Name: effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro at JoVE.com

Bu eser kısmen JSP'ler KAKENHI tarafından desteklenen bilim promosyon (No. 16 K 11776 H. K., No 17 bin 17306 K. S., No. 16 K 20637 K. K., No. 16 K 20636 M. S., No 18 K 09862 ı. M için için için için için.) Japonya toplumdan verin.

Tüm hayvan yordamlar ve hayvan bakımı Tohoku Üniversitesi kurallara ve düzenlemelere göre yapıldı.
1. fare Hindlimb diseksiyon ve işleme
<ol><li>Diseksiyon önce bir tabak α-MEM konteyner boyutuna bağlı olarak yaklaşık 50 mL ile doldurun ve Buza koyun. Tüm kemikler diseksiyon tamamlanana kadar bu bir koleksiyon kapsayıcı olarak görev yapacak. Bu ve sonraki deneyler, α-MEM içeren % 10 fetal sığır serum (FBS), 100 IU/mL penisilin G ve 100 μg/mL streptomisin kullanın.</...

<ol>
	<li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoimmunology:+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss.">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).</li><li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+by+osteoclasts.">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li><li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts.">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li><li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF/RANKL-RANK+interaction.">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis.">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li><li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction.">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li><li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor.">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li><li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation.">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis.">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li><li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo.">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li><li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model.">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice.">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li><li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement.">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li><li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes.">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li><li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development.">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes &amp; Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li><li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+(op/op)+mouse.">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li><li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis.">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li><li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints.">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li></ol>

Bu çalışmada, biz anti-c-fms antikor RANKL kaynaklı Osteoklast oluşumu, TNF-α-indüklenen Osteoklast oluşumu ve M-CSF-indüklenen Osteoklast habercisi yayılması üzerindeki etkisini araştırdık. Biz anti-c-fms antikor osteoclastogenesis RANKL kaynaklı Osteoklast oluşumu, TNF-α indüklenen Osteoklast oluşumu ve M-CSF-indüklenen yaygın Osteoklast öncüleri arasında inhibisyonu için etkili miktarı farklı olduğunu fark ettik.
RANKL aracılık eder osteoclastogenesis M-CSF t?...

Osteoklastlar uzmanlaşmış hücrelerdir ve hematopoetik kök hücre birden çok Osteoklast öncüleri füzyonu sayesinde ayırt. Onlar romatoid artrit ve periodontal hastalık1gibi inflamatuar osteolitik hastalıklarla ilişkili patolojik kemik rezorpsiyonu katkıda ve sağlıklı kemik tadilat nedeniyle gereklidir.
Osteoclastogenesis ve Osteoklast işlevi iki anahtar faktör tarafından aracılı; makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve reseptör aktivatör nükleer faktör kappa B ligand (RANKL). M-CSF ve RANKL Osteoklast farklılaşma2için önemlidir. Kemik iliği makrofajlar tüp bebek üzerinden Osteoklast oluşumu ikna etmek için gösterilen başka bir tümör nekrozis faktör alfa (TNF-α)3,4,5faktördür. TNF-α Osteoliz romatoid artrit6, periodontal hastalık7ve Postmenopozal Osteoporoz8gibi yıkıcı kemik hastalıklarında için kritik olmak aracılı Osteoklast oluşumu gösterilmiştir.
C-fms M-CSF membran reseptör ve eylem aracılık eder. C-fms (anti-c-fms antikor) karşı bir antikor yönetimini tamamen osteoclastogenesis artrit modelinde tutuklandı yanı sıra TNF-α içinde kemik erozyonlar süre indüklenen gösterilmiştir gibi c-fms rolü de literatürde belgelenen iltihaplı eklem üzerinden uzak osteoclastogenesis hala sağlam9yaşındaydım. Anti-c-fms antikor İdaresi Osteoklast oluşumu ve kemik rezorpsiyonu fare calvariae10 de olduğu gibi LPS kaynaklı periodontitis modeli11. lipopolysaccharide (LPS) tarafından indüklenen inhibe Ayrıca, anti-c-fms antikor mekanik stres kaynaklı kök rezorpsiyonu ortodontik diş hareketi12, aynı zamanda Ortodonti diş hareketi sırasında ve ortodontik diş hareketi13ile ilişkili kemik rezorpsiyonu inhibe.
M-CSF konak immün yanıt için gerekli olan diğer işlevler için rapor edildi. M-CSF bakteriyel pnömoni ile op/op farelerde yokluğu bakteri yükü ve karaciğere hepatik nekroz14ile bakteri yayılmasını artış yol açar. Bu nedenle, M-CSF enfeksiyon korunmasında immünolojik yanıt için önemlidir.
Bu çalışmada anti-c-fms antikor etkisi M-CSF ve RANKL veya TNF-α Osteoklast oluşumu tüp bebek indüklenen ve M-CSF Osteoklast öncüleri yayılması indüklenen gösterir. Bu iletişim kuralı yalıtım fare kemik iliği hücrelerinin uzun kemiklerde ve Osteoklast öncüleri kabul edilmektedir kemik iliği makrofajlar (BMM) oluşturmak ve BMM farklılaşma multinuclear Osteoklastlar içine iki tarafından ikna etmek için adımları gösterir yöntemleri; RANKL veya TNF-α. Protokol Ayrıca anti-c-fms antikor kullanarak her iki yöntem de osteoclastogenesis tutuklanması karşılaştırır.
Hangi kemik iliği çıkarılan ve daha sonra Osteoklast öncüleri oluşturmak için kullanılan büyük miktarlarda uyuşturucu testi gibi birden çok downstream uygulamalarında kullanılan saf Osteoklast kültürlerin üretiminde güvenilir işlemidir. RANKL ya da TNF-α osteoclastogenesis bu protokolündeki ikna etmek için osteoclastogenesis fizyolojik bir süreç (RANKL) olarak osteoclastogenesis hangi sırayla rehberlik için iki alternatif yordam sağlar bir patolojik süreç olarak (TNF-α) ayıran bir aşağı akım uygulamalarda kullanılmak üzere reaktifleri açısından üstün olduğu karar. Bu iletişim kuralı Ayrıca hangi tarafından biz güvenli bir şekilde daha sonraki çalışmalar kemik rezorpsiyonu ve osteolitik hastalıklar için kullanılan anti-c-fms antikor uygun bir konsantrasyon belirleyebilirsiniz bir yöntem sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-c-Fms antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant murine TNF-&#945; prepared in our laboratory. TNF-&#945; cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-&#945; was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-&#945; was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer&#8217;s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-11</td>
			<td>Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14&#8211;12 cell line culture supernatant at 5X106&#160;cells in a 10-cm suspension culture dish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>with L-Glutamine and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>s1820-500</td>
			<td>Fetal Bovine Serum French Origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>100 mm x 20 mm style dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Nun clon Delta surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting kit-8</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>40 &#956;m Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>50 mL CentriStar cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td></td>
			<td>Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of anti-c-fms antibody on osteoclast formation and proliferation of osteoclast precursor in vitro

Kemik remodeling karmaşık bir süreçtir ve ifade ve rezorpsiyonu dönemleri içerir. Kemik rezorpsiyonu tarafından kemik Osteoklastlar farklı uyaranlara yanıt olarak tarafından bozuldu bir süreçtir. Osteoklast öncüleri makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve reseptör aktivatör nükleer faktör Kappa B ligand (RANKL) yanıt olarak multinuclear Osteoklastlar içine ayırt etmek. Patolojik koşullarda sitokin profili farklıdır ve inflamatuar sitokinlerin karışımı içerir. Bu bölgelerde inflamatuvar mekanizmaları ile ilgili büyük miktarlarda bulunur gibi tümör nekrozis faktör alfa (TNF-α) en önemli sitokinler biridir. Hangi fare kemik iliği Osteoklastlar M-CSF ve RANKL veya daha sonra anti-c-fms antikor, reseptör doz artırarak inhibe TNF-α ile indüksiyon yoluyla oluşturmak için izole bir yöntem sağlamak amacıyla bu iletişim kuralının amacı olduğunu M-CSF. Bu deney anti-c-fms antikor inflamatuar kemik rezorpsiyonu hastalıklarında tedavi edici değerini vurgular.

Bu iletişim kuralı Osteoklast oluşumu RANKL veya TNF-α huzurunda anti-c-fms antikor etkisini değerlendirmek ve M-CSF Osteoklast öncüleri yayılması üzerindeki etkisini belirlemek için amaçtır. Bu protokol için biz güvenilir bir süreç büyük miktarlarda saf Osteoklast kültürler tarafından oluşturulduğu sağladı. Biz de farklı kültür koşullar altında Osteoklast oluşumu inhibe için uygun toplama anti-c-fms antikor test etmek için bir yol sağladı.
<p class...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro at JoVE.com

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Bu iletişim kuralı fare uzun kemik ve kemik iliği makrofajlar oluşturup Osteoklastlar makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve reseptör aktivatör nükleer faktör Kappa B ligand (RANKL) kullanarak üretmek için kemik iliği yalıtım, diseksiyon içerir veya tümör nekroz faktör alfa (TNF-α) ve anti-c-fms antikor, M-CSF reseptör tarafından onların tutuklama.

Osteoklast oluşumu ve hızla çoğalmak-in Vitro Osteoklast habercisi Anti-c-fms antikor etkisi

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Bu deney, romatoid artrit ve periodontit gibi inflamatuar kemik bozulması hastalıklarında Anti-c-fms antikor terapötik değerini vurgulamaktadır. Kemik iliği ayıklanır ve osteoklast öncüleri oluşturmak için kullanılan süreci, birden fazla downstream uygulamalarında kullanılabilir saf osteoklastlar, büyük miktarlarda verir. Bu protokol, RANKL ligand veya TNF alfa kullanılarak osteoklaztogenezin iki alternatif yöntemini sağlar.Buna ek olarak, bu yöntem osteoklaztogenez üzerinde Anti-c-fms antikor etkisi içine fikir sağlar. Bu prosedürün görsel gösterimi, araştırmacıyı diseksiyon süreci ve büyük miktarlarda kemik iliği hücrelerinin elde edilmesi ile yakından tır. Alfa MEM yaklaşık 50 mililitre ile bir toplama konteyner olarak hizmet verecek bir plaka doldurmak başlamak için, konteyner büyüklüğüne bağlı olarak, ve buz üzerine yerleştirin.Supine pozisyonda düzeltmek için bir ötenazi farenin avuç içi ve ayaklarını delmek için iğneler kullanın ve % 70 etanol ile iyice sprey. Kalça düzeyinde bir deri kesi yapmak ve kasları açığa, ayaklar için aşağı uzatmak için steril cerrahi makas ve cımbız kullanın. Quadriceps kas takarak tendon bulmak ve kesmek.Kas soyma ve kalça düzeyinde kesti. Sonra kemiğe hamstring kas bağlı tendon bulun. Kemiği açığa çıkaran kasları soyun ve kemiği kesmemelerini sağlayarak hamstring'i ekinden kurtarın.Makası uyluk kemiğinin başı ile eklem boşluğu arasına yerleştirin. Femur serbest bırakarak içine kesilmiş, ama kemik bozulmadan tutmak, hangi kemik iliği açığa riski olmadan kemiklerin ayrılmasını sağlayacaktır. Kaval kemiğine bağlı kasları benzer bir şekilde kesin.Daha sonra kaval kemiğini ayak bileği eklemindeki ekinden arındırArak, kontaminasyonu önlemek için kemiği sağlam tutarak kesin. Femur ve tibia kalan yumuşak doku kazımak ve buz üzerine yerleştirilen alfa MEM ile hazırlanan plaka ya da yerleştirmek için makas bıçakları ve laboratuvar mendil kullanın. Kontaminasyonu en aza indirmek için diseksiyon dikkatle yapılmalıdır.Bu nedenle yumuşak doku çıkarılması ve kemik lokalizasyonu çok önemlidir. 30 kalibrelik bir iğne şırıngasına alfa MEM ile doldurun. Kaval kemiğini ve uyluk kemiğini diz ekleminden uzaklaştırın ve makas kullanarak uzun kemiğin uçlarını her iki taraftan kesin.Kemiği şafttan tutmak için cımbız kullanın. İğneyi kemiğe ilik boşluğuna yerleştirin ve iliğin içeriğini yavaşça altı santimetrelik bir kültür yemeğine boşaltın ve tüm kemikler için tekrarlayın. Kemik beyaza dönecek, bu da tüm kemik iliği içeriğinin çıkarını gösteriyor.Kemik iliği ekstresini 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne sokmak için 40 mikrometrelik naylon hücreli süzgeç kullanın. Tüpü 300 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın.Yıkamak için, pelet alfa MEM beş mililitre ekleyin. Pipet hücreleri ayırmak için, santrifüj, ve iki kez toplam yıkama tekrarlayın. Bu izole hücreleri sayarak, el yazmasında açıklandığı gibi, 10 mililitrede 10 milyon hücre tohum, 10 santimetrelik bir kültür kabına tohum ve hücrelere M-CSF ekleyin.Kültürü 37 derecede kuluçkaya yatırın, üç gün boyunca %5 karbondioksit. Üç gün sonra ortamı çıkarın ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için hücreleri 10 mililitre PBS ile iki kez şiddetle yıkayın. Oda sıcaklığında beş mililitre ekleyin 0.02%tripsin-EDTA ve PBS, ve inkübat 37 santigrat derece, 5% 5 karbondioksit beş dakika için.Hücreleri ayırmak için iyice pipetleyin. Hücrelerin ayrılmış olduğundan ve medyada yuvarlak ve yüzer göründüğünden emin olmak için kültürü mikroskop altında gözlemleyin. Hücreler ayrıldıklarında, alfa MEM beş mililitre ekleyerek reaksiyon inaktive.Hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüp ve santrifüj içine toplayın 300 kez G beş dakika için. Supernatant attıktan sonra, alfa MEM beş mililitre ile yıkayın ve beş dakika boyunca 300 kez G tekrar santrifüj. 10 mililitre lik alfa MEM'de peleti yeniden askıya alın.10 santimetrelik bir kültür kabında 10 mililitrede 1 milyon hücre tohumlayın ve M-CSF ekleyin. Kültürü 37 derecede kuluçkaya yatırın, üç gün boyunca %5 karbondioksit. Üç gün sonra Osteoklast öncüleri olarak MM'leri temsil eden bağlı hücreleri hasat edin, daha önce KİM'lerin üretimi sırasında olduğu gibi.Tohum 50, 000 hücre başına 200 mikro alfa MEM litre başına 96 iyi plaka başına. Her iyi için, istenilen uyaranları ekleyin. Ve sonra mililitre başına 100 nanogram son konsantrasyon için M-CSF ekleyin.Her kuyuya Anti-c-fms antikor ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede, dört gün boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın ve dört gün boyunca her gün ortam değiştirin. Ve sonra el yazmasında açıklandığı gibi boyama ve tahliller ile devam edin.Anti-c-fms antikorlu M-CSF ve RANKL tedavi kültüründe osteoklast oluşumu değerlendirildi. Mililitre Anti-c-fms antikor başına 101,000 nanogram ile kontrole göre osteoklast sayısında önemli bir azalma gözlenmiştir. Oysa mililitre Anti-c-fms antikorbaşına 10 nanogramda bir azalma yoktu.Daha sonra Anti-c-fms antikorlu M-CSF ve TNF alfa tedavi kültüründe osteoklast oluşumu değerlendirildi. Mililitre Anti-c-fms antikor başına 10, 100, 1, 000 nanogram ile, osteoklast sayısında önemli bir azalma gözlendi kontrol göre, mililitre başına bir nanogram önemli bir azalma ile. Ve mililitre Anti-c-fms antikor başına 1, 10, 100 nanogram ile M-CSF kültürü, kontrol ile karşılaştırıldığında osteoklast öncüleri sayısında önemli bir azalma yoktu.Ancak, mililitre başına 1,000 nanogram, osteoklast öncüleri sayısında önemli bir azalma vardı, mililitre başına 1, 000 nanogram gibi yüksek bir konsantrasyon önemli ölçüde osteoklast öncüleri çoğalmasını inhibe etmek için gerekli olduğunu belirten. Kemiği bozulmadan tutarken bağları serbest bıraktıklarından emin olun, bu da kontaminasyon olasılığını en aza indirecektir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

8-iyi Odası Slayt in vitro Biyofilm Oluşumu

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

İzole kardiyomiyositlerin Hücresel Fonksiyon üzerine Antikor Etkilerinin Ölçümü

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Üzerinde görebilir Işık ve Gentamisin en Sinerjik Etkisi<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Mikroorganizmalar

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi<em&gt; In Vitro</em&gt; Yapışma Deneyi

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Kırmızı kan hücreleri üzerinde antikor kaynaklı kompleman aktivasyon sayısal tespiti için Yöntemler

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Makrofaj Kolesterol tükenmesi ve Fagositoz Üzerine Etkisi<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Havayolu Epitel Hücreleri üzerinde Lenfositik mikrotanecikler ve proapoptotik Etkisi Algılama Üretimi

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Ekstraselüler DNA Yayın Yüksek Verimli Ölçme ve İnsan Nötrofiller Kantitatif NET Oluşumu<em&gt; İn Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Zebra balığı Embriyolar

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...