Name: effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00
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이 작품 일부 JSP KAKENHI에 의해 지원 되었다 (No. 16 케이 11776 H. K., No. 17 K 17306 K. S., No. 16 K 20637 K. K., No. 16 K 20636 M. S., No. 18 K 나 m 09862 하 하 하 하.) 과학의 승진에 대 한 일본 사회에서 부여.

모든 동물 절차 및 동물 보호는 도호쿠 대학 규칙 및 규정에 따라 수행 했다.
1. murine Hindlimb 해 부 및 처리
<ol><li>절 개, 앞 접시는 컨테이너의 크기에 따라 α-MEM의 약 50 mL와 함께 얼음에 배치. 모든 뼈의 해 부 완료 될 때까지이 컬렉션의 컨테이너 될 것입니다. 이 고 후속 실험, α-MEM 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 IU/mL 페니실린 G, 및 100 μ g/mL 스 사용 합니다.</li>
	<li>5 %iso...

<ol>
	<li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoimmunology:+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss.">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts.">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li><li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF/RANKL-RANK+interaction.">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis.">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li><li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction.">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li><li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor.">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li><li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation.">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis.">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li><li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo.">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li><li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model.">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice.">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement.">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li><li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes.">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li><li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development.">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes &amp; Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li><li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+(op/op)+mouse.">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li><li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis.">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li><li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints.">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li></ol>

이 연구에서 우리는 RANKL 유도 osteoclast 형성, TNF-α 유도 osteoclast 형성과 M CSF 유도 osteoclast 전조 확산에 안티-c-fms 항 체의 효과 조사. 우리는 안티-c-fms RANKL 유도 osteoclast 형성, TNF-α 유도 osteoclast 형성과 osteoclast 선구자의 M CSF 유도 확산 중 osteoclastogenesis의 억제에 대 한 항 체의 효과적인 금액은 다른 것을 발견.
RANKL 중재 osteoclastogenesis M-CSF 생체 외에서, 존재 하 고 순위 null 마우?...

Osteoclasts는 고도로 전문화 된 세포, 그리고 그들은 여러 osteoclast 선구자의 융합을 통해 조 혈 줄기 세포에서 분화. 그들은 건강 한 뼈에 필수적인 고 류 마티스 관절염, 치 주 질환1등 염증 성 osteolytic 질병와 관련 된 pathologic 뼈 재흡수에 기여.
Osteoclastogenesis 및 osteoclast 함수는 두 가지 주요 요인;에 의해 중재 (M-CSF) 비율과 핵 요인 kappa B ligand (RANKL)의 수용 체 활성을 자극 하는 대 식 세포 식민지. M-CSF와 RANKL osteoclast 차별화2중요 하다. 골 수 세포를 체 외에서 osteoclast 형성을 유도 하기 위해 표시 되었습니다 다른 요인은 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α)3,,45이다. TNF-α 중재 osteoclast 형성 osteolysis6류 마치 스 성 관절염, 치 주 질환7, 폐 경 후 골다공증8등 파괴적인 뼈 질환에 대 한 중요 한 표시 되었습니다.
C-fms M-CSF의 막 수용 체 이며, 그것의 활동을 중재 한다. C-fms의 역할은 잘 문서화는 문학에는 c-fms (안티-c-fms 항 체)에 대 한 항 체의 완전히 체포 관절염 모델에서 osteoclastogenesis로 TNF-α에 유도 하면서 뼈 아픕니다 시연 되었다 osteoclastogenesis 먼 염증이 관절에서 여전히 강력한9했다. 안티-c-fms 항 체의 저해 osteoclast 형성과 뼈 재흡수 lipopolysaccharide (LPS) 마우스 calvariae10 도에서 LPS 유발 염 모델11. 에 의해 유도 된 또한, 안티-c-fms 항 체 억제 교정 치아 운동으로 교정 치아 운동12, 동안 기계적 스트레스 유발 루트 재흡수와 교정 치아 운동13와 관련 된 뼈 재흡수.
M-CSF 호스트 면역 반응에 필수적인 다른 기능을 보고 되었습니다. 세균성 폐 렴으로 op/op 생쥐에서 M-CSF의 부재는 세균성 짐과 간장 괴 사14간 세균성 보급의 증가 이어질. 따라서, M-CSF 감염 으로부터 보호에서 면역 반응에 대 한 중요 하다.
이 연구에서는 M-CSF와 RANKL 또는 TNF-α에 안티-c-fms 항 체의 효과 유도 osteoclast 형성 체 외 osteoclast 선구자의 확산을 유도 하는 M-CSF 보여 줍니다. 이 프로토콜이 보여줍니다 murine 골 수 세포의 긴 뼈, 골 수 세포 (BMM) osteoclast 선구자로 간주 되는 생성 하 고 두 多 osteoclasts에 BMM의 차별화를 유도 단계에서 방법; RANKL 또는 TNF-α입니다. 프로토콜은 또한 안티-c-fms 항 체를 사용 하 여 두 방법에 osteoclastogenesis의 검거를 비교 합니다.
프로세스는 골은 추출 이후 osteoclast 선구자를 생성 하는 데 사용 약물 테스트 등 여러 다운스트림 응용 프로그램에 사용 될 수 있는 순수한 osteoclast 문화의 대량 생산에 안정적입니다. RANKL 또는 TNF-α 유도이 프로토콜에서 osteoclastogenesis의 사용 구분 osteoclastogenesis physiologic 프로세스 (RANKL)로 osteoclastogenesis에서 프로세스로 pathologic (TNF-α), 차례 차례로 두 대체 절차 안내를 제공 하 어떤 결정 하나 다운스트림 응용 프로그램에 사용 될 시 약의 관점에서 우수한입니다. 이 프로토콜은 또한 우리가 뼈 재흡수 및 osteolytic 질병에 관련 된 최신 연구에 대 한 안전 하 게 사용할 수 있는 안티-c-fms 항 체의 적당 한 농도 확인할 수 있는 메서드를 제공 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-c-Fms antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant murine TNF-&#945; prepared in our laboratory. TNF-&#945; cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-&#945; was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-&#945; was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer&#8217;s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-11</td>
			<td>Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14&#8211;12 cell line culture supernatant at 5X106&#160;cells in a 10-cm suspension culture dish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>with L-Glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>s1820-500</td>
			<td>Fetal Bovine Serum French Origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>100 mm x 20 mm style dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nun clon Delta surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting kit-8</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>40 &#956;m Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>50 mL CentriStar cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro

뼈는 복잡 한 프로세스 이며 그것은 증 착과 재흡수의 기간을 포함 한다. 뼈 재흡수는 뼈는에 의해 분해 osteoclasts 다른 자극에 응답에서 하는 프로세스입니다. Osteoclast 선구자 多 osteoclasts 대 식 세포 콜로 니 계수 (M-CSF) 및 핵 요인 Kappa B ligand (RANKL)의 수용 체 활성 자극에 대 한 응답으로 구분 합니다. Pathologic 조건 cytokine 프로필은 다른 염증 성 cytokines의 혼합물을 포함 한다. 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α) 염증 osteolysis와 관련 된 분야에서 다량에서 발견 되는 가장 중요 한 cytokines의 하나입니다. 이 프로토콜의 목적은는 murine 골 생성 M-CSF RANKL 및 안티-c-fms 항 체, 수용 체의 복용량을 증가 하 여 이후 저해 될 것입니다 TNF-α와 유도 통해 osteoclasts 하 격리 된 방법을 제공 하 M-CSF에 대 한. 이 실험 염증 뼈 재흡수의 질병 항 체 안티-c-fms의 치료 가치를 강조 한다.

이 프로토콜의 목적은 RANKL 또는 TNF-α, 존재 osteoclast 형성에 안티-c-fms 항 체의 효과 평가 하 고 osteoclast 선구자 확산에 M-CSF의 효과 결정 하. 이 프로토콜에서 우리는 순수 osteoclast 문화의 대량 생성 됩니다 신뢰할 수 있는 프로세스 제공. 우리는 또한 다른 문화 조건 osteoclast 형성 억제에 대 한 안티-c-fms 항 체 적당 한 농도 테스트 하는 방법 제공.
<p class="jove_content" fo:keep-t...

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Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

이 프로토콜 포함 murine 긴 뼈와 골 절연, 골 수 세포를 생성 하 고 osteoclasts 대 식 세포 콜로 니 계수 (M-CSF) 및 핵 요인 Kappa B ligand (RANKL)의 수용 체 활성을 자극을 사용 하 여 생산의 해 부 또는 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α) 그리고 안티-c-fms 항 체, M-CSF 수용 체에 의해 그들의 체포.

Osteoclast 형성과 생체 외에서 Osteoclast 선구자의 확산에 안티-c-fms 항 체의 효과

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

이 실험은 류마티스 관절염 및 치주염과 같은 염증성 뼈 붕괴 의 질병에 있는 항 c-fms 항체의 치료 가치를 강조합니다. 골수가 추출되어 골세포 전구체를 생성하는 데 사용되는 프로세스는 여러 다운스트림 응용 프로그램에서 사용할 수 있는 다량의 순수 한 골세포를 생성합니다. 이 프로토콜은 RANKL 리간드 또는 TNF 알파를 사용하여 두 가지 대체 골형성 을 제공합니다.그 외에도, 이 방법은 항 c-fms 항체가 골세포 발생에 미치는 영향에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 절차의 시각적 데모는 해부 및 다량의 골수 세포를 얻는 과정에 연구원을 친숙시게합니다. 용기의 크기에 따라 약 50 밀리리터의 알파 MEM이 있는 수집 용기역할을 하는 접시를 채우기 시작하고 얼음 위에 놓습니다.핀을 사용하여 안락사 된 마우스의 손바닥과 발을 관통하여 supine 위치에 고정하고 70 %의 에탄올로 철저히 스프레이하십시오. 멸균 수술 가위와 핀셋을 사용하여 엉덩이 수준에서 피부 절개를하고 발까지 확장하여 근육을 노출시십시오. 사두근 근육을 부착하는 힘줄을 찾아 잘라냅니다.근육을 껍질을 벗기고 엉덩이 수준에서 자른다. 그런 다음 뼈에 햄스트링 근육을 부착하는 힘줄을 찾습니다. 뼈를 드러내는 근육을 벗겨내고, 햄스트링을 부착에서 풀어 뼈로 자르지 않도록 하십시오.대퇴골의 머리와 공동 공간 사이에 가위를 배치합니다. 대퇴골을 풀어주지만 뼈를 그대로 유지하면 골수를 노출시킬 위험 없이 뼈를 분리할 수 있습니다. 비슷한 방식으로 경골에 부착 된 근육을 잘라.그런 다음 오염을 피하기 위해 뼈를 그대로 유지하면서 발목 관절의 부착에서 경골을 잘라냅니다. 가위 블레이드와 실험실 물티슈를 사용하여 대퇴골과 경골에서 남은 연조직을 긁어 내고 얼음 위에 알파 MEM을 놓아 준비된 접시에 놓습니다. 해부는 오염을 최소화하기 위해 신중하게 수행해야합니다.그래서 철저한 연조직 제거와 뼈 국소화가 중요합니다. 알파 MEM으로 30 게이지 바늘 주사기를 채웁니다. 경골과 대퇴골을 무릎 관절에서 분리하고 가위를 사용하여 양쪽에서 긴 뼈의 끝을 잘라냅니다.핀셋을 사용하여 샤프트에서 뼈를 잡습니다. 골수 공간에 바늘을 삽입하여 골수의 함량을 6센티미터 배양 접시에 천천히 씻어 내고 모든 뼈를 반복합니다. 뼈는 모든 골수 함량의 추출을 나타내는 흰색으로 바뀝니다.40 마이크로미터 나일론 세포 스트레이너를 사용하여 골수 추출물을 50밀리리터 원추형 원심분리기 튜브로 변형시려면. 튜브를 300배 G로 5분간 원심분리합니다. 상부체를 폐기합니다.세척하려면 펠릿에 알파 MEM 5 밀리리터를 추가합니다. 세포를 분리하고 원심분리기를 분리하고 총 2회 세척을 반복합니다. 원고에 설명된 바와 같이 이러한 고립된 세포를 계산한 후, 10센티미터 배양 접시에 10 밀리리터 당 1,000만 개의 세포를 시드하고 세포에 M-CSF를 추가한다.3일 동안 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 3 일 후에 매체를 제거하고, 비 부착 세포를 제거하기 위해 PBS의 10 밀리리터로 두 번 격렬하게 세포를 씻는다. 실온 0.02%의 트립신-EDTA 및 PBS5밀리리터를 추가하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 5분간 배양합니다.세포를 분리하기 위해 셀을 철저히 피펫합니다. 현미경으로 배양을 관찰하여 세포가 분리되어 둥근 상태로 표시되고 미디어에 떠 있는 것처럼 보이게 하십시오. 세포가 분리되면 알파 MEM의 5 밀리리터를 추가하여 반응을 비활성화합니다.50 밀리리터 원모 관과 원심분리기는 5분 동안 300배 G로 세포를 수집합니다. 상체를 폐기한 후 알파 MEM 5밀리리터로 세척하고 원심분리기를 300회 G로 5분간 다시 세척합니다. 알파 MEM의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.10센티미터 배양 접시에 10 밀리리터 당 1백만 개의 세포를 시드하고 M-CSF를 추가합니다. 3일 동안 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. BmM의 생성 도중 이전에 했던 것처럼 3 일 후에 골세포 전구체로 BMM을 나타내는 부착된 세포를 수확하십시오.잘 당 96 웰 플레이트에서 알파 MEM의 200 마이크로 리터 당 50, 000 세포에서 BmM을 시드. 각 웰에 원하는 자극을 추가합니다. 그런 다음 밀리리터당 100 나노그램의 최종 농도를 위해 M-CSF를 추가합니다.각 웰에 안티-c-fms 항체를 추가합니다. 4일 동안 매일 미디어를 변경하면서 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 원고에 설명된 대로 염색 및 에세이를 진행합니다.항-c-fms 항체를 가진 M-CSF 및 RANKL 처리 배양에서 의 골세포 형성을 평가하였다. 101, 밀리리터 안티-c-fms 항체당 000 나노그램으로, 대조군과 비교하여 골세포 수의 현저한 감소가 관찰되었다. 반면, 밀리리터 안티-c-fms 항체당 10 나노그램 중 1개씩은 현저한 감소는 없었다.이어서, 항-c-fm항체를 통해 M-CSF 및 TNF 알파 처리 배양에서 의골세포 형성을 평가하였다. 밀리리터 안티-c-fms 항체당 10, 100, 1, 000 나노그램으로, 밀리리터당 1나노그램에서 현저한 감소와 함께 대조군과 비교하여 골세포 수가 현저한 감소가 관찰되었다. 그리고 밀리리터 안티-c-fms 항체당 1, 10, 100 나노그램을 가진 M-CSF 배양, 대조군에 비해 골세포 전구체의 수는 현저한 감소는 없었다.그러나, 밀리리터당 1, 000 나노그램에서, 골세포 전구체의 수가 현저히 감소하여 밀리리터당 1, 000 나노그램의 농도가 골세포 전구체의 증식을 현저히 억제하는 데 필요하다는 것을 나타낸다. 뼈를 그대로 유지하면서 결합을 해제하여 오염 가능성을 최소화하십시오.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

8 잘 회의소 슬라이드에서 체외의 Biofilm 형성에

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

연구

면역학 및 감염병학

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

절연 Cardiomyocytes의 세포 기능에 대한 항체 효과 측정

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

에 보이는 빛과 젠타 마이신의 상승 효과<em&gt; Pseudomona 녹농균</em&gt; 미생물

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

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를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사<em&gt; 체외</em&gt; 준수의 분석

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Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

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Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

대 식세포 콜레스테롤 고갈과의 식균 작용에 미치는 영향<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

기도 상피 세포에 림프 미세 입자 및 아폽토시스 효과의 검출 세대

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성<em&gt; 체외</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

영상 병인과의 Cording를 해독하고<em&gt; 미코 농양</em&gt; Zebrafish의 배아에서

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과<em&gt; 체외</em인터페론의&gt; 예방 효과

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...