Name: an ex vivo tissue culture model for fibrovascular complications in proliferative diabetic retinopathy
Uploaded: 2019-01-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy at JoVE.com

Авторы признательны коллег медицинских и хирургических сетчатки, медсестер и весь персонал диабетической группы и витреоретинальной хирургии группы на отделение офтальмологии больницы университета Хельсинки за активное участие в вербовке пациентов. Мы благодарим Biomedicum молекулярной визуализации подразделение для визуализации объектов. Мы благодарим Анастасия Черненко за отличную техническую помощь. Это исследование было поддержано грантов от Академии Финляндии (KL), Университет Хельсинки (KL), Сигрид Juselius Foundation (KL), Фонд Йоханссон K. Альбин (KL), Финский институт рака (KL), Karolinska Institutet (KL), Финский фонд глаз (SL), глаз и Фонд банка тканей (SL), Мэри и Георг C. Эрнруутов фонд (SL) и HUCH клинических исследовательских грантов (TYH2018127 после TYH2016230, SL), фонд исследования диабета (SL, KL, AK, например), а также докторскую программу в биомедицине (EG).

Это исследование было одобрено институциональных Наблюдательный Совет и этического Комитета больницы университета Хельсинки. Подписанный информированное согласие было получено от каждого пациента.
1. Подготовка решений, средств массовой информации и оборудования
<ol>...

<ol>
	<li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li><li>Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+Review:+Changes+in+the+Incidence+of+and+Progression+to+Proliferative+and+Sight-Threatening+Diabetic+Retinopathy+Over+the+Last+30+Years.">Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years.</a> Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).</li><li>Loukovaara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indications+of+lymphatic+endothelial+differentiation+and+endothelial+progenitor+cell+activation+in+the+pathology+of+proliferative+diabetic+retinopathy.">Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy.</a> Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).</li><li>Stitt, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progress+in+understanding+and+treatment+of+diabetic+retinopathy.">The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).</li><li>Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+current+understanding,+mechanisms,+and+treatment+strategies.">Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies.</a> JCI Insight. 2 (14), (2017).</li><li>Gross, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-Year+Outcomes+of+Panretinal+Photocoagulation+vs+Intravitreous+Ranibizumab+for+Proliferative+Diabetic+Retinopathy:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).</li><li>Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+animal+models+of+diabetic+retinopathy:+from+molecular+approaches+to+mice+and+higher+mammals.">Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals.</a> Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).</li><li>Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+retinopathies:+animal+models+and+therapeutic+opportunities.">Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities.</a> Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).</li><li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix:+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer.">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).</li><li>Sharma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+treatment+for+diabetic+vitreoretinal+diseases:+a+review.">Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review.</a> Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).</li><li>Gucciardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+of+proliferative+diabetic+retinopathy+supports+lymphatic+neovascularization.">The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization.</a> The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+endothelial+cell+spheroid/human+vitreous+humor+assay+for+the+characterization+of+anti-angiogenic+inhibitors+for+the+treatment+of+proliferative+diabetic+retinopathy.">3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy.</a> Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).</li><li>Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+a+paradigm+for+balanced+extracellular+proteolysis+during+cell+migration+and+morphogenesis.">Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis.</a> Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).</li><li>Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+tubulogenesis+within+fibrin+gels+specifically+requires+the+activity+of+membrane-type-matrix+metalloproteinases+(MT-MMPs).">Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs).</a> Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).</li><li>Loukovaara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomics+Analysis+of+Vitreous+Humor+from+Diabetic+Retinopathy+Patients.">Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients.</a> Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).</li><li>Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+stem+cell+factor/c-kit+signaling+pathway+components+in+diabetic+fibrovascular+epiretinal+membranes.">Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes.</a> Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).</li><li>Loukovaara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ang-2+upregulation+correlates+with+increased+levels+of+MMP-9,+VEGF,+EPO+and+TGFbeta1+in+diabetic+eyes+undergoing+vitrectomy.">Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy.</a> Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).</li><li>Sugiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA2+cleavage+by+MT1-MMP+triggers+single+cancer+cell+invasion+via+homotypic+cell+repulsion.">EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion.</a> Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).</li><li>Tatti, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP16+Mediates+a+Proteolytic+Switch+to+Promote+Cell-Cell+Adhesion,+Collagen+Alignment,+and+Lymphatic+Invasion+in+Melanoma.">MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma.</a> Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).</li><li>Senger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+framework+for+angiogenesis:+a+complex+web+of+interactions+between+extravasated+plasma+proteins+and+endothelial+cell+proteins+induced+by+angiogenic+cytokines.">Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines.</a> American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).</li><li>Senger, D. R., Davis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis.">Angiogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).</li><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel.">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).</li><li>Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+modeling+macular+degeneration+in+mice.">The challenge of modeling macular degeneration in mice.</a> Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).</li><li>Kim, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cells+from+patient-derived+fibrovascular+membranes+in+proliferative+diabetic+retinopathy.">Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy.</a> Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).</li><li>Avery, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+bevacizumab+(Avastin)+in+the+treatment+of+proliferative+diabetic+retinopathy.">Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy.</a> Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).</li><li>Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+outcomes+of+vitrectomy+with+or+without+intravitreal+bevacizumab+pretreatment+for+severe+diabetic+retinopathy.">A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy.</a> The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).</li><li>Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+safe+and+efficient+method+to+retrieve+mesenchymal+stem+cells+from+three-dimensional+fibrin+gels.">A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).</li></ol>

С учетом важности соответствующих тканей микроокружение для надежных функциональных клеток и молекулярные механистический результаты необходимо найти соответствующие экспериментальные модели, которые предоставляют этот ткани окружающей среды. Здесь описаны ex vivo PDR культуры м?...

Д-р является серьезным глазной осложнение диабета, болезни, которая достигла огромных масштабов в последние три десятилетия1. Спустя двадцать лет после диагноза, практически каждый пациент с сахарным диабетом типа 1 и 60% больных с типа 2 диабет настоящее признаки ретинопатии, делая диабет само по себе одной из ведущих причин слепоты в работе возраст взрослых2. По уровню микрососудистой дегенерация и ишемического повреждения DR подразделяется на не Пролиферативная DR (не Фунтовую) и пролиферативной DR (НДР). Терминальная стадия заболевания, НДР, характеризуется ишемии и воспаления индуцированной неоваскуляризации и фиброзных ответы на интерфейсе витреоретинальной. В необработанной условий эти процессы будут привести к слепоте вследствие кровоизлияния в стекловидное тело, сетчатки фиброза, тяговых отслойка и Неоваскулярная Глаукома3,4. Несмотря на недавние успехи текущие варианты лечения нацелены только DR этапов, включая диабетического макулярного отека и PDR, когда повреждения сетчатки уже последовало. Кроме того значительная доля пациентов доктора не воспользоваться текущей арсенале лечения, указывающее настоятельную необходимость улучшения лечения4,5,6.
Несколько других яn vivo болезни/развития и диабетической животных модели были разработаны на сегодняшний день, но никто из них не повторяет весь спектр патологических функций наблюдается в человека PDR7,,8. Кроме того все больше фактов указывает, что лечение ответы тесно связаны с состав ECM, а также пространственное расположение и взаимодействие между сотовой и ацеллюлярной микроокружения9. Мы, таким образом, изложенных разработать клинически значимых модель человека НДР, используя FT патологического материала, который обычно иссечена от глаз, претерпевает Витрэктомия частью хирургическое лечение PDR10.
Эта рукопись описывает протокол для 3D ex vivo культуры и характеристика хирургически подакцизным, НДР пациента производные патологических FT. Метод, описанный здесь был использован в недавней публикацией, которая продемонстрировала успешных деконструкции родной 3D пейзаж ткани НДР и резюме особенностей PDR патофизиологии, включая ангиогенных и фиброзных ответы ненормальное 11сосудистых структур. Эта модель также показал новые возможности, которые не могут быть оценены легко от гистологической шлифов, такие как пространственно ограничивается апоптоз и распространения, а также формирование сосудистой островок11. На 3D эндотелиальной сфероида культур для оценки его ангиогенных потенциал и эффективность ангиостатический молекул12стекловидного тела жидкость успешно использовался другими. В сочетании с в vitro 3D лимфатический эндотелиальных клеток (LEC) сфероида прорастания анализа с использованием PDR стекловидного тела как стимулятор, наша модель показало, что вклад обоих растворимых vitreal факторы, а также местные сигналы в пределах неоваскулярной ткани, как пока плохо понимали LEC участие в ЛНДР патофизиологии3,11. В управлении НДР витреоретинальная хирургия является регулярно осуществляется еще сложной процедурой. Как хирургические контрольно-измерительных приборов и методов наблюдаем непрерывное улучшение и изысканность, своевременной и консервативные удаления сортопопуляциях пролиферативной образца не только улучшает видение результатов, но также обеспечивает неоценимую ткани материал для расследование PDR патофизиологии и лечения ответов в сложных переводческих аспектах микроокружения живой ткани человека.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>07.60.03</td>
			<td>Used for handling the FTs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels - Sterile</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0513</td>
			<td>Used for FT dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish, vented, 28 ml (60mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>391-3210</td>
			<td>Used for dissection and for testing fibrin gel formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>392-0049</td>
			<td>Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>391-3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>525-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Used to sterile-filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td>Used to sterile-filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB74031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142475</td>
			<td>Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 96-well, U-bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>392-0019</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round/Flat Spatulas, Stainless Steel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-528</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22x22mm #1</td>
			<td>Menzel/Fisher</td>
			<td>15727582</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Kindler K102</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-0202</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>Used for preparing 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>341578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9394-500ML</td>
			<td>Used for preparing the fibrinogen and TA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Used for preparing the blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td>Aliquoted in -20 &#176;C, thaw before preparing the ex vivo culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate 10mg/ml</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0011-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell media MV Kit</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22120</td>
			<td>Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,&#160; 500 &#956;L of recombinant human epidermal growth factor (10 &#956;g/ mL) and 500 &#956;L of hydrocortisone (1 g/ mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32201-2.5L-M</td>
			<td>Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td>Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, 20mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62249</td>
			<td>For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt Quick-hardening mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03989-100ml</td>
			<td>TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9549-500UN&#160;</td>
			<td>Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 &#176;C, avoid repeated freeze/ thaw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3428</td>
			<td>Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 &#176;C, avoid repeated freeze/ thaw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFA</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td>50 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFC</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>752-VC-025</td>
			<td>200 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TGF&#946;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF346</td>
			<td>1 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>01-106</td>
			<td>50 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (JC70A)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0823</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 (QBEND10)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M716501-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 (2B11+PD7/26)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M070129-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>ImmunoWay</td>
			<td>RLM3161</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved caspase-3 (5A1E)</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>9664</td>
			<td>Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERG (EP111)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M731429-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NCL-Ki67p</td>
			<td>Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyve1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2089</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prox1</td>
			<td>ReliaTech</td>
			<td>102-PA32</td>
			<td>Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prox1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2727</td>
			<td>Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR3 (9D9F9)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3757</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-SMA (1A4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6198</td>
			<td>Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11057</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX9 upright dissection stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For FT dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of whole-mount immunostained FT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of whole-mount immunostained FT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model for fibrovascular complications in proliferative diabetic retinopathy

Диабетическая ретинопатия (DR) является наиболее распространенным осложнением микрососудистой диабета и одной из ведущих причин слепоты в взрослых трудоспособного возраста. Нет текущего животных моделей диабета и кислорода индуцированной ретинопатии разработать полный спектр прогрессивные изменения, проявляющиеся в человека пролиферативной диабетической ретинопатии (PDR). Таким образом понимание патогенеза заболевания и патофизиологии опиралась главным образом на использование Гистологические срезы и стекловидного тела образцов в подходах, которые только предоставляют установившегося информацию о связанных патогенных факторов. Все больше фактов указывает, что динамических клеток и клеток внеклеточного матрикса (ECM) взаимодействия в контексте трехмерной (3D) микросреды важны для механистическим и функциональных исследований по созданию новых стратегии лечения. Таким образом мы предположили, что патологические сортопопуляциях ткани, хирургического иссечена от глаз с НДР может использоваться надежно разгадать молекулярных и клеточных механизмов этой разрушительной болезни и проверить потенциал для Роман клинических вмешательства. С этой целью мы разработали новый метод для 3D ex vivo культуры хирургического иссечена пациента производные сортопопуляциях ткани (FT), который будет служить соответствующей модели человеческого PDR патофизиологии. ФНС расчлененный в эксплантов и встроенных в фибрин матрицы для ex vivo культуры и 3D характеристики. Целом гора иммунофлюоресценции родной ПТС и концевой культур позволяет тщательное расследование состав ткани и многоклеточных процессов, подчеркнув важность 3D ткани уровень квалификации для выявления соответствующих функций Патофизиология PDR. Эта модель позволит одновременно оценки молекулярных механизмов, процессов сотовых/ткани и лечения ответы в контексте сложных динамических биохимические и физические взаимодействия в рамках архитектуры ткани НДР и микроокружения. Поскольку эта модель резюмирует PDR патофизиологии, она будет также поддаются для тестирования или разработки новых методов лечения.

Более глубокое понимание свойств сортопопуляциях ткани НДР и выражения протеина опиралась главным образом на стекловидном образцов и тонких гистологические FT секции3,15,16,17. Разработать метод для т?...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy at JoVE.com

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Здесь мы представляем протокол для изучения патофизиологии пролиферативной диабетической ретинопатии, используя пациента производные, хирургического иссечена, сортопопуляциях тканей для трехмерных родной ткани характеристика и ex vivo культуры. Ex vivo культуры модель это также подходит для тестирования или разработки новых методов лечения.

Культура ткани модель Ex Vivo сортопопуляциях осложнений в пролиферативной диабетической ретинопатии

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Диабетическая ретинопатия является наиболее распространенным микрососудистым осложнением диабета. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы по патофизиологии конечной стадии заболевания пролиферативной диабетической ретинопатии. Этот метод позволяет деконструкции родной трехмерной ткани пейзаж и исследование патофизиологии тканей в живом материале пациента с прямой клинической значимости. Обратитесь к тексту протокола для получения подробной информации об операции и приборов, используемых в вскрытии. Для начала поместите фиброваскулярную ткань, которая была вырезана из человека, переживающий трансконъюнктивальную микроинцизию стекловидной хирургии, в блюдо клеточной культуры, содержащее стерильный PBS. Используя стерео микроскоп вертикального вскрытия, разрежьте фиброваскулярную ткань примерно на один квадратный миллиметр. Погрузите ткань в PBS и удерживайте ткань на месте с микро препарации пинцетом. Сделайте четкие порезы в ткани с стерильным скальпелем, заботясь, чтобы избежать разрыва фиброзкулярной ткани. Поместите каждый отдельный кусок ткани в колодец из 12 хорошо клеточной культуры пластины, содержащей один миллилитр стерильных PBS. Во-первых, подготовить 25 микролитров алицитов раствора фибриногена при комнатной температуре. Поместите один кусок фиброваскулярной ткани в центре колодец 24 хорошо пластины и удалить излишки PBS. Затем добавьте 25 микролитров раствора TA в одну из подготовленных фибриногенных алицитов. И с помощью другой пипетки набор для 50 микролитров смеси по трубопроводу. Обойти смесь на кусок фиброваскулярной ткани и пипетки вверх и вниз, чтобы застраховать часть ткани содержится в капле. Время формирования фибриногена, критическое для трехмерности культуры ex vivo, тестируется в пустой капле, предшествующей встраиванию тканей, как описано в протоколе. Инкубировать пластину в инкубаторе клеточной культуры. Через 30-60 минут наклоните пластину, чтобы проверить, что фибрин гель полностью сформирован. Далее, наложение фиброваскулярной ткани фибринов гели с ex vivo культуры среды дополняется апротинина. После этого верните культурные пластины в инкубатор клеточной культуры на желаемый период времени. Во-первых, заменить ex vivo культуры среды с одним миллилитр параформальдегида решение за хорошо, чтобы исправить культур. Через час, промыть гели с тремя пятиминутными PBS моет. Затем замените промывку PBS двумя миллилитров раствора азида натрия на колодец. Храните фиксированные гели при четырех градусах Celsius.Use шпателем из нержавеющей стали в квадрате края, чтобы поднять капли из пластины тщательно, начиная с краев, прежде чем поднять центр капли. Используя круглый краями шпатель передачи капель в отдельных скважин 12 хорошо пластины, содержащей один миллилитр PBS. После этого наклоните пластину на опору и постфиксйте капли одним миллилитром ледяного раствора метанола ацетона в течение одной минуты. Затем, промыть с трех до пяти двух миллилитров моет PBS. Центрифуга блокирующего раствора в течение 15 минут, чтобы удалить любые обломки. Затем наклоните пластину на опору и инкубировать капли в 500 микролитров блокирующего раствора в течение двух часов при комнатной температуре. Подготовка первичной смеси антител в соответствии с текстовым протоколом. Затем используйте круглый шпатель краями для передачи капель на круглую нижнюю пластину 96 хорошо. Инкубировать капли в 30 микролитров первичной смеси антител на каплю в одночасье при четырех градусах по Цельсию. На следующий день перенесите капли на 12 хорошо пластин, содержащих два миллилитров стирального раствора на колодец. Промыть капли тремя пятиминутными стирками. Затем промойте капли девятью 30-минутными стирками. На следующий день, промыть капли три раза с PBS. Подготовка соответствующей флюорофор-конъюгированных вторичных антител смеси в соответствии с текстовым протоколом. Перенесите капли на круглую нижнюю пластину 96 хорошо, как было поменьше продемонстрировано, и инкубировать пластину 30 микролитров вторичной смеси антител в течение четырех часов при комнатной температуре, защищенной от света.Через четыре часа перенесите капли на 12 хорошо пластин, содержащих два миллилитров раствора для мытья на колодец. Во-первых, промыть капли с трех пятиминутных моет. Затем промойте капли четырьмя 30-минутными стирками. На следующий день, промыть капли пять раз с раствором для мытья в течение 30 минут, и три раза с PBS в течение 30 минут. На следующий день перенесите капельки на круглую нижнюю пластину 96 хорошо, как это было ранее продемонстрировано. Counterstain капли с Hoechst ядерного пятна в течение 30 минут при комнатной температуре. Передача капель на 12 хорошо пластины, содержащей два миллилитров PBS на колодец и промыть три раза с PBS. Затем нанесите узкий слой быстрой затвердевания монтажной среды по краям квадратного стекла крышки и дайте ему высохнуть в течение одной минуты. Затем промыть капельку, окунув ее в колодец из 12 хорошо пластины, содержащей деионизированной воды. И перенесите капельку на слайд микроскопа. Далее, обойтись 15 микролитров не-затвердевания анти-увядание монтажа среды на капельу. Аккуратно распоистите крышку стекла над каплей с монтажной средой, обращенной к слайду, и дайте ему осесть. Пусть слайды высохнут в течение двух часов при комнатной температуре и хранить их при четырех градусах по Цельсию на ночь. Наконец, изображение слайдов с вертикально эпифлюоресценции микроскоп оснащен оптической функции секции на 20x или 40x цели. В этом протоколе была подготовлена и изображена фиброваскулярная ткань. Репрезентативные данные показали, что культуры PDR ex vivo вызывают прорастание CD-31 положительного эндотелия и сосудосужного сохранения в ответ на VEGFA. И наоборот, TGF

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

Экс Vivo культуры тканей пациента и изучение генов доставки

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Экс Vivo Заражение живой ткани с онколитических Вирусы

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

<em&gt; Экс естественных</em&gt; Модель для изучения действия гормонов в груди человека

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Человек Дюпюитрена<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Культура по изучению Миофибробласты и внеклеточный матрикс взаимодействий

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Создание и пересадку жировой производные стволовых клеток (ASC) листа в диабетической заживление модели

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Грудное молоко способствует росту Enteroids: модель Ex Vivo пролиферации клеток

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Оценка плазменной коагуляции на ткани печени в большой модели на животных в естественных условиях

Plasma coagulation as a form of electrocautery is used in liver surgery for decades to seal the large liver cut surface after major hepatectomy to prevent ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Мелких животных модель Ex Vivo нормотермических печени перфузии

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo роговицы орган культуры модель для заживления ран исследований

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Доклиническая модель иабеза Хинд конечностей у диабетических кроликов

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...