Name: an ex vivo tissue culture model for fibrovascular complications in proliferative diabetic retinopathy
Uploaded: 2019-01-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy at JoVE.com

Les auteurs sont reconnaissants aux collègues de rétine médicale et chirurgicale, infirmières et tout le personnel de l’unité diabétique et l’unité de chirurgie vitréo-rétinienne dans le département d’ophtalmologie, hôpital universitaire de Helsinki pour participer activement au recrutement des patients. Nous remercions Biomedicum unité d’imagerie moléculaire pour les installations d’imagerie. Nous remercions Anastasiya Chernenko excellente assistance technique. Cette étude a été financée par des subventions de l’Académie de Finlande (KL), Université d’Helsinki (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), Institut finlandais de Cancer (KL), Karolinska Institutet (KL), finlandais Eye Foundation (SL), œil et Banque de tissus Foundation (SL), Mary et Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) et subventions de recherche clinique HUCH (TYH2018127 après TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG) ainsi que le Programme Doctoral en biomédecine (EG).

Cette recherche a été approuvée par l’Institutional Review Board et le Comité d’éthique de l’hôpital universitaire de Helsinki. Le consentement éclairé signé a été obtenu chez chaque patient.
1. préparation des Solutions, des médias et des équipements
<ol><li>Préparer le matériel suivant avant le prélèvement du tissu fibrovasculaire (FT) pour assurer un traitement rapide.<ol>
<li>Pincettes de microdissection stérile-autoclave deux.</li>
		<li>Préparer 1 x solution s...

<ol>
	<li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li><li>Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+Review:+Changes+in+the+Incidence+of+and+Progression+to+Proliferative+and+Sight-Threatening+Diabetic+Retinopathy+Over+the+Last+30+Years.">Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years.</a> Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).</li><li>Loukovaara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indications+of+lymphatic+endothelial+differentiation+and+endothelial+progenitor+cell+activation+in+the+pathology+of+proliferative+diabetic+retinopathy.">Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy.</a> Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).</li><li>Stitt, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progress+in+understanding+and+treatment+of+diabetic+retinopathy.">The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).</li><li>Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+current+understanding,+mechanisms,+and+treatment+strategies.">Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies.</a> JCI Insight. 2 (14), (2017).</li><li>Gross, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-Year+Outcomes+of+Panretinal+Photocoagulation+vs+Intravitreous+Ranibizumab+for+Proliferative+Diabetic+Retinopathy:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).</li><li>Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+animal+models+of+diabetic+retinopathy:+from+molecular+approaches+to+mice+and+higher+mammals.">Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals.</a> Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).</li><li>Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+retinopathies:+animal+models+and+therapeutic+opportunities.">Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities.</a> Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).</li><li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix:+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer.">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).</li><li>Sharma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+treatment+for+diabetic+vitreoretinal+diseases:+a+review.">Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review.</a> Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).</li><li>Gucciardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+of+proliferative+diabetic+retinopathy+supports+lymphatic+neovascularization.">The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization.</a> The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+endothelial+cell+spheroid/human+vitreous+humor+assay+for+the+characterization+of+anti-angiogenic+inhibitors+for+the+treatment+of+proliferative+diabetic+retinopathy.">3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy.</a> Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).</li><li>Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+a+paradigm+for+balanced+extracellular+proteolysis+during+cell+migration+and+morphogenesis.">Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis.</a> Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).</li><li>Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+tubulogenesis+within+fibrin+gels+specifically+requires+the+activity+of+membrane-type-matrix+metalloproteinases+(MT-MMPs).">Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs).</a> Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).</li><li>Loukovaara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomics+Analysis+of+Vitreous+Humor+from+Diabetic+Retinopathy+Patients.">Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients.</a> Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).</li><li>Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+stem+cell+factor/c-kit+signaling+pathway+components+in+diabetic+fibrovascular+epiretinal+membranes.">Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes.</a> Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).</li><li>Loukovaara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ang-2+upregulation+correlates+with+increased+levels+of+MMP-9,+VEGF,+EPO+and+TGFbeta1+in+diabetic+eyes+undergoing+vitrectomy.">Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy.</a> Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).</li><li>Sugiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA2+cleavage+by+MT1-MMP+triggers+single+cancer+cell+invasion+via+homotypic+cell+repulsion.">EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion.</a> Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).</li><li>Tatti, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP16+Mediates+a+Proteolytic+Switch+to+Promote+Cell-Cell+Adhesion,+Collagen+Alignment,+and+Lymphatic+Invasion+in+Melanoma.">MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma.</a> Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).</li><li>Senger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+framework+for+angiogenesis:+a+complex+web+of+interactions+between+extravasated+plasma+proteins+and+endothelial+cell+proteins+induced+by+angiogenic+cytokines.">Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines.</a> American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).</li><li>Senger, D. R., Davis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis.">Angiogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).</li><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel.">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).</li><li>Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+modeling+macular+degeneration+in+mice.">The challenge of modeling macular degeneration in mice.</a> Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).</li><li>Kim, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cells+from+patient-derived+fibrovascular+membranes+in+proliferative+diabetic+retinopathy.">Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy.</a> Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).</li><li>Avery, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+bevacizumab+(Avastin)+in+the+treatment+of+proliferative+diabetic+retinopathy.">Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy.</a> Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).</li><li>Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+outcomes+of+vitrectomy+with+or+without+intravitreal+bevacizumab+pretreatment+for+severe+diabetic+retinopathy.">A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy.</a> The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).</li><li>Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+safe+and+efficient+method+to+retrieve+mesenchymal+stem+cells+from+three-dimensional+fibrin+gels.">A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).</li></ol>

Compte tenu de l’importance du microenvironnement tissu pertinentes pour cellule fonctionnelle fiable et résultats de mécaniques moléculaires, il est impératif de trouver des modèles expérimentaux appropriés qui fournissent cet environnement tissulaire. Le modèle ci-après décrit ex vivo PDR culture pour les FTs fibrine incorporé permet l’investigation des mécanismes de la physiopathologie de la RDP dans le contexte autochtone, complex et multicellulaire des échantillons cliniques PDR.
<p cla...

DR est une complication oculaire grave de diabète, une maladie qui a atteint des proportions énormes dans les dernières trois décennies1. Vingt ans après que le diagnostic, pratiquement tous les patients atteints de diabète de type 1 et 60 % des patients avec type 2 diabète présente des signes de rétinopathie, rendant le diabète en soi l’un des principaux causes de cécité dans le travail des adultes d’âge2. Selon le degré de dégénérescence microvasculaire et dommages ischémiques, DR est classé dans non-Proliférante (non-PDR) et DR proliférative (PDR). La maladie terminale, Lao, se caractérise par une néovascularisation induite par l’ischémie et l’inflammation et réponses fibreux à l’interface vitréo-rétinienne. Dans des conditions non traitées, ces processus conduira à la cécité due à l’hémorragie vitréenne, rétinienne fibrose, décollement de rétine Tractionnel et néovasculaire glaucome3,4. Malgré des progrès récents, les options thérapeutiques actuelles ciblent uniquement DR stades, y compris le œdème maculaire diabétique et PDR, lorsque les dommages rétiniens a déjà s’ensuivit. En outre, une grande proportion des patients du DR ne bénéficie pas actuel arsenal thérapeutique, ce qui indique un besoin urgent de traitements améliorés4,5,6.
Plusieurs autres jen vivo maladie/développement modèles et modèles animaux diabétiques ont été développés à ce jour, mais aucun d’eux ne récapitule l’ensemble des caractéristiques pathologiques observées dans humain RDP7,8. En outre, augmentant la preuve indique que les réactions aux traitements sont correctement raccordées à la composition de l’ECM ainsi que l’arrangement spatial et l’interaction entre le microenvironnement cellulaire et acellulaire9. Nous avons, par conséquent, entrepris d’élaborer un modèle cliniquement pertinent de RDP humain en utilisant le matériel pathologique FT qui est communément excisé d’yeux subissant la vitrectomie dans le cadre de la prise en charge chirurgicale des PDR10.
Ce manuscrit a décrit le protocole pour la 3D ex vivo culture et caractérisation de la chirurgicalement-excisés, PDR patient-dérivés FT pathologique. La méthode décrite ici a été utilisée dans une publication récente qui a démontré le succès déconstruction du paysage tissu PDR 3D native et récapitulation des éléments de physiopathologie PDR y compris angiogénique et réponses fibreuses de l’anormal 11de structures vasculaires. Ce modèle a également révélé caractéristiques nouvelles qui ne peuvent pas être facilement appréciés de fines coupes histologiques, tels que dans l’espace confiné l’apoptose et la prolifération comme îlot vasculaire formation11. Fluide vitreux a été utilisé avec succès par d’autres sur les cultures de sphéroïde endothéliales 3D pour évaluer son potentiel angiogénique et l’efficacité des molécules d’angiostatique12. Lorsqu’il est combiné avec un sphéroïde 3D cellules endothéliales lymphatiques (LEC) in vitro test à l’aide de corps vitré PDR comme stimulant la germination, notre modèle a révélé que la contribution de ces deux Vitréennes soluble des facteurs aussi bien en tant que locales repères dans le tissu néovasculaire à la comme encore mal compris ESL participation aux PDR physiopathologie3,11. Dans la gestion de RDP, chirurgie vitréo-rétinienne est une procédure régulièrement effectuée pourtant difficile. Comme techniques et instrumentations chirurgicales voient avancement continu et sophistication, opportune et prudente enlèvement de spécimen proliférative fibrovasculaire non seulement améliore l’issue de la vision, mais renferme aussi des documents de tissus précieux pour le enquête de PDR pathophysiologie et traitement réponses chez les aspects complexes et translationnelles du microenvironnement des tissus humains vivants.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>07.60.03</td>
			<td>Used for handling the FTs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels - Sterile</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0513</td>
			<td>Used for FT dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish, vented, 28 ml (60mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>391-3210</td>
			<td>Used for dissection and for testing fibrin gel formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>392-0049</td>
			<td>Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>391-3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>525-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Used to sterile-filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td>Used to sterile-filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB74031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142475</td>
			<td>Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 96-well, U-bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>392-0019</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round/Flat Spatulas, Stainless Steel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-528</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22x22mm #1</td>
			<td>Menzel/Fisher</td>
			<td>15727582</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Kindler K102</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-0202</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>Used for preparing 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>341578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9394-500ML</td>
			<td>Used for preparing the fibrinogen and TA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Used for preparing the blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td>Aliquoted in -20 &#176;C, thaw before preparing the ex vivo culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate 10mg/ml</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0011-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell media MV Kit</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22120</td>
			<td>Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,&#160; 500 &#956;L of recombinant human epidermal growth factor (10 &#956;g/ mL) and 500 &#956;L of hydrocortisone (1 g/ mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32201-2.5L-M</td>
			<td>Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td>Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, 20mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62249</td>
			<td>For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt Quick-hardening mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03989-100ml</td>
			<td>TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9549-500UN&#160;</td>
			<td>Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 &#176;C, avoid repeated freeze/ thaw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3428</td>
			<td>Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 &#176;C, avoid repeated freeze/ thaw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFA</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td>50 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFC</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>752-VC-025</td>
			<td>200 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TGF&#946;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF346</td>
			<td>1 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>01-106</td>
			<td>50 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (JC70A)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0823</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 (QBEND10)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M716501-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 (2B11+PD7/26)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M070129-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>ImmunoWay</td>
			<td>RLM3161</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved caspase-3 (5A1E)</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>9664</td>
			<td>Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERG (EP111)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M731429-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NCL-Ki67p</td>
			<td>Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyve1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2089</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prox1</td>
			<td>ReliaTech</td>
			<td>102-PA32</td>
			<td>Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prox1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2727</td>
			<td>Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR3 (9D9F9)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3757</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-SMA (1A4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6198</td>
			<td>Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11057</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX9 upright dissection stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For FT dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of whole-mount immunostained FT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of whole-mount immunostained FT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model for fibrovascular complications in proliferative diabetic retinopathy

Rétinopathie diabétique (RD) est la complication la plus fréquente microvasculaire du diabète et une des principales causes de cécité chez les adultes en âge de travailler. Aucun cours modèles animaux de diabète et de la rétinopathie induite par l’oxygène ne développent les gamme complète des changements progressifs manifestées dans la rétinopathie diabétique proliférative humaine (PDR). Par conséquent, la compréhension de la pathogenèse de la maladie et la physiopathologie s’est appuyé en grande partie sur l’utilisation de coupes histologiques et vitreux échantillons dans les approches qui seulement stationnaire renseignent sur les facteurs pathogènes impliqués. Augmentant la preuve indique que les cellules dynamiques et interactions cellule-extracellulaire (ECM) dans le cadre des trois dimensions (3D) micro-environnements sont essentielles pour les études mécanistiques et fonctionnels vers le développement de nouveau stratégies de traitement. Par conséquent, nous avons supposé que le tissu fibrovasculaire pathologique excisé chirurgicalement des yeux avec les PDR pourrait servir à démêler avec fiabilité les mécanismes cellulaires et moléculaires de cette maladie dévastatrice et de tester le potentiel de roman clinique interventions. À cette fin, nous avons développé une nouvelle méthode pour la 3D ex vivo culture d’excisées chirurgicalement dérivé de patient fibrovasculaire tissulaire (FT), qui servira comme un modèle pertinent de physiopathologie humaine de PDR. Les FTs sont disséqués dans les explants et incorporées dans la matrice de fibrine pour ex vivo characterization de culture et de la 3D. Immunofluorescence entier-montent des FTs natives et des cultures de point final permet une enquête approfondie de la composition du tissu et des processus multicellulaires, soulignant l’importance de la caractérisation au niveau du tissu 3D pour découvrir les caractéristiques pertinentes des Physiopathologie de la RDP. Ce modèle permettra l’évaluation simultanée des mécanismes moléculaires, les processus cellulaire/tissulaire et les réactions aux traitements dans le cadre complex des interactions biochimiques et physiques dynamiques au sein de l’architecture de tissu PDR et le microenvironnement. Étant donné que ce modèle reprend la physiopathologie de la RDP, il sera également prête pour tester ou développer de nouveaux traitements.

Meilleure compréhension des propriétés tissu fibrovasculaire PDR et expression de la protéine a compté principalement sur les échantillons vitreux et mince histologique FT sections3,15,16,17. Pour développer une méthode d’enquête approfondie sur l’organisation du tissu 3D et multicellulaires processus physiopathologiques de RDP, nous partîmes pour ...

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An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Nous présentons ici un protocole afin d’étudier la physiopathologie de la rétinopathie diabétique proliférante en utilisant les tissus dérivés de patient, excisées chirurgicalement, fibrovasculaire pour tridimensionnelle native caractérisation et ex vivo vitroplants. Cela ex vivo modèle de culture est également prête pour tester ou développer de nouveaux traitements.

Un modèle de Culture tissulaire Ex Vivo pour fibrovasculaire Complications dans la rétinopathie diabétique proliférante

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

La rétinopathie diabétique est la complication microvasculaire la plus courante du diabète. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés sur la pathophysiologie de la rétinopathie diabétique proliférante de la maladie de phase finale. Cette technique permet la déconstruction du paysage tridimensionnel indigène de tissu et l’investigation de la pathophysiologie de tissu dans le matériel patient vivant avec la pertinence clinique directe. Se référer au protocole texte pour plus de détails sur la chirurgie et l’instrumentation utilisée dans la dissection. Pour commencer, placez le tissu fibrovasculaire qui a été excisé des sujets humains subissant la chirurgie vitréoretinal transconjonctivale de microincision dans un plat de culture cellulaire contenant le PBS stérile. À l’aide d’un microscope stéréo de dissection verticale, couper le tissu fibrovasculaire en morceaux d’environ un millimètre carré. Submergez le tissu dans PBS et maintenez le tissu en place avec des pinces à épiler de micro dissection. Faites des coupes claires dans le tissu avec un scalpel stérile en prenant soin d’éviter de déchirer le tissu fibrovasculaire. Placez chaque morceau de tissu individuel dans un puits d’une plaque de culture cellulaire de 12 puits contenant un millilitre de PBS stérile. Tout d’abord, préparer 25 aliquots microlitres de solution fibrinogen à température ambiante. Placez un morceau de tissu fibrovasculaire au centre du puits d’une plaque de puits de 24 et enlevez tout excès de PBS. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de solution TA à l’un des aliquots fibrinogen préparés. Et en utilisant une autre pipette réglée à 50 microlitres mélanger par pipetting. Distribuez le mélange sur le morceau de tissu fibrovasculaire et pipette de haut en bas pour s’assurer que le morceau de tissu est contenu dans la gouttelette. Le temps de la formation de fibrinogen critique pour la tridimensionnalité de la culture ex vivo, est examiné dans une intégration vide de tissu antérieur de gouttelette comme décrit dans le protocole. Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire. Après 30 à 60 minutes incliner la plaque pour vérifier que le gel fibrin est complètement formé. Ensuite, superposer les gels fibrin tissu fibrovasculaires avec ex vivo milieu de culture complété par l’aprotinine. Après cela, retournez les plaques de culture à l’incubateur de culture cellulaire pour la période désirée. Tout d’abord, remplacer le milieu de culture ex vivo par un millilitre de solution de paraformaldéhyde par puits pour fixer les cultures. Après une heure, rincer les gels à l’aide de trois lavages PBS de cinq minutes. Ensuite, remplacez le lavage PBS par deux millilitres de solution d’azide de sodium par puits. Conserver les gels fixes à quatre degrés Celsius.Utilisez une spatule à bord carré en acier inoxydable pour soulever soigneusement les gouttelettes de la plaque, en commençant par les bords avant de soulever le centre de la gouttelette. À l’aide d’une spatule à bords ronds, transférer les gouttelettes dans des puits individuels d’une plaque de puits de 12 puits contenant un millilitre de PBS. Après cela, inclinez la plaque sur un support et postfixez les gouttelettes avec un millilitre de solution glacée de méthanol d’acétone pendant une minute. Rincez ensuite avec trois à cinq lavages millilitres de PBS. Centrifugez la solution de blocage pendant 15 minutes pour enlever les débris. Ensuite, inclinez la plaque sur un support et incuber les gouttelettes dans 500 microlitres de solution de blocage pendant deux heures à température ambiante. Préparer le mélange primaire d’anticorps selon le protocole de texte. Ensuite, utilisez une spatule à bords ronds pour transférer les gouttelettes dans une assiette ronde de 96 puits. Incuber les gouttelettes dans 30 microlitres du mélange primaire d’anticorps par gouttelette pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, transférez les gouttelettes dans une plaque de 12 puits contenant deux millilitres de solution de lavage par puits. Rincer les gouttelettes à l’aide de trois lavages de cinq minutes. Ensuite, lavez les gouttelettes avec neuf lavages de 30 minutes. Le lendemain, rincer les gouttelettes trois fois avec du PBS. Préparer le mélange d’anticorps secondaire conjugué au fluorophore selon le protocole du texte. Transférer les gouttelettes dans une plaque de puits à fond rond 96, comme démontré précédemment, et incuber la plaque avec 30 microlitres de mélange secondaire d’anticorps pendant quatre heures à température ambiante, à l’abri de la lumière.Après quatre heures, transférer les gouttelettes dans une plaque de 12 puits contenant deux millilitres de solution de lavage par puits. Tout d’abord, rincer les gouttelettes avec trois lavages de cinq minutes. Ensuite, lavez les gouttelettes avec quatre lavages de 30 minutes. Le lendemain, rincer les gouttelettes cinq fois avec une solution de lavage pendant 30 minutes, et trois fois avec PBS pendant 30 minutes. Le lendemain, transférez les gouttelettes dans une plaque ronde inférieure de 96 puits, comme nous l’avons déjà démontré. Contrestain les gouttelettes avec la tache nucléaire hoechst pendant 30 minutes à température ambiante. Transférer les gouttelettes dans une plaque de 12 puits contenant deux millilitres de PBS par puits et rincer trois fois avec du PBS. Ensuite, appliquez une couche étroite de support de montage durcissant rapide le long des bords d’un verre de couverture carré et laissez-le sécher pendant une minute. Rincez ensuite la gouttelette en la plongeant dans un puits d’une plaque de 12 puits contenant de l’eau déionisée. Et transférer la gouttelette sur une lame de microscope. Ensuite, distribuez 15 microlitres de milieu de montage anti-fondu non durcissant sur la gouttelette. Placez doucement le verre de couverture sur la gouttelette avec le milieu de montage faisant face à la glissière et laissez-le s’installer. Laissez sécher les glissières pendant deux heures à température ambiante et conservez-les à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Enfin, imagez les diapositives à l’aide d’un microscope d’épifluorescence droit équipé d’une fonction de section optique à l’objectif 20x ou 40x. Dans ce protocole le tissu fibrovasculaire a été préparé et imaged. Les données représentatives ont montré que les cultures ex vivo de RDP induisent la germination de l’endothélium positif CD-31 et la préservation de vasculature en réponse à VEGFA. Inversement, TGF

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

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Culture ex vivo des tissus du patient et l&#39;examen de la livraison de gènes

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

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