Name: effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro at JoVE.com

Detta arbete stöds delvis av en JSPS KAKENHI bevilja från Japan Society för främjande av vetenskap (nr 16K 11776 till H. K., nr 17K 17306 till K. S., No. 16K 20637 till K. K., No. 16K 20636 till M. S., No. 18K 09862 till I. M.).

Alla förfaranden för djur och Djurvård utfördes enligt Tohoku University regler och föreskrifter.
1. murina bakbenet dissektion och hantering
<ol><li>Innan dissektion, Fyll en tallrik med ca 50 mL av α-MEM beroende på storleken på behållaren och placera den på is. Detta kommer att fungera som en samling behållare tills dissektion av alla ben är klar. För detta och efterföljande använda experiment, α-MEM innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 IE/mL penicillin G och 1...

<ol>
	<li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoimmunology:+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss.">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts.">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li><li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF/RANKL-RANK+interaction.">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis.">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li><li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction.">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li><li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor.">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li><li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation.">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis.">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li><li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo.">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li><li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model.">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice.">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement.">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li><li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes.">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li><li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development.">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes &amp; Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li><li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+(op/op)+mouse.">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li><li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis.">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li><li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints.">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li></ol>

I denna studie undersökt vi effekten av anti-c-fms-antikropp på RANKL-inducerad osteoclast bildandet, TNF-α-inducerad osteoclast bildning och M-CSF-inducerad osteoclast föregångare spridning. Vi fann att den effektiva mängden anti-c-fms antikropp för hämning av osteoclastogenesis bland RANKL-inducerad osteoclast bildandet, TNF-α inducerad osteoclast bildandet och M-CSF-inducerad spridning av osteoclast prekursorer är olika.
RANKL förmedlar osteoclastogenesis i närvaro av M-CSF in v...

Osteoklaster är högt specialiserade celler, och de skilja från hematopoetiska stamceller genom fusion av flera osteoclast prekursorer. De är viktiga för friska benremodellering och bidra till patologiska benresorption som är associerad med osteolytiska inflammationssjukdomar såsom reumatoid artrit och tandlossning1.
Osteoclastogenesis och osteoclast funktion förmedlas av två viktiga faktorer; makrofag kolonistimulerande faktor (M-CSF) och receptor activator av nuclear factor kappa-B-ligand (RANKL). Både M-CSF och RANKL är viktiga för osteoclast differentiering2. En annan faktor som har visat sig framkalla osteoclast bildas från benmärgen makrofager in vitro-är tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α)3,4,5. TNF-α medierad osteoclast bildandet har visat sig vara avgörande för Osteolys i destruktiva skelettsjukdomar såsom reumatoid artrit6, tandlossning7och postmenopausal osteoporos8.
C-fms är membranet receptorn av M-CSF och förmedlar sin talan. Rollen som c-fms är väl dokumenterade i litteraturen som det visades att administrering av en antikropp mot c-fms (anti-c-fms antikropp) helt greps osteoclastogenesis i en artrit modell samt i TNF-α inducerade benet erosioner medan osteoclastogenesis fjärran från den inflammera leden var fortfarande robust9. Administrering av anti-c-fms antikropp hämmade osteoclast bildandet och ben resorption induceras av lipopolysackarid (LPS) i mus calvariae10 samt för liksom LPS-inducerad parodontit modell11. Dessutom inhiberad anti-c-fms antikropp mekaniska stressinducerade root resorption under Tandregleringstjänster tand rörelse12, liksom Tandregleringstjänster tand rörelse och benresorption kopplad Tandregleringstjänster tand rörelse13.
M-CSF har rapporterats ha andra funktioner som är väsentliga för värd immunsvaret. Avsaknad av M-CSF i op/op möss med bakteriell lunginflammation leda till en ökning av bakteriell börda och bakteriell spridning till levern med levernekros14. M-CSF är därför viktigt för immunologisk reaktion i skyddet från infektion.
Denna studie visar effekten av anti-c-fms-antikropp på M-CSF och RANKL eller TNF-α inducerad osteoclast bildande in vitro- och M-CSF inducerad spridning av osteoclast prekursorer. Detta protokoll visar isolering av murina benmärgsceller från långa ben, och stegen att generera benmärgen makrofager (BMM) som betraktas som osteoclast prekursorer och inducerar differentiering av BMM in multinukleära Osteoklasterna av två metoder; RANKL eller TNF-α. Protokollet jämför också arresteringen av osteoclastogenesis i båda metoderna med anti-c-fms antikroppen.
Processen genom vilken benmärg extraheras och sedan används för att generera osteoclast prekursorer är tillförlitlig i producerar stora kvantiteter av ren osteoclast kulturer som kan användas i flera nedströms tillämpningar som drogtester. Användning av antingen RANKL eller TNF-α att inducera osteoclastogenesis i detta protokoll skiljer osteoclastogenesis som en fysiologisk process (RANKL) från osteoclastogenesis som en patologisk process (TNF-α), som i sin tur ger två alternativa förfaranden för att vägleda beslut av vilka en är överlägsen när det gäller reagenserna som ska användas i efterföljande program. Detta protokoll ger också en metod genom vilken vi kan bestämma en lämplig koncentration av anti-c-fms-antikropp som kan användas säkert för senare studier involverade i benresorption och osteolytiska sjukdomar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-c-Fms antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant murine TNF-&#945; prepared in our laboratory. TNF-&#945; cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-&#945; was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-&#945; was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer&#8217;s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-11</td>
			<td>Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14&#8211;12 cell line culture supernatant at 5X106&#160;cells in a 10-cm suspension culture dish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>with L-Glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>s1820-500</td>
			<td>Fetal Bovine Serum French Origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>100 mm x 20 mm style dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nun clon Delta surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting kit-8</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>40 &#956;m Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>50 mL CentriStar cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro

Benremodellering är en komplex process och det innebär perioder av nedfall och resorption. Benresorption är en process genom vilken ben bryts ned av osteoklaster som svar på olika stimuli. Osteoclast prekursorer differentieras till multinukleära osteoklaster svar på makrofag kolonistimulerande faktor (M-CSF) och receptor activator av nuclear factor Kappa-B-ligand (RANKL). Under patologiska förhållanden, cytokin profil är olika och innebär en blandning av inflammatoriska cytokiner. Tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α) är en av de viktigaste cytokiner som det finns i stora mängder i områden med inflammatoriska Osteolys. Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla en metod genom vilken murina benmärg är isolerade för att generera osteoklaster genom induktion med M-CSF och RANKL eller TNF-α som därefter kommer att hämmas av ökande doser av anti-c-fms-antikropp, receptorn för M-CSF. Detta experiment belyser det terapeutiska värdet av anti-c-fms-antikroppar vid sjukdomar i inflammatoriska benresorption.

Syftet med detta protokoll är att utvärdera effekten av anti-c-fms-antikropp på osteoclast bildas i närvaro av RANKL eller TNF-α och att avgöra effekten av M-CSF på osteoclast prekursorer spridning. I detta protokoll, har vi tillhandahållit en tillförlitlig process genom vilken stora mängder ren osteoclast kulturer genereras. Vi har också gett ett sätt att testa lämplig anti-c-fms antikroppskoncentration för att hämma osteoclast bildandet under olika odlingsbetingelser....

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro at JoVE.com

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Detta protokoll innehåller dissekering av murina långa ben och benmärg isolering, att generera benmärgen makrofager och producerar Osteoklasterna använder makrofag kolonistimulerande faktor (M-CSF) och receptor activator av nuclear factor Kappa-B-ligand (RANKL) eller tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α) och deras gripande av anti-c-fms-antikropp, M-CSF-receptorn.

Effekten av Anti-c-fms-antikropp på Osteoclast bildande och spridning av Osteoclast föregångare In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Detta experiment belyser det terapeutiska värdet av Anti-c-fms antikropp i sjukdomar av inflammatoriska ben störningar, såsom reumatoid artrit och parodontit. Den process genom vilken benmärg utvinns och används för att generera osteoklast prekursorer, ger stora mängder rena osteoklaster, som kan användas i flera nedströms applikationer. Detta protokoll ger två alternativa metoder för osteoklastogenes, antingen med hjälp av RANKL ligand eller TNF alfa.Utöver det ger denna metod insikt i effekten av Anti-c-fms antikropp på osteoklasasogenes. Visuell demonstration av detta förfarande bekantar forskaren med processen för dissektion och erhålla benmärgsceller i stora mängder. För att börja fylla en platta som kommer att fungera som en uppsamlingsbehållare med cirka 50 milliliter alfa MEM, beroende på storleken på behållaren, och placera den på is.Använd stift för att genomborra handflatorna och fötterna på en avlivad mus för att fixa det i ryggläge, och spraya noggrant med 70%etanol. Använd sterila kirurgiska sax och pincett för att göra en hud snitt i nivå med höften och utvidga den ner till fötterna, utsätta musklerna. Lokalisera och skär senan fästa quadriceps muskeln.Skala bort muskeln och skär den i höftens nivå. Sedan lokalisera senan fästa hamstring muskeln till benet. Skala bort musklerna utsätta benet, och befria hamstring från sitt fäste, se till att inte skära i benet.Placera saxen mellan lårbenets huvud och ledutrymmet. Skär i det befria lårbenet, men att hålla benet intakt, vilket kommer att möjliggöra lossnar av benen utan risk för att exponera benmärgen. Cutaway musklerna knutna till skenbenet på ett liknande sätt.Skär sedan skenbenet fri från sitt fäste vid fotleden, samtidigt som benet behålls intakt för att undvika kontaminering. Använd saxbladen och lab våtservetter för att skrapa eventuella kvarvarande mjukvävnad från lårbenet och skenbenet och placera dem i den förberedda plattan med alfa MEM placeras på is. Dissektionen ska utföras noggrant för att minimera kontaminering.Det är därför grundlig mjukvävnad avlägsnande och ben lokalisering är avgörande. Fyll en 30 gauge nålspruta med alpha MEM. Koppla bort skenbenet och lårbenet bort från knäleden, och skär ändarna av det långa benet från båda sidor med hjälp av sax.Använd pincett för att hålla benet från skaftet. Sätt in nålen i märgutrymmet till benet och spola långsamt in märgens innehåll i en sex centimeters odlingsfat och upprepa för alla ben. Benet kommer att bli vitt, vilket indikerar extraktionen av all benmärgshalt.Använd en 40 mikrometer nylon cell sil att anstränga benmärgen extrakt i en 50 milliliter konisk centrifug röret. Centrifugera röret vid 300 gånger G i fem minuter. Kassera supernatanten.För att tvätta, tillsätt fem milliliter alfa MEM till pelleten. Pipettera cellerna för att lossna dem, centrifug, och upprepa tvätten för totalt två gånger. Efter att ha räknat dessa isolerade celler, som beskrivs i manuskriptet, utsäde 10 miljoner celler per 10 milliliter, i en 10 centimeter kultur skålen, och lägga M-CSF till cellerna.Inkubera kulturen vid 37 grader Celsius, 5%koldioxid i tre dagar. Ta bort mediet efter tre dagar, och tvätta cellerna två gånger kraftigt med 10 milliliter PBS för att avlägsna nonadherenta celler. Tillsätt fem milliliter rumstemperatur 0,02%trypsin-EDTA och PBS, och inkubera vid 37 grader Celsius, 5%koldioxid i fem minuter.Noggrant pipettera cellerna för att ta bort dem. Observera kulturen under ett mikroskop för att se till att cellerna har lossnat och visas rundade och flytande i media. När cellerna har lossnat, inaktivera reaktionen genom att lägga till fem milliliter av alfa MEM.Samla in cellerna i ett koniskt rör på 50 milliliter och centrifug vid 300 gånger G i fem minuter. Efter att du kastat supernatanten tvättar du med fem milliliter alfa-MEM och centrifug igen vid 300 gånger G i fem minuter. Åter upphäva pelleten i 10 milliliter alfa MEM.Frö 1 miljon celler per 10 milliliter i en 10 centimeter kultur skålen, och lägg M-CSF. Inkubera kulturen vid 37 grader Celsius, 5%koldioxid i tre dagar. Skörda de bifogade cellerna, som representerar BMMs som osteoklast prekursorer efter tre dagar, som gjort tidigare under generering av BMMs.Seed de BMMs på 50, 000 celler per 200 mikro liter alfa MEM i en 96 väl platta per brunn. Till varje brunn, lägg till önskade stimuli. Och sedan lägga M-CSF för en slutlig koncentration av 100 nanogram per milliliter.Lägg Anti-c-fms antikropp till varje brunn. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius, 5% koldioxid i fyra dagar, samtidigt byta media varannan dag i fyra dagar. Och fortsätt sedan med färgning och analyser, som beskrivs i manuskriptet.Osteoklastbildningen i M-CSF och RANKL-behandlad kultur, med Anti-c-fms antikropp, utvärderades. Med 101, 000 nanogram per milliliter Anti-c-fms-antikropp, observerades en signifikant minskning av antalet osteoklaster jämfört med kontroll. Medan, med en av 10 nanogram per milliliter Anti-c-fms antikropp, det fanns ingen signifikant minskning.Sedan utvärderades osteoklastbildningen i M-CSF och TNF alfabehandlad odling, med Anti-c-fms-antikropp. Med 10, 100, 1, 000 nanogram per milliliter Anti-c-fms-antikropp observerades en signifikant minskning av antalet osteoklaster jämfört med kontroll, utan någon signifikant minskning vid ett nanogram per milliliter. Och M-CSF-kulturen med 1, 10, 100 nanogram per milliliter Anti-c-fms-antikropp, det fanns ingen signifikant minskning av antalet osteoklasterprekursorer jämfört med kontroll.Vid 1, 000 nanogram per milliliter, fanns det dock en betydande minskning av antalet osteoklaster prekursorer, vilket tyder på att en koncentration så hög som 1, 000 nanogram per milliliter behövs för att avsevärt hämma spridningen av osteoklast prekursorer. Se till att frigöra obligationerna samtidigt som benet intakt, vilket kommer att minimera risken för kontaminering.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro biofilm bildning i en 8-brunnars avdelningen Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Mätning av antikropp Effekter på cellulär funktion av isolerade hjärtmuskelceller

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Den synergistiska effekten av synligt ljus och Gentamycin på<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Mikroorganismer

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Undersöka effekterna av probiotika på Pneumococcal Colonization Använda en<em&gt; In Vitro</em&gt; Adherensanalysen

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Metoder för kvantitativ detektion av antikroppsinducerad komplementaktivering på röda blodkroppar

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Makrofag Kolesterol Utarmning och dess effekt på Fagocytos av<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Generering av Lymfocytisk mikropartiklar och detektion av deras proapoptotiska Effekt på Airway epitelceller

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Hög genomströmning Mätning av extracellulärt DNA utsläpp och Kvantitativ NET bildning i humana neutrofiler<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Dechiffrera och Imaging patogenes och Cording av<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; I zebrafiskembryon

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious cellodlingssystem och<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylaktiska effekten av interferoner

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...