Name: an ex vivo tissue culture model for fibrovascular complications in proliferative diabetic retinopathy
Uploaded: 2019-01-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy at JoVE.com

Gli autori sono molto grati ai colleghi di retina medica e chirurgica, infermieri e tutto il personale dell'unità diabetica e unità di chirurgia vitreo-retinica presso il reparto di oftalmologia, ospedale dell'Università di Helsinki per partecipare attivamente nel reclutamento dei pazienti. Ringraziamo Biomedicum unità di Imaging molecolare per le strutture di formazione immagine. Ringraziamo Anastasiya Chernenko per l'eccellente assistenza tecnica. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da Accademia di Finlandia (KL), Università di Helsinki (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), Istituto finlandese di cancro (KL), Karolinska Institutet (KL), finlandese Eye Foundation (SL), occhio e Fondazione Banca di tessuto (SL), Maria e Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) e assegni di ricerca clinica HUCH (TYH2018127 dopo TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG) così come il programma di dottorato in biomedicina (EG).

Questa ricerca è stata approvata dal comitato etico dell'ospedale dell'Università di Helsinki e Institutional Review Board. Firmato il consenso informato è stato ottenuto da ogni paziente.
1. preparazione di soluzioni, mezzi e attrezzature
<ol><li>Preparare le seguenti attrezzature prima della raccolta del tessuto fibrovascolare (FT) per garantire un'elaborazione rapida.<ol>
<li>Pinzette di microdissection sterile-autoclave due.</li>
		<li>Preparare 1 x tampone fosfato salino (PBS) sciogl...

<ol>
	<li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li><li>Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+Review:+Changes+in+the+Incidence+of+and+Progression+to+Proliferative+and+Sight-Threatening+Diabetic+Retinopathy+Over+the+Last+30+Years.">Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years.</a> Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).</li><li>Loukovaara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indications+of+lymphatic+endothelial+differentiation+and+endothelial+progenitor+cell+activation+in+the+pathology+of+proliferative+diabetic+retinopathy.">Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy.</a> Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).</li><li>Stitt, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progress+in+understanding+and+treatment+of+diabetic+retinopathy.">The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).</li><li>Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+current+understanding,+mechanisms,+and+treatment+strategies.">Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies.</a> JCI Insight. 2 (14), (2017).</li><li>Gross, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-Year+Outcomes+of+Panretinal+Photocoagulation+vs+Intravitreous+Ranibizumab+for+Proliferative+Diabetic+Retinopathy:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).</li><li>Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+animal+models+of+diabetic+retinopathy:+from+molecular+approaches+to+mice+and+higher+mammals.">Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals.</a> Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).</li><li>Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+retinopathies:+animal+models+and+therapeutic+opportunities.">Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities.</a> Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).</li><li>Cox, T. R., Erler, J. 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S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+a+paradigm+for+balanced+extracellular+proteolysis+during+cell+migration+and+morphogenesis.">Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis.</a> Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).</li><li>Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+tubulogenesis+within+fibrin+gels+specifically+requires+the+activity+of+membrane-type-matrix+metalloproteinases+(MT-MMPs).">Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs).</a> Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).</li><li>Loukovaara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomics+Analysis+of+Vitreous+Humor+from+Diabetic+Retinopathy+Patients.">Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients.</a> Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).</li><li>Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+stem+cell+factor/c-kit+signaling+pathway+components+in+diabetic+fibrovascular+epiretinal+membranes.">Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes.</a> Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).</li><li>Loukovaara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ang-2+upregulation+correlates+with+increased+levels+of+MMP-9,+VEGF,+EPO+and+TGFbeta1+in+diabetic+eyes+undergoing+vitrectomy.">Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy.</a> Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).</li><li>Sugiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA2+cleavage+by+MT1-MMP+triggers+single+cancer+cell+invasion+via+homotypic+cell+repulsion.">EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion.</a> Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).</li><li>Tatti, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP16+Mediates+a+Proteolytic+Switch+to+Promote+Cell-Cell+Adhesion,+Collagen+Alignment,+and+Lymphatic+Invasion+in+Melanoma.">MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma.</a> Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).</li><li>Senger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+framework+for+angiogenesis:+a+complex+web+of+interactions+between+extravasated+plasma+proteins+and+endothelial+cell+proteins+induced+by+angiogenic+cytokines.">Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines.</a> American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).</li><li>Senger, D. R., Davis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis.">Angiogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).</li><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel.">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).</li><li>Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+modeling+macular+degeneration+in+mice.">The challenge of modeling macular degeneration in mice.</a> Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).</li><li>Kim, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cells+from+patient-derived+fibrovascular+membranes+in+proliferative+diabetic+retinopathy.">Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy.</a> Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).</li><li>Avery, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+bevacizumab+(Avastin)+in+the+treatment+of+proliferative+diabetic+retinopathy.">Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy.</a> Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).</li><li>Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+outcomes+of+vitrectomy+with+or+without+intravitreal+bevacizumab+pretreatment+for+severe+diabetic+retinopathy.">A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy.</a> The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).</li><li>Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+safe+and+efficient+method+to+retrieve+mesenchymal+stem+cells+from+three-dimensional+fibrin+gels.">A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).</li></ol>

Considerando l'importanza del microambiente tessuto pertinenti per affidabile e funzionale delle cellule e molecolare risultati meccanicistici, è imperativo trovare appropriati modelli sperimentali che forniscono questo ambiente di tessuto. Descritto nel presente documento ex vivo PDR cultura modello per FTs fibrina-incorporato consente l'indagine dei meccanismi della patofisiologia PDR nel contesto dei campioni clinici PDR nativo, complesso e pluricellulare.
Fasi critiche all'intern...

DR è una grave complicanza oculare del diabete, una malattia che ha raggiunto proporzioni enormi nell'ultimo trent'anni1. Vent'anni dopo la diagnosi, virtualmente tutti i pazienti con diabete di tipo 1 e il 60% dei pazienti con segni presenti di tipo 2 diabete di retinopatia, rendendo diabete per sé uno dei principali cause di cecità in età adulti2di lavoro. Secondo il livello di degenerazione microvascolare e danno ischemico, DR è classificata in DR non proliferativa (non-PDR) e DR proliferative (PDR). La malattia di stadio finale, PDR, è caratterizzata da neovascolarizzazione indotta da ischemia e infiammazione e fibrotiche risposte all'interfaccia vitreo-retinica. In condizioni non trattate, questi processi porterà alla cecità a causa di emorragia del vitreo, fibrosi retinica, distacco di retina trazionale e glaucoma neovascular3,4. Nonostante i recenti progressi, opzioni correnti di trattamento di destinazione solo DR tappe, tra cui edema maculare diabetico e PDR, quando già ne è danno retinico. Inoltre, una grande percentuale di pazienti DR non beneficia attuale armamentario di trattamento, che indica un urgente bisogno di terapie migliori4,5,6.
Più altri iovivo n malattia/modelli di sviluppo e modelli animali diabetici sono stati sviluppati fino ad oggi, ma nessuno di loro ricapitola l'intera gamma di caratteristiche patologiche osservate in human PDR7,8. Inoltre, la prova aumentante indica che le risposte al trattamento siano strettamente collegate nella composizione di ECM come pure la disposizione spaziale e l'interazione tra il microambiente cellulare e acellular9. Abbiamo, quindi, di sviluppare un modello clinicamente rilevante del PDR umano utilizzando materiale patologico FT che comunemente viene asportato da occhi sottoposti a vitrectomia come parte dell'amministrazione chirurgica di PDR10.
Questo manoscritto descrive il protocollo per il 3D ex vivo cultura e caratterizzazione della-asportata chirurgicamente, PDR paziente-derivato patologico FT. Il metodo qui descritto è stato utilizzato in una recente pubblicazione che ha dimostrato il successo decostruzione del nativo 3D paesaggio tessuto PDR e ricapitolazione delle caratteristiche di patofisiologia PDR inclusi angiogenici e fibrotiche risposte di anormale strutture vascolari11. Questo modello ha anche rivelato caratteristiche novelle che non possono essere facilmente apprezzati da sezioni istologiche sottili, come nello spazio limitano di apoptosi e proliferazione nonché vascolare isolotto formazione11. Liquido vitroso è stato utilizzato con successo di altri utenti su culture di sferoide endoteliale 3D per valutare il suo potenziale angiogenico e l'efficacia di angiostatic molecole12. Quando combinato con uno sferoide in vitro delle cellule endoteliali linfatiche 3D (LEC) analisi usando vitroso PDR come stimolante di germogliatura, nostro modello ha rivelato che il contributo di entrambi vitreal solubili fattori spunti anche come locale all'interno del tessuto neovascolare per as ancora capito male LEC coinvolgimento nel PDR patofisiologia3,11. Nella gestione del PDR, chirurgia vitreo-retinica è una procedura di routine eseguita ancora impegnativa. Come tecniche e strumentazioni chirurgiche sono vedendo avanzamento continuo e raffinatezza, rimozione tempestiva e conservatore di fibrovascolare proliferativa esemplare non solo migliora il risultato di visione ma fornisce anche materiale tissutale inestimabile per la indagine di risposte di patofisiologia e trattamento di PDR negli aspetti traslazionali complessi del microenvironment del tessuto umano vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>07.60.03</td>
			<td>Used for handling the FTs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels - Sterile</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0513</td>
			<td>Used for FT dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish, vented, 28 ml (60mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>391-3210</td>
			<td>Used for dissection and for testing fibrin gel formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>392-0049</td>
			<td>Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>391-3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>525-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Used to sterile-filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td>Used to sterile-filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB74031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142475</td>
			<td>Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 96-well, U-bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>392-0019</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round/Flat Spatulas, Stainless Steel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-528</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22x22mm #1</td>
			<td>Menzel/Fisher</td>
			<td>15727582</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Kindler K102</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-0202</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>Used for preparing 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>341578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9394-500ML</td>
			<td>Used for preparing the fibrinogen and TA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Used for preparing the blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td>Aliquoted in -20 &#176;C, thaw before preparing the ex vivo culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate 10mg/ml</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0011-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell media MV Kit</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22120</td>
			<td>Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,&#160; 500 &#956;L of recombinant human epidermal growth factor (10 &#956;g/ mL) and 500 &#956;L of hydrocortisone (1 g/ mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32201-2.5L-M</td>
			<td>Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td>Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, 20mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62249</td>
			<td>For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt Quick-hardening mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03989-100ml</td>
			<td>TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9549-500UN&#160;</td>
			<td>Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 &#176;C, avoid repeated freeze/ thaw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3428</td>
			<td>Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 &#176;C, avoid repeated freeze/ thaw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFA</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td>50 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFC</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>752-VC-025</td>
			<td>200 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TGF&#946;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF346</td>
			<td>1 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>01-106</td>
			<td>50 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (JC70A)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0823</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 (QBEND10)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M716501-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 (2B11+PD7/26)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M070129-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>ImmunoWay</td>
			<td>RLM3161</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved caspase-3 (5A1E)</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>9664</td>
			<td>Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERG (EP111)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M731429-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NCL-Ki67p</td>
			<td>Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyve1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2089</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prox1</td>
			<td>ReliaTech</td>
			<td>102-PA32</td>
			<td>Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prox1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2727</td>
			<td>Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR3 (9D9F9)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3757</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-SMA (1A4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6198</td>
			<td>Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11057</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX9 upright dissection stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For FT dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of whole-mount immunostained FT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of whole-mount immunostained FT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model for fibrovascular complications in proliferative diabetic retinopathy

Retinopatia diabetica (Dott) è la complicazione microvascolare più comune di diabete e una delle principali cause di cecità negli adulti in età lavorativa. Nessuna correnti modelli animali di diabete e retinopatia indotta da ossigeno sviluppano i cambiamenti progressivi full range manifestati in umana retinopatia diabetica proliferative (PDR). Di conseguenza, comprensione della patogenesi della malattia e della patofisiologia si affida in gran parte l'uso di sezioni istologiche e campioni vitrosi negli approcci che forniscono solo informazioni allo steady-state sui fattori patogeni coinvolti. La prova aumentante indica che dinamico cellula-cellula e cellula matrice extracellulare (ECM) interazioni nel contesto di tridimensionale (3D) microambienti sono essenziali per gli studi meccanicistici e funzionali verso lo sviluppo di nuovi strategie di trattamento. Di conseguenza, abbiamo supposto che il tessuto fibrovascolare patologico asportato chirurgicamente da occhi con PDR poteva essere utilizzato per attendibilmente svelare i meccanismi cellulari e molecolari di questa malattia devastante e testare il potenziale per il romanzo clinica interventi. A tal fine, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per 3D ex vivo cultura di asportata chirurgicamente paziente-derivato tessuto fibrovascolare (FT), che servirà come un modello pertinente di fisiopatologia umana di PDR. La FTs sono dissecato in espianti e incorporato nella matrice di fibrina per ex vivo di cultura e 3D di caratterizzazione. Intero-monta immunofluorescenza di FTs nativo e culture End-Point permette un'indagine approfondita della composizione del tessuto e processi multicellulari, evidenziando l'importanza della caratterizzazione di tessuto-livello 3D per scoprire caratteristiche rilevanti di Patofisiologia PDR. Questo modello permetterà la valutazione simultanea di meccanismi molecolari, cellulari/tessuto processi e le risposte al trattamento nel contesto complesso di interazioni dinamiche biochimici e fisici all'interno dell'architettura tissutale PDR e microambiente. Poiché questo modello ricapitola patofisiologia PDR, anche sarà favorevole per il test o lo sviluppo di nuovi trattamenti.

Più profonda comprensione delle proprietà di tessuto fibrovascolare PDR e l'espressione della proteina ha fatto affidamento principalmente sui campioni vitrosi e sottile istologico FT sezioni3,15,16,17. Per sviluppare un metodo per un'indagine approfondita dell'organizzazione del tessuto 3D e pluricellulari processi fisiopatologici del PDR, abbiamo precisato p...

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An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Qui, presentiamo un protocollo per studiare la fisiopatologia della retinopatia diabetica proliferativa utilizzando tessuti paziente-derivato, chirurgicamente asportato, fibrovascolare per coltura di tessuto nativo tridimensionale caratterizzazione ed ex vivo. Questo ex vivo modello di cultura è inoltre favorevole per il test o lo sviluppo di nuovi trattamenti.

Un modello di coltura del tessuto Ex Vivo per fibrovascolare complicazioni nella retinopatia diabetica proliferativa

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

La retinopatia diabetica è la complicanza microvascolare più comune del diabete. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla fisiopatologia della retinopatia diabetica proliferativa della fase finale. Questa tecnica consente la decostruzione del paesaggio tissutale tridimensionale nativo e l'indagine della fisiopatologia tissutale in materiale paziente vivo con rilevanza clinica diretta. Fare riferimento al protocollo di testo per i dettagli sull'intervento chirurgico e sulla strumentazione utilizzata nella dissezione. Per iniziare, posizionare il tessuto fibrovascolare che è stato asportato da soggetti umani sottoposti a chirurgia vitreoretinica di microincisione transcongiuntivale in un piatto di coltura cellulare contenente PBS sterile. Utilizzando un microscopio stereo a dissezione verticale, tagliare il tessuto fibrovascolare in circa un millimetro quadrato. Immergere il tessuto in PBS e tenere il tessuto in posizione con pinzette a micro dissezione. Effettuare tagli chiari nel tessuto con un bisturi sterile facendo attenzione a evitare di strappare il tessuto fibrovascolare. Mettere ogni singolo pezzo di tessuto in un pozzo di una piastra di coltura cellulare di 12 pozzetti contenente un millilitro di PBS sterile. In primo luogo, preparare 25 aliquote microliter di soluzione di fibrinogeno a temperatura ambiente. Posizionare un pezzo di tessuto fibrovascolare al centro del pozzo di una piastra di 24 pozzetti e rimuovere eventuali PBS in eccesso. Aggiungere quindi 25 microlitri di soluzione TA a una delle aliquote fibrinogene preparate. E usando un'altra pipetta impostata su 50 microlitri mescolare con pipettazione. Erogare la miscela sul pezzo di tessuto fibrovascolare e pipetta su e giù per assicurare che il pezzo di tessuto sia contenuto all'interno della goccia. Il tempo di formazione del fibrinogeno critico per la tridimensionalità della coltura ex vivo, viene testato in una goccia vuota che incorpora il tessuto precedente come descritto nel protocollo. Incubare la piastra in un incubatore di coltura cellulare. Dopo 30-60 minuti inclinare la piastra per verificare che il gel di fibrina sia completamente formato. Successivamente, sovrapporre i gel di fibrina del tessuto fibrovascolare con mezzo di coltura ex vivo integrato con aprotinina. Successivamente, restituire le piastre di coltura all'incubatore di coltura cellulare per il periodo di tempo desiderato. In primo luogo, sostituire il mezzo di coltura ex vivo con un millilitro di soluzione di paraformaldeide per pozzo per fissare le colture. Dopo un'ora, sciacquare i gel con tre lavaggi PBS di cinque minuti. Quindi, sostituire il lavaggio PBS con due millilitri di soluzione di azide di sodio per pozzo. Conservare i gel fissi a quattro gradi Celsius.Utilizzare una spatola di bordo squadrata in acciaio inossidabile per sollevare attentamente le goccioline dalla piastra, a partire dai bordi prima di sollevare il centro della goccia. Utilizzando una spatola rotonda bordata trasferire le goccioline in singoli pozzi di una piastra di 12 pozzetti contenente un millilitro di PBS. Successivamente, inclinare la piastra su un supporto e postfissare le goccioline con un millilitro di soluzione di metanolo acetone ghiacciato per un minuto. Quindi, sciacquare con tre o cinque due lavaggi millilitro di PBS. Centrifugare la soluzione di blocco per 15 minuti per rimuovere eventuali detriti. Quindi, inclinare la piastra su un supporto e incubare le goccioline in 500 microlitri di soluzione di blocco per due ore a temperatura ambiente. Preparare la miscela di anticorpi primari secondo il protocollo di testo. Quindi utilizzare una spatola rotonda bordata per trasferire le goccioline su una piastra rotonda inferiore di 96 poggiasto. Incubare le goccioline in 30 microlitri di miscela di anticorpi primari per goccia durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire le goccioline su una piastra di 12 po 'contenente due millilitri di soluzione di lavaggio per pozzo. Risciacquare le goccioline con tre lavaggi di cinque minuti. Quindi, lavare le goccioline con nove lavaggi di 30 minuti. Il giorno seguente, sciacquare le goccioline tre volte con PBS. Preparare l'appropriata miscela di anticorpi secondari coniugati con fluorofore secondo il protocollo di testo. Trasferire le goccioline su una piastra rotonda inferiore di 96 po', come precedentemente dimostrato, e incubare la piastra con 30 microlitri di miscela anticorpale secondaria per quattro ore a temperatura ambiente, protetta dalla luce.Dopo quattro ore, trasferire le goccioline in una piastra di 12 pozza di pozzo contenente due millilitri di soluzione di lavaggio per pozzo. Per prima cosa, sciacquare le goccioline con tre lavaggi di cinque minuti. Quindi, lavare le goccioline con quattro lavaggi di 30 minuti. Il giorno successivo, sciacquare le goccioline cinque volte con la soluzione di lavaggio per 30 minuti e tre volte con PBS per 30 minuti. Il giorno successivo, trasferire le goccioline su una piastra rotonda inferiore di 96 po ', come precedentemente dimostrato. Controsostenere le goccioline con macchia nucleare hoechst per 30 minuti a temperatura ambiente. Trasferire le goccioline su una piastra di 12 po porsi contenente due millilitri di PBS per pozzo e risciacquare tre volte con PBS. Quindi, applicare uno strato stretto di mezzo di montaggio indurente rapido lungo i bordi di un vetro di copertura quadrato e lasciare asciugare per un minuto. Quindi, sciacquare la goccia immergerla in un pozzo di un piatto di 12 po 'contenente acqua deionizzata. E trasferire la goccia su una diapositiva al microscopio. Successivamente, erogare 15 microlitri di mezzo di montaggio anti-dissolvenza non indurente sulla goccia. Posizionare delicatamente il vetro di copertura sopra la goccia con il mezzo di montaggio rivolto verso lo scivolo e lasciarlo depositare. Lasciare asciugare gli scivoli per due ore a temperatura ambiente e conservarli a quattro gradi Celsius durante la notte. Infine, immagini le diapositive con un microscopio a epifluorescenza verticale dotato di una funzione di sessatura ottica con obiettivo 20x o 40x. In questo protocollo il tessuto fibrovascolare è stato preparato e immaginato. I dati rappresentativi hanno dimostrato che le colture ex vivo PDR inducono la germogliazione dell'endotelio positivo CD-31 e la conservazione della vascuola in risposta al VEGFA. Al contrario, TGF

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