमईएम के साथ तैयार प्लेट में रखें। संदूषण को कम करने के लिए विच्छेदन सावधानी से किया जाना चाहिए।यही कारण है कि पूरी तरह से नरम ऊतक हटाने और हड्डी स्थानीयकरण महत्वपूर्ण हैं। अल्फा एमईएम के साथ 30 गेज सुई सिरिंज भरें। टिबिया और फीमर को घुटने के जोड़ से दूर काट लें, और कैंची का उपयोग करके दोनों तरफ से लंबी हड्डी के सिरों को काट लें।शाफ्ट से हड्डी को पकड़ने के लिए चिमटी का उपयोग करें। हड्डी के लिए मज्जा अंतरिक्ष में सुई डालें और धीरे-धीरे एक छह सेंटीमीटर संस्कृति पकवान में मज्जा की सामग्री फ्लश और सभी हड्डियों के लिए दोहराने। हड्डी सफेद हो जाएगी, जो सभी अस्थि मज्जा सामग्री को निकालने का संकेत देगी।बोन मैरो निकालने को 50 मिलीलीटर शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब में तनाव देने के लिए 40 माइक्रोमीटर नायलॉन सेल छन्नी का उपयोग करें। पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। सुपरनेट को त्याग दें।धोने के लिए, गोली में अल्फा एमईएम के पांच मिलीलीटर जोड़ें। कोशिकाओं को उन्हें अलग करने, अपकेंद्रित्र करने और धोने को कुल दो बार दोहराने के लिए पिपेट करें। इन अलग कोशिकाओं की गिनती के बाद, जैसा कि पांडुलिपि में वर्णित है, 10 सेंटीमीटर कल्चर डिश में प्रति 10 मिलीलीटर 10 मिलियन कोशिकाओं को बीज दें, और कोशिकाओं में एम-सीएसएफ जोड़ें।संस्कृति को ३७ डिग्री सेल्सियस, तीन दिनों के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट । तीन दिनों के बाद माध्यम निकालें, और कोशिकाओं को दो बार सख्ती से पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ धोने के लिए nonadherent कोशिकाओं को दूर करने के लिए । कमरे के तापमान के पांच मिलीलीटर जोड़ें ०.०२% ट्राइप्सिन-EDTA और PBS, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, पांच मिनट के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड ।कोशिकाओं को अलग करने के लिए अच्छी तरह से पिपेट करें। एक माइक्रोस्कोप के तहत संस्कृति का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को अलग किया गया है और गोल और मीडिया में तैर दिखाई देते हैं । जब कोशिकाओं को अलग कर दिया गया है, अल्फा MEM के पांच मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया निष्क्रिय ।कोशिकाओं को पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर 50 मिलीलीटर शंकु नली और अपकेंद्रित्र में ले लीजिए। सुपरनेट को छोड़ने के बाद, अल्फा एमईएम के पांच मिलीलीटर के साथ धोएं, और पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर फिर से अपकेंद्रित्र करें। अल्फा एमईएम के 10 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।बीज 10 सेंटीमीटर संस्कृति पकवान में प्रति 10 मिलीलीटर प्रति मिलियन कोशिकाओं, और एम-CSF जोड़ें । संस्कृति को ३७ डिग्री सेल्सियस, तीन दिनों के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट । संलग्न कोशिकाओं को काटें, जो तीन दिनों के बाद ऑस्टियोप्लास्ट अग्रदूत के रूप में बीएमएम का प्रतिनिधित्व करते हैं, जैसा कि बीएमएम की पीढ़ी के दौरान पहले किया गया था।50, 000 कोशिकाओं प्रति 200 माइक्रो लीटर अल्फा एमईएम पर बीएमएम को 96 अच्छी तरह से प्लेट में बीज करें। प्रत्येक अच्छी तरह से, वांछित उत्तेजनाओं को जोड़ें। और फिर 100 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए एम-सीएसएफ जोड़ें।प्रत्येक कुएं में एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी जोड़ें। चार दिन तक हर दूसरे दिन मीडिया बदलते हुए 37 डिग्री सेल्सियस, चार दिन तक 5 फीसद कार्बन डाई ऑक्साइड, 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली को इनक्यूबेट करें। और फिर धुंधला और परख के साथ आगे बढ़ें, जैसा कि पांडुलिपि में वर्णित है।एम-सीएसएफ और रैंकल में ऑस्टियोक्लास गठन, एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी के साथ, मूल्यांकन किया गया था। 101, 000 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी के साथ, नियंत्रण की तुलना में ऑस्टियोक्लास्ट की संख्या में काफी कमी देखी गई। जबकि, 10 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी में से एक के साथ, कोई महत्वपूर्ण कमी नहीं थी।फिर, एम-सीएसएफ और टीएनएफ अल्फा में ऑस्टियोक्स्ट गठन, एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी के साथ संस्कृति का इलाज किया गया, मूल्यांकन किया गया था। 10, 100, 1, 000 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी के साथ, नियंत्रण की तुलना में ऑस्टियोक्लास्ट की संख्या में काफी कमी देखी गई, जिसमें एक नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर में कोई महत्वपूर्ण कमी नहीं आई। और एम-सीएसएफ संस्कृति 1, 10, 100 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर एंटी-सी-एफएमएस एंटीबॉडी के साथ, नियंत्रण की तुलना में ऑस्टियोक्लास्ट अग्रदूतों की संख्या में कोई महत्वपूर्ण कमी नहीं थी।हालांकि, 1, 000 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर पर, ऑस्टियोप्लास्ट अग्रदूतों की संख्या में काफी कमी आई थी, जो यह दर्शाता है कि ऑस्टियोक्लास्ट प्रीकर्स के प्रसार को काफी बाधित करने के लिए प्रति मिलीलीटर 1, 000 नैनोग्राम के रूप में उच्च के रूप में एकाग्रता की आवश्यकता है। हड्डी को बरकरार रखते हुए बांड मुक्त करना सुनिश्चित करें, जिससे संदूषण की संभावना कम हो जाएगी।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

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इन विट्रो biofilm गठन में एक चैंबर 8 अच्छी तरह से स्लाइड में

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

एंटीबॉडी प्रभाव का मापन पृथक cardiomyocytes की सेलुलर समारोह पर

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

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पर दृश्य प्रकाश और Gentamycin के synergistic प्रभाव<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; सूक्ष्मजीवों

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

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एक का प्रयोग न्यूमोकोकल औपनिवेशीकरण पर प्रोबायोटिक्स के प्रभाव की जांच<em&gt; इन विट्रो</em&gt; पालन परख

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

लाल रक्त कोशिकाओं पर एंटीबॉडी प्रेरित सक्रियण पूरक के मात्रात्मक जांच के लिए तरीके

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

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बृहतभक्षककोशिका कोलेस्ट्रॉल कमी और के phagocytosis पर उसके प्रभाव<em&gt; क्रिप्टोकोकस neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

श्वासनली उपकला कोशिकाओं पर Lymphocytic microparticles और उनके Proapoptotic प्रभाव का पता लगाने के जनरेशन

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

कोशिकी डीएनए रिलीज के उच्च throughput मापन और मानव न्यूट्रोफिल में मात्रात्मक नेट गठन<em&gt; इन विट्रो</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

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इमेजिंग रोगजनन और के मुताबिक गूढ़ रहस्य और<em&gt; माइकोबैक्टीरियम abscessus</em&gt; Zebrafish भ्रूण में

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

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Zika वायरस संक्रामक सेल संस्कृति प्रणाली और<em&gt; इन विट्रो</em&gt; इंटरफेरॉन की रोगनिरोधी प्रभाव

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...