Name: an ex vivo tissue culture model for fibrovascular complications in proliferative diabetic retinopathy
Uploaded: 2019-01-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy at JoVE.com

저자는 대부분의 의료 및 외과 망막 동료, 간호사와 당뇨병 단위 및 Vitreoretinal 수술 장치 안 과학의 부, 헬싱키 대학 병원 채용에 적극적으로 참여에서 전체 직원에 감사 환자. 영상 시설에 감사 Biomedicum 분자 이미징 장치 하 고. 우리는 우수한 기술 지원을 위한 아나 체르넨코 감사합니다. 이 연구는 핀란드 아카데미 (KL), 헬싱키의 대학 (KL), Sigrid Juselius 재단 (KL), K. 알 요한슨 재단 (KL), 핀란드 암 연구소 (KL), 카롤 린스 카 Institutet (KL), 핀란드 눈 재단 (SL), 눈에서 교부 금에 의해 지원 되었다 고 조직 은행 재단 (SL), 메리와 게오르그 C. Ehrnrooth 재단 (SL), 및 HUCH 임상 연구 보조금 (TYH2016230, SL 후 TYH2018127), 의학 (예)의 박사 프로그램 뿐 아니라 당뇨병 연구 재단 (SL, kl 기를, AK, EG).

이 연구는 제도적 검토 보드와 헬싱키 대학 병원의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 서명 된 동의 각 환자에서 얻은 했다.
1. 솔루션, 미디어 및 장비 준비
<ol><li>신속한 처리를 보장 하기 위해 fibrovascular 조직 (FT)의 컬렉션에 이전 다음 장비를 준비 합니다.<ol>
<li>멸 균 압력솥 2 서의 핀셋</li>
		<li>1 미리 무게 PBS 태블릿 (0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.010 M 포4-3) 이온된...

<ol>
	<li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li><li>Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-Year+Outcomes+of+Panretinal+Photocoagulation+vs+Intravitreous+Ranibizumab+for+Proliferative+Diabetic+Retinopathy:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).</li><li>Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. 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M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+stem+cell+factor/c-kit+signaling+pathway+components+in+diabetic+fibrovascular+epiretinal+membranes.">Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes.</a> Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).</li><li>Loukovaara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ang-2+upregulation+correlates+with+increased+levels+of+MMP-9,+VEGF,+EPO+and+TGFbeta1+in+diabetic+eyes+undergoing+vitrectomy.">Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy.</a> Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).</li><li>Sugiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA2+cleavage+by+MT1-MMP+triggers+single+cancer+cell+invasion+via+homotypic+cell+repulsion.">EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion.</a> Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).</li><li>Tatti, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP16+Mediates+a+Proteolytic+Switch+to+Promote+Cell-Cell+Adhesion,+Collagen+Alignment,+and+Lymphatic+Invasion+in+Melanoma.">MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma.</a> Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).</li><li>Senger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+framework+for+angiogenesis:+a+complex+web+of+interactions+between+extravasated+plasma+proteins+and+endothelial+cell+proteins+induced+by+angiogenic+cytokines.">Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines.</a> American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).</li><li>Senger, D. R., Davis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis.">Angiogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).</li><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel.">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).</li><li>Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+modeling+macular+degeneration+in+mice.">The challenge of modeling macular degeneration in mice.</a> Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).</li><li>Kim, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cells+from+patient-derived+fibrovascular+membranes+in+proliferative+diabetic+retinopathy.">Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy.</a> Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).</li><li>Avery, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+bevacizumab+(Avastin)+in+the+treatment+of+proliferative+diabetic+retinopathy.">Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy.</a> Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).</li><li>Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+outcomes+of+vitrectomy+with+or+without+intravitreal+bevacizumab+pretreatment+for+severe+diabetic+retinopathy.">A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy.</a> The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).</li><li>Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+safe+and+efficient+method+to+retrieve+mesenchymal+stem+cells+from+three-dimensional+fibrin+gels.">A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).</li></ol>

신뢰할 수 있는 기능 셀 및 분자 기계 결과 대 한 관련 조직 microenvironment의 중요성을 고려 하면이 조직 환경을 제공 하는 적절 한 실험 모델을 찾을 수 필수적입니다. 여기 설명 비보 전 PDR 문화 모델을 섬유 소 포함 FTs PDR 임상 샘플의 네이티브, 복잡 하 고 다세포 컨텍스트에서 PDR 이상의 메커니즘의 조사 수 있습니다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계는 적절 한 섬유 소 ?...

박사는 당뇨병, 지난 3 년간1에서 거 대 한 비율에 도달 했습니다 질병의 심각한 안구 합병증. 20 년 후 일 나이 성인2실명의 원인 진단, 타입-1 당뇨병과 망막 질환, 당뇨병 라기보다 하나의 주요의 만들기의 유형 2 당뇨병 현재 징후와 환자의 60%와 거의 모든 환자. Microvascular 변성 및 허 혈 성 손상의 수준에 따라 박사는 비 증식 박사 (비 PDR) 및 증식 박사 (PDR)으로 분류 됩니다. 말기 질환, PDR, 허 혈 및 염증 유발 neovascularization 및 vitreoretinal 인터페이스에서 거리 응답 특징 이다. 치료 되지 않는 조건에서 이러한 프로세스는 유리 체 출혈, 망막 증, 망막 tractional 및 신생 녹 내장3,4실명 이어질 것입니다. 최근 발전에도 불구 하 고 현재 치료 옵션 대상만 박사 단계, 망막 손상에는 이미 일어 났 죠 때 당뇨 황 반 부 종 및 PDR, 포함 한. 또한, 박사 환자의 큰 비율 현재 치료 armamentarium, 향상 된 치료4,,56에 대 한 긴급 한 필요를 나타내는에서 혜택 하지 않습니다.
다른 여러 나n vivo 질병/개발 모델 및 당뇨병 동물 모델 개발 되었습니다 날짜, 하지만 그들 중 누구도 인간의 PDR7,8관찰 pathologic 기능의 전체 범위. 또한, 증거를 증가 시키는 치료 응답 ECM 구성으로 공간 배열 및 세포질이 고 acellular microenvironment9사이의 상호 작용에 밀접 하 게 연결 되어 있는지 나타냅니다. 우리는, 그러므로, 일반적으로 vitrectomy PDR10의 외과 관리의 일환으로 진행 하는 눈에서 excised 피트 병 적인 소재를 활용 하 여 인간의 PDR의 임상 관련 모델 개발에 착수.
이 원고 vivo 문화 전 3D에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 수술 excised PDR의 환자-파생 된 병 적인 피트. 여기 설명 하는 방법은 네이티브 3D PDR 조직 풍경의 성공적인 해체 하 고 재현 부 PDR 이상 신생 등의 비정상적인 거리 응답의 특징의 최근 간행물에서 사용 되었습니다. 혈관 구조11. 이 모델은 또한 소설 기능 수 없습니다 쉽게 평가 될 얇은 조직학 섹션에서와 같은 공간을 국한 apoptosis와 확산 뿐만 아니라 혈관 섬 형성11을 공개 했다. 유리 같은 액체는 성공적으로 사용 되었습니다 다른 사람에 의해 3D 내 피 회전 타원 체 문화는 신생 잠재력을 평가 하 고 angiostatic 분자12의 효능에. 생체 외에서 3D 림프 내 피 세포 (LEC) 회전 타원 체 흥분 제 PDR 유리를 사용 하 여 분석 결과 돋 아와 결합 하면, 우리의 모델 두 성 vitreal의 기여 요인 as에 신생 조직 내에서 뿐만 아니라 로컬 단서 공개 아직 불완전 하 게 이해 LEC 참여 PDR 이상3,11. PDR의 관리에 vitreoretinal 수술 정기적으로 수행이 아직 어려운 절차 이다. 수술 기기 및 기술을 볼 수 있습니다 지속적인 발전과 세련, fibrovascular 증식 견본의 보수와 적시 제거 뿐만 아니라 비전 결과 향상 하지만 또한 귀중 한 조직에 대 한 자료를 제공 합니다 살아있는 인간의 조직 microenvironment의 복잡 한 변환 측면에서 PDR 이상과 치료 응답의 조사.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>07.60.03</td>
			<td>Used for handling the FTs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels - Sterile</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0513</td>
			<td>Used for FT dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish, vented, 28 ml (60mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>391-3210</td>
			<td>Used for dissection and for testing fibrin gel formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>392-0049</td>
			<td>Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>391-3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>525-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Used to sterile-filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td>Used to sterile-filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB74031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142475</td>
			<td>Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 96-well, U-bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>392-0019</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round/Flat Spatulas, Stainless Steel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-528</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22x22mm #1</td>
			<td>Menzel/Fisher</td>
			<td>15727582</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Kindler K102</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-0202</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>Used for preparing 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>341578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9394-500ML</td>
			<td>Used for preparing the fibrinogen and TA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Used for preparing the blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td>Aliquoted in -20 &#176;C, thaw before preparing the ex vivo culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate 10mg/ml</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0011-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell media MV Kit</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22120</td>
			<td>Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,&#160; 500 &#956;L of recombinant human epidermal growth factor (10 &#956;g/ mL) and 500 &#956;L of hydrocortisone (1 g/ mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32201-2.5L-M</td>
			<td>Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td>Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, 20mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62249</td>
			<td>For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt Quick-hardening mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03989-100ml</td>
			<td>TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9549-500UN&#160;</td>
			<td>Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 &#176;C, avoid repeated freeze/ thaw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3428</td>
			<td>Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 &#176;C, avoid repeated freeze/ thaw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFA</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td>50 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFC</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>752-VC-025</td>
			<td>200 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TGF&#946;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF346</td>
			<td>1 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>01-106</td>
			<td>50 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (JC70A)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0823</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 (QBEND10)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M716501-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 (2B11+PD7/26)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M070129-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>ImmunoWay</td>
			<td>RLM3161</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved caspase-3 (5A1E)</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>9664</td>
			<td>Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERG (EP111)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M731429-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NCL-Ki67p</td>
			<td>Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyve1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2089</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prox1</td>
			<td>ReliaTech</td>
			<td>102-PA32</td>
			<td>Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prox1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2727</td>
			<td>Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR3 (9D9F9)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3757</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-SMA (1A4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6198</td>
			<td>Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11057</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX9 upright dissection stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For FT dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of whole-mount immunostained FT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of whole-mount immunostained FT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model for fibrovascular complications in proliferative diabetic retinopathy

당뇨병 성 망막 증 (DR)은 당뇨병의 가장 일반적인 microvascular 합병증 그리고 최고의 중 하나 일 나이 성인 실명의 원인. 당뇨병과 산소 유도 된 망막의 없음 현재 동물 모델 개발 인간의 증식 당뇨 성 망막 증 (PDR)에 전체 범위의 진보적인 변화. 따라서, 질병의 병 인 및 병 태 생리학의 이해 조직학 단면도 유리 샘플만 포함 된 병원 성 요인에 정상 상태 정보를 제공 하는 방식에서의 사용에 크게 의존 했다. 증거를 증가 나타냅니다 동적 셀 및 3 차원 (3D) microenvironments의 맥락에서 세포-세포 외 기질 (ECM) 상호 작용의 개발 쪽으로 기계 및 기능 연구에 대 한 필수적인 새로운 치료 전략입니다. 따라서, 우리는 안정적으로이 치명적인 질병의 세포 및 분자 메커니즘을 해명 소설 임상에 대 한 가능성을 테스트 하 고 병 적인 fibrovascular 조직 수술 PDR와 눈에서 excised 활용할 수 가설 개입입니다. 이 끝 우리 수술 excised 환자 파생 fibrovascular 조직 (FT), 인간의 PDR 이상의 관련 모델 될 것입니다의 비보 문화 전 3D에 대 한 새로운 방법을 개발. FTs는 explants로 해 부하 고 ex vivo 문화 및 3D 특성에 대 한 섬유 소 매트릭스에 포함 된. 네이티브 FTs 및 끝점 문화 전체 마운트 면역 형광 수 조직 구성과의 잠복 관련 기능에 대 한 3 차원 조직 수준 특성의 중요성을 강조 하는 다세포 프로세스의 철저 한 조사 PDR 이상입니다. 이 모델은 동적 PDR 조직 아키텍처와 microenvironment 내 생 화 학적 및 물리적 상호 작용의 복잡 한 맥락에서 분자 메커니즘, 세포/조직 프로세스 및 치료 응답의 동시 평가 허용할 것 이다. 이후이 모델이 PDR 이상, 그것은 또한 새로운 치료법을 개발 또는 테스트에 대 한 의무가 있을 것입니다.

PDR fibrovascular 조직 속성 및 단백질 식의 이해 유리 샘플 및 얇은 조직학 피트 섹션3,15,,1617에 주로 의존 하고있다. 방법을 개발 3D 조직 조직의 철저 한 조사와 PDR의 다세포 physiopathological 프로세스에 대 한 밖으로 설정 우리 수술 삭제, 활용 하 하 환자-파생 병 적인 FTs 3D 특성화 ...

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An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

여기, 우리는 3 차원 기본 조직 특성화 및 전 비보 문화에 대 한 환자 파생, 수술 excised, fibrovascular 직물을 사용 하 여 증식 성 당뇨 망막 증의 병 태 생리학을 공부 하는 프로토콜을 제시. Ex vivo 문화 모델이 테스트 또는 새로운 치료법 개발에 대 한 의무가 이기도 합니다.

증식 성 당뇨 망막 증에 Fibrovascular 합병증에 대 한 전 비보 조직 문화 모델

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

당뇨병 망막증은 당뇨병의 일반적인 미세 혈관 합병증입니다. 이 방법은 말기 질병 증식 성 당뇨병 망막증의 병리학에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 직접 임상 관련성을 가진 살아있는 환자 물질에서 네이티브 3차원 조직 경관및 조직 병리학의 조사를 할 수 있습니다. 해부에 활용된 수술 및 계측에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 우선, 멸균 PBS를 포함하는 세포 배양 접시에 간경련 미세 절개 유리석 수술을 받은 인간 과목에서 절제된 섬유혈관 조직을 배치하십시오. 직립 해부 스테레오 현미경을 사용하여 섬유 혈관 조직을 약 1 평방 밀리미터 조각으로 자른다. PBS에 있는 조직을 잠그고 마이크로 해부 핀셋으로 제자리에 조직을 붙입니다. 섬유혈관 조직을 찢는 것을 피하기 위해 돌봐 멸균 메스와 조직에 명확한 상처를 확인합니다. 멸균 PBS의 1 밀리리터를 포함하는 12 잘 세포 배양 판의 우물에 조직의 각 개별 조각을 놓는다. 먼저 실온에서 피브리노겐 용액의 25마이크로리터 알리쿼트를 준비한다. 24 웰 플레이트의 우물 중앙에 섬유 혈관 조직의 한 조각을 배치하고 초과 PBS를 제거합니다. 다음으로, 준비된 피브리노겐 알리쿼트 중 하나에 TA 용액 25마이크로리터를 추가합니다. 그리고 파이펫팅에 의해 50 마이크로 리터 믹스로 설정 된 다른 파이펫을 사용. 섬유혈관 조직 및 파이펫의 조각에 혼합물을 분배하여 조직 조각이 액적 내에 포함되어 있는지 확인합니다. 전 생체 배양의 3차원에 중요한 피브리뇨겐 형성의 시간은 프로토콜에 기재된 바와 같이 빈 액적 선행 조직 포함에서 시험된다. 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다. 30-60분 후에 플레이트를 기울여 피브린 젤이 완전히 형성되어 있는지 확인합니다. 다음으로, 아프로틴으로 보충된 전 생체 배양 배지와 섬유혈관 조직 피브린 젤을 오버레이한다. 그 후, 배양판을 원하는 기간 동안 세포 배양 배양 인큐베이터로 되돌려 주세요. 먼저, 전 생체 배양 배지를 파라포름알데히드 용액의 1밀리리터로 교체하여 배양을 수정한다. 1시간 후, 젤을 5분 PBS 세워로 헹구는 다. 다음으로 PBS 워시를 양당 2밀리리터의 나트륨 아지드 용액으로 교체하십시오. 고정 젤을 섭씨 4도에 보관하십시오.스테인레스 스틸 제곱 가장자리 주걱을 사용하여 물방울의 중심을 들어 올리기 전에 가장자리에서 시작하여 플레이트에서 물방울을 조심스럽게 들어 올립니다. 둥근 날카로운 주걱을 사용하여 PBS의 1 밀리리터를 포함하는 12 웰 플레이트의 개별 우물로 방울을 전송합니다. 그 후, 접시를 지지에 기울이고 1분 동안 얼음차가운 아세톤 메탄올 용액 1밀리리터로 방울을 포스트픽합니다. 그런 다음 PBS의 3~5밀리리터 세시로 헹구습니다. 15분 동안 블로킹 용액을 원심분리하여 이물질을 제거합니다. 그런 다음, 지지에 접시를 기울이고 실온에서 2 시간 동안 차단 용액의 500 마이크로 리터에 물방울을 배양. 텍스트 프로토콜에 따라 1차 항체 혼합물을 준비한다. 그런 다음 둥근 가장자리 주걱을 사용하여 물방울을 라운드 하단 96 웰 플레이트로 전송합니다. 4섭씨에서 하룻밤 동안 액적당 1차 항체 혼합물30 마이크로리터에 액적을 배양한다. 다음 날, 잘 당 세척 용액의 두 밀리리터를 포함하는 12 웰 플레이트에 방울을 전송합니다. 3개의 5분 세차재로 물방울을 헹구는 다. 그런 다음 9 개의 30 분 세척으로 물방울을 씻으시면 됩니다. 다음 날 PBS로 물방울을 세 번 헹구는 다. 텍스트 프로토콜에 따라 적절한 불소-공액이 있는 이차 항체 혼합물을 준비한다. 이전에 입증된 바와 같이, 원형 하단 96 웰 플레이트로 액적을 옮기고, 실내 온도에서 4시간 동안 30마이크로리터의 이차 항체 혼합물로 플레이트를 배양하여 빛으로부터 보호한다.4시간 후, 방울을 12개의 웰 플레이트로 옮기면 2밀리리터의 세정용액을 잘 들어 보입니다. 먼저, 3개의 5분 세정으로 물방울을 헹구는 다. 그런 다음 4 개의 30 분 세척으로 물방울을 씻으시면 됩니다. 다음 날, 30 분 동안 세척 용액으로 물방울을 5 번 헹구고 PBS로 30 분 동안 3 번 헹구습니다. 다음 날, 이전에 설명한 대로, 라운드 하단 96 웰 플레이트로 방울을 전송합니다. 상온에서 30분 동안 Hoechst 핵 얼룩으로 물방울을 카운터스테인하십시오. 액적을 12개의 웰 플레이트로 옮기고, PBS당 PBS 2밀리리터를 함유하고 PBS로 세 번 헹구는다. 다음으로, 사각형 커버 유리의 가장자리를 따라 빠른 경화 장착 매체의 좁은 층을 적용하고 1 분 동안 건조 할 수 있습니다. 그런 다음, 탈온화 된 물을 포함하는 12 웰 플레이트의 우물에 찍어 방울을 헹구십시오. 그리고 현미경 슬라이드로 액적을 전송합니다. 다음으로, 비경화 방지 장착 배지의 15 마이크로리터를 액적에 분배합니다. 커버 유리를 물방울 위에 부드럽게 놓고 슬라이드를 향한 마운팅 미디엄을 넣고 정착시키십시오. 실온에서 2시간 동안 슬라이드를 건조시키고 밤새 섭씨 4도에 보관하십시오. 마지막으로, 20배 또는 40배 의 목표에서 광학 단면 기능을 갖춘 수직 성피 현미경으로 슬라이드를 이미지합니다. 이 프로토콜에서 섬유혈관 조직은 제조 및 이미지화되었다. 대표적인 데이터는 PDR ex 생체권 배양물이 VEGFA에 대응하여 CD-31 양성 내피 및 혈관 보존의 발아를 유도하는 것으로 나타났다. 반대로, TGF

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

환자 조직 및 유전자 전달의 시험 전의 VIVO 문화

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

연구

의학

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic 바이러스 살아있는 조직의 전의 VIVO 감염

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

<em&gt; 생체 내</em&gt; 모델은 인간의 유방암에서 호르몬 행동을 연구하기 위해

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

인간의 Dupuytren의<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 근섬유 아세포의 연구와 세포 외 기질 상호 작용에 대한 문화

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

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생성 및 당뇨병 치유 하는 부상을 모델에서 줄기 세포 지방이 많은 파생 (ASC) 시트의 이식

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

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유 방 우유 Enteroids의 성장을 강화: 세포 증식의 Ex Vivo 모델

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

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플라즈마 응고는 큰 동물 모델에서 에서 Vivo에서 간 조직에의 평가

Plasma coagulation as a form of electrocautery is used in liver surgery for decades to seal the large liver cut surface after major hepatectomy to prevent ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

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Ex Vivo Normothermic 간 관류의 작은 동물 모델

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

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Ex Vivo 막 기관 문화 모델에 대 한 상처 치유 연구

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

당뇨병 토끼에서의 뒷 사지의 전 임상 모델

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...