Name: effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro at JoVE.com

Dette arbeidet var støttes delvis av en JSPS KAKENHI grant fra Japan Society for fremme av vitenskap (nr. 16K 11776 H. K., nr. 17K 17306 til K. S., nr 16K 20637 til K. K., nr 16K 20636 til M. S., nr 18K 09862 I. m.).

Alle dyr prosedyrer og dyr omsorg ble utført Tohoku University reglene og forskriftene.
1. murine Hindlimb disseksjon og håndtering
<ol><li>Før disseksjon, fylle en plate med ca 50 mL av α-MEM avhengig av beholderen og legg den på is. Dette vil tjene som en samling beholder til Disseksjon av alle bein er fullført. For dette og etterfølgende bruker eksperimenter, α-MEM inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS), 100 IU/mL penicillin G og 100 μg/mL streptomycin.</li>
	<li>Euthanize C5...

<ol>
	<li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoimmunology:+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss.">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts.">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li><li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF/RANKL-RANK+interaction.">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis.">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li><li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction.">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li><li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor.">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li><li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation.">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis.">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li><li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo.">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li><li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model.">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice.">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement.">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li><li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes.">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li><li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development.">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes &amp; Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li><li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+(op/op)+mouse.">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li><li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis.">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li><li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints.">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li></ol>

I denne studien undersøkte vi effekten av anti-c-fms antistoff på RANKL-indusert osteoclast formasjon, TNF-α-indusert osteoclast formasjon og M-CSF-indusert osteoclast forløper spredning. Vi fant at effektive anti-c-fms antistoff for hemming av osteoclastogenesis blant RANKL-indusert osteoclast formasjon, TNF-α indusert osteoclast formasjon og M-CSF-indusert spredning osteoclast prekursorer er forskjellige.
RANKL formidler osteoclastogenesis i nærvær av M-CSF i vitro, og RANK null mus e...

Osteoklast er svært spesialiserte celler, og de skiller fra blodkreft stamceller gjennom fusjon av flere osteoclast prekursorer. De er avgjørende for sunn ubalanse og bidra til patologisk benresorpsjon forbundet med inflammatorisk osteolytic sykdommer som revmatoid artritt og periodontal sykdom1.
Osteoclastogenesis og osteoclast er formidlet av to viktige faktorer; macrophage koloni stimulerende faktor (M-CSF) og reseptor aktivator av kjernefysiske faktor kappa-B ligand (RANKL). Både M-CSF og RANKL er viktig for osteoclast differensiering2. En annen faktor som har blitt vist å skape osteoclast fra benmargen makrofager i vitro er tumor nekrose faktor alfa (TNF-α)3,4,5. TNF-α mediert osteoclast formasjon har vist seg å være avgjørende for osteolysis i destruktive bein sykdommer som revmatoid artritt6, periodontal sykdom7og postmenopausal osteoporose8.
C-fms er membran reseptor for M-CSF og formidler handlingen. Rollen av c-fms er godt dokumentert i litteraturen som det ble vist at administrasjon av et antistoff mot c-fms (anti-c-fms antistoff) helt arrestert osteoclastogenesis i en leddgikt modell samt i TNF-α indusert bein erosjoner mens osteoclastogenesis fjerne fra betent felles var likevel robust9. Administrasjon av anti-c-fms antistoff hemmet osteoclast formasjon og bein benresorpsjon indusert av lipopolysakkarid (LPS) i musen calvariae10 så vel som LPS-indusert periodontitt modellen11. Videre hemmet anti-c-fms antistoff mekanisk stress-indusert rot benresorpsjon ortodontiske tann bevegelse12, samt ortodontiske tann bevegelse og benresorpsjon forbundet med ortodontiske tann bevegelse13.
M-CSF er rapportert å ha andre funksjoner som er avgjørende for verten immunrespons. Fravær av M-CSF i op/op mus med bakteriell lungebetennelse føre til økning av bakteriell byrden og bakteriell spredning til leveren med nedsatt nekrose14. M-CSF er derfor viktig for immunologiske respons i beskyttelse mot infeksjon.
Denne studien viser effekten av anti-c-fms antistoff på M-CSF og RANKL eller TNF-α indusert osteoclast formasjon i vitro og M-CSF indusert spredning av osteoclast prekursorer. Denne protokollen demonstrerer isolasjon murine beinmargen celleområde fra lange ben, og fremgangsmåten til å generere benmarg makrofager (BMM) som er ansett som osteoclast prekursorer og å indusere differensiering av BMM i multinuclear osteoklast to metoder; enten RANKL eller TNF-α. Protokollen sammenligner også arrestasjonen av osteoclastogenesis i begge metoder å bruke anti-c-fms antistoff.
Prosessen som benmarg trekkes ut og senere brukes til å generere osteoclast prekursorer er pålitelig i å produsere store mengder rent osteoclast kulturer som kan brukes i flere nedstrøms applikasjoner som narkotikatesting. Bruk av enten RANKL eller TNF-α å indusere osteoclastogenesis i denne protokollen skiller osteoclastogenesis som en fysiologiske prosess (RANKL) fra osteoclastogenesis som en patologisk prosess (TNF-α), som igjen gir to alternative prosedyrer å veilede avgjørelsen som er overlegen i form av reagensene i nedstrøms programmer. Denne protokollen gir også en metode som vi kan fastslå en egnet konsentrasjon av anti-c-fms antistoff som kan brukes for senere studier benresorpsjon og osteolytic sykdommer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-c-Fms antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant murine TNF-&#945; prepared in our laboratory. TNF-&#945; cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-&#945; was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-&#945; was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer&#8217;s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-11</td>
			<td>Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14&#8211;12 cell line culture supernatant at 5X106&#160;cells in a 10-cm suspension culture dish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>with L-Glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>s1820-500</td>
			<td>Fetal Bovine Serum French Origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>100 mm x 20 mm style dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nun clon Delta surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting kit-8</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>40 &#956;m Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>50 mL CentriStar cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro

Ubalanse er en komplisert prosess, og det innebærer avsettelse og benresorpsjon. Benresorpsjon er en prosess som bein er brutt ned av osteoklast svar på ulike stimuli. Osteoclast forløpere skille ut multinuclear osteoklast svar på macrophage koloni stimulerende faktor (M-CSF) og reseptor aktivator av kjernefysiske faktor Kappa-B ligand (RANKL). Patologisk tilfeller cytokin profilen er forskjellige og innebærer en blanding av inflammatoriske cytokiner. Alpha tumor nekrose faktor (TNF-α) er en av de viktigste cytokiner som det finnes i store mengder i områder med inflammatorisk osteolysis. Formålet med denne protokollen er en metode som murine benmargen er isolert for å generere osteoklast gjennom induksjon med M-CSF og RANKL eller TNF-α som vil bli deretter hemmet av økende doser av anti-c-fms antistoff, reseptoren for M-CSF. Dette eksperimentet høydepunkter terapeutisk verdi av anti-c-fms antistoff sykdommer i inflammatorisk benresorpsjon.

Formålet med denne protokollen er å vurdere effekten av anti-c-fms antistoff på osteoclast formasjon i nærvær av RANKL eller TNF-α og å bestemme effekten av M-CSF på osteoclast forløpere spredning. I denne protokollen, har vi gitt en pålitelig prosess som store mengder rent osteoclast kulturer er generert. Vi har også gitt en måte å teste anti-c-fms antistoff egnet konsentrasjon for hemme osteoclast formasjon under annen kultur forhold.
<p class="jove_content" fo:keep-tog...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro at JoVE.com

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Denne protokollen inkluderer Disseksjon av murine lange ben og benmarg isolasjon, å generere benmarg makrofager og produsere osteoklast med macrophage koloni stimulerende faktor (M-CSF) og reseptor aktivator av kjernefysiske faktor Kappa-B ligand (RANKL) eller alpha tumor nekrose faktor (TNF-α) og deres arrestasjon av anti-c-fms antistoff, M-CSF reseptor.

Effekten av Anti-c-fms antistoff på Osteoclast formasjon og spredning av Osteoclast forløper In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Dette eksperimentet fremhever den terapeutiske verdien av Anti-c-fms antistoff i sykdommer av inflammatorisk benforstyrrelse, som revmatoid artritt og periodontitt. Prosessen der benmarg ekstraheres og brukes til å generere osteoklalast forløpere, gir store mengder rene osteoklaster, som kan brukes i flere nedstrøms applikasjoner. Denne protokollen gir to alternative metoder for osteoklastogenesis, enten ved hjelp av RANKL ligand eller TNF alfa.I tillegg til det gir denne metoden innsikt i effekten av Anti-c-fms antistoff på osteoklastogenesis. Visuell demonstrasjon av denne prosedyren gjør forskeren kjent med prosessen med disseksjon og oppnå benmargsceller i store mengder. For å begynne å fylle en tallerken som vil tjene som en oppsamlingsbeholder med ca 50 milliliter alfa MEM, avhengig av størrelsen på beholderen, og legg den på is.Bruk pinner til å pierce gjennom håndflatene og føttene til en eutanisert mus for å fikse den i liggende stilling, og spray grundig med 70% etanol. Bruk steril kirurgisk saks og pinsett for å lage et hud snitt på hoftenivået og utvide den ned til føttene, utsette musklene. Finn og kutt senen som fester quadriceps muskelen.Skrell bort muskelen og kutt den på hoftenivået. Deretter finner senen feste hamstring muskelen til beinet. Skrell bort musklene utsette beinet, og frigjøre hamstring fra sitt vedlegg, sørg for ikke å kutte inn i beinet.Plasser saksen mellom lårbenets hode og fellesrommet. Skjær inn i det frigjør lårbenet, men hold beinet intakt, noe som vil muliggjøre løsrivelse av beinene uten risiko for å utsette benmargen. Klipp av musklene festet til tibia på en lignende måte.Klipp deretter tibia fri fra tilbehøret ved ankelleddet, samtidig som benet holdes intakt for å unngå forurensning. Bruk saksebladene og laboratorieserviettene til å skrape gjenværende bløtvev fra lårbenet og tibiaen og legg dem i den tilberedte platen med alfa MEM plassert på is. Disseksjonen bør utføres nøye for å minimere forurensning.Det er derfor grundig bløtvev fjerning og bein lokalisering er avgjørende. Fyll en 30 gauge nål sprøyte med alfa MEM. Koble tibia og lårbenet bort fra kneleddet, og kutt endene av det lange beinet fra begge sider ved hjelp av saks.Bruk pinsett for å holde beinet fra akselen. Sett nålen inn i margrommet til beinet og skyll sakte innholdet av margen i en seks centimeter kulturrett og gjenta for alle bein. Beinet blir hvitt, noe som indikerer ekstraksjon av alt benmargsinnhold.Bruk en 40 mikrometer nylon celle sil for å spenne benmarg ekstrakt i en 50 milliliter konisk sentrifuge rør. Sentrifuger røret ved 300 ganger G i fem minutter. Kast det overnaturlige.For å vaske, tilsett fem milliliter alfa MEM til pellet. Pipette cellene for å løsne dem, sentrifuge, og gjenta vasken for totalt to ganger. Etter å ha talt disse isolerte cellene, som beskrevet i manuskriptet, frø 10 millioner celler per 10 milliliter, i en 10 centimeter kulturrett, og legge M-CSF til cellene.Inkuber kulturen ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid i tre dager. Fjern mediet etter tre dager, og vask cellene to ganger kraftig med 10 milliliter PBS for å fjerne ikke-levende celler. Tilsett fem milliliter romtemperatur 0,02% trypsin-EDTA og PBS, og inkuber ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid i fem minutter.Rør cellene grundig for å løsne dem. Vær oppmerksom på kulturen under et mikroskop for å sikre at cellene er løsrevet og vises avrundet og flytende i media. Når cellene er løsrevet, inaktiver reaksjonen ved å legge til fem milliliter alfa MEM.Samle cellene i en 50 milliliter konisk rør og sentrifuge på 300 ganger G i fem minutter. Etter å ha kastet det overnaturlige, vask med fem milliliter alfa MEM, og sentrifuge igjen ved 300 ganger G i fem minutter. Re-suspendere pellet i 10 milliliter alfa MEM.Seed 1 million celler per 10 milliliter i en 10 centimeter kulturrett, og legg til M-CSF. Inkuber kulturen ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid i tre dager. Høst de vedlagte cellene, som representerer BMMs som osteoklast forløpere etter tre dager, som gjort tidligere under generering av BMMs.Seed BMMs på 50,000 celler per 200 mikro liter alfa MEM i en 96 brønnplate per brønn. Til hver brønn, legg til ønsket stimuli. Og legg deretter M-CSF for en endelig konsentrasjon på 100 nanogram per milliliter.Legg Anti-c-fms antistoff til hver brønn. Inkuber platen ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid i fire dager, mens du bytter media annenhver dag i fire dager. Og fortsett med farging og analyser, som beskrevet i manuskriptet.Osteoklatringen i M-CSF og RANKL behandlet kultur, med Anti-c-fms antistoff, ble evaluert. Med 101 ble 000 nanogram per milliliter Anti-c-fms antistoff observert en signifikant reduksjon i antall osteoklaster sammenlignet med kontroll. Mens, med en av 10 nanogram per milliliter Anti-c-fms antistoff, var det ingen signifikant reduksjon.Deretter ble osteoklalastformasjonen i M-CSF og TNF alfabehandlet kultur, med Anti-c-fms antistoff, evaluert. Med 10, 100, 1, 000 nanogram per milliliter Anti-c-fms antistoff, ble det observert en signifikant reduksjon i antall osteoklaster sammenlignet med kontroll, uten signifikant reduksjon ved ett nanogram per milliliter. Og M-CSF-kulturen med 1, 10, 100 nanogram per milliliter Anti-c-fms antistoff, det var ingen signifikant reduksjon i antall osteoklalast forløpere sammenlignet med kontroll.Men ved 1000 nanogram per milliliter var det en betydelig reduksjon i antall osteoklalast forløpere, noe som indikerer at en konsentrasjon så høyt som 1000 nanogram per milliliter er nødvendig for å hemme spredning av osteoklalast forløpere betydelig. Sørg for å frigjøre obligasjonene mens du holder beinet intakt, noe som vil minimere sjansen for forurensning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Måling av antistoffer Effekter på cellulær funksjon av isolerte cardiomyocytes

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Synergieffekten av synlig lys og Gentamycin på<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Mikroorganismer

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Gransker effekten av Probiotika på Pneumokokk Colonization Bruke en<em&gt; In Vitro</em&gt; Overholdelse analysen

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Metoder for kvantitativ påvisning av antistoff-indusert komplementaktivering på røde blodlegemer

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Makrofag Kolesterol Nedbryting og dens effekt på Fagocytose av<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Generasjon av lymfatisk Mikropartikler og Påvisning av deres proapoptotiske Effekt på Airway Epitelceller

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Høy gjennomstrømning Måling av ekstracellulært DNA Slipp og kvantitative NET-formasjonen i Human Neutrophils<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Tyde og Imaging Patogenese og snor av<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; I sebrafisk embryo

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infeksiøs Cell Culture System og<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylaktisk Effekt av Interferon

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...